霸王鞭内生真菌Fusarium sp.DCJ-A发酵物的次生代谢产物研究.pdf

内生菌一词由 在1866年首次提出并引用 每种植物内部都有一种或多种内生菌，内生菌作为一种微生物在活植物组织内部生长和繁殖不会对寄主植物的生长造成负面影响 内生菌包括内生真菌、内生细菌和放线菌，其中内生真菌用途广泛、分布广泛，几乎在所有地理气候条件下生长的植物中都存在，包括北极和南极 、地热土壤 、沙漠 、海洋 、红树林及沿海 等地区的植物中均有分布 内生真菌在植物组织内生长的期间与寄主植物建立了相互依存共生互惠的关系 植物内生真菌分布的广泛性和与植物的依存关系，造就了其生存环境的独特性，从而使内生真菌具有独特的代谢机制，使其往往可以产生结构丰富的次生代谢产物 从植物内生真菌次生代谢产物中分离出具有生物活性的化合物用于人类健康医疗事业具有很广阔的研究空间，在过去的几年间约有 多种次生代谢产物被分离出并证明其潜在的药用价值 很多内生菌能产生与寄主植物相同的次生代谢产物，同时也会仿照宿主植物产生同类化学成分，例如，紫杉醇 、喜树碱及其类似结构化合物 、茉莉酸 、银杏内酯 、印楝素 等 霸王鞭是大戟属多年生肉质灌木，具有丰富而有毒的乳汁，主要分布于中国西南地区、印度及巴基斯坦 植物全株及乳汁可入药，具祛风消炎、清热解毒的功效 目前关于霸王鞭的研究报道主要是从其植物中分离得到具有生物活性的二萜、三萜、酚类和甾醇类化合物 ，但关于其植物内生真菌次生代谢产物的报道却很少 因此，从霸王鞭中分离出内生真菌，发酵后分离其次生代谢产物，对其次生代谢产物进行研究具有一定的科学意义镰刀菌 属于镰刀菌属 镰刀菌属包括约 个已知物种，约 个待定物种，许多待定物种尚未有正式名称 它是一种较为常见的丝状真菌，在植物和动物中广泛分布 由于镰刀菌经常作为病原菌侵染其他动植物使其致病，常见报道关于镰刀菌的研究通常是对于镰刀菌的防治 据镰刀菌次生代谢产物的研究报道，镰刀菌次生代谢产物种类丰富，分别有生物碱类 ，肽类 ，萜类 ，喹啉类 ，氨基酸类 等，对于其中一系类化合物表现出来抗肿瘤活性 本研究将分离自大戟科大戟属霸王鞭的镰刀菌 进行固体发酵，对其固体发酵产物进行提取分离纯化，从中分离得到 个化合物，其中有 个含氮杂环化合物、个含氧杂环化合物、个苯环衍生物 分别鉴定为：（）、（）（）、（）、（）（）、（）、（）（）、（，）（），（）和 （），其中化合物 、和 共 个化合物均首次从镰刀菌属中分离得到 材料与仪器电热恒温培养箱：型 上海一恒科技有限公司；半制备色谱柱：型 ，美国 公司；低温冷却液循环泵：（）河南巩义瑞德仪器设备仪器有限公司；制备色谱柱：型 ，北京吉瑞森科技有限责任公司；核磁共振仪：型 德国 公司；旋转蒸发仪：型 德国 公司；高效液相色谱仪：型 美国 公司 级甲醇、级乙腈（云南新蓝景化学品有限公司）、材料（日本三菱公司）、工业级乙醇、工业乙酸乙酯、工业二氯甲烷、工业甲醇（云南利研科技有限公司）、目，目硅胶、薄层层析硅胶板（，烟台维启化工产品有限公司）野生霸王鞭活样品采自云南省普洱市景东县，经云南民族大学周敏教授鉴定为大戟科大戟属植物霸王鞭（）菌株从新鲜的大戟科植物霸王鞭的茎部分离，由擎科生物有限公司进行 分子鉴定，经过基因序列对比鉴定为镰刀菌属镰刀菌 ，其 登记号为 菌株保存于云南民族大学民族药资源化学重点实验室 发酵、提取与分离 菌株的发酵将纯化的镰刀菌 接种至培养皿 培养基中活化，直到菌种成为单一菌体 后接种至液体 培养基中（瓶 ，装于 锥形瓶中），无菌透气封口膜封口高温灭菌锅 灭菌 ，取出冷却至室温提前备用于接种 接种后锥形瓶放置在恒温振荡培养箱中，、进行培养，后取出 将种子液以 的比例分别接种于已灭菌的大米培养基中（罐 发酵罐），培养 待菌丝长满大米培养基后捣碎取出，用 乙醇超声浸泡提取 次，每次超声 ，收集乙醇提取液 乙醇提取液减压蒸发浓缩后，用乙酸乙酯 水（，）萃取次，合并乙酸乙酯相减压蒸发浓缩后得到浸膏 提取与分离浸膏经 柱色谱用不同体积分数甲醇 水溶液（，）梯度洗脱得到 个组分 （）用色谱甲醇溶解微孔滤膜过滤后，经制备型高效液相色谱柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离得到 个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱纯化得到化合物（，）、化合物（，）、化合物（）（）用色谱甲醇溶解微孔滤膜过滤后，经制备型高效液相色谱柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离得到个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离得到 个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 乙腈 水溶液）等度洗脱纯化得到化合物（，）（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离得到 个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱纯化得到化合物（云南民族大学学报（自然科学版）第 卷 ，），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离得到 个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱纯化得到化合物（，）（）用色谱甲醇溶解微孔滤膜过滤后，经制备型高效液相色谱柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱进行分离得到 个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离得到个亚组分（），（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱纯化后得化合物（，）（）经半制备柱（流速 ，流动相为 甲醇 水溶液）等度洗脱分离纯化得到化合物（，）结构鉴定化合物 白色粉末，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，）（），（），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 化合物 白色粉末，分子式，（）：，（，）（，），（，），（，）（），（），（），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 （）化合物 白色粉末，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，），（，）（），（），（，），（），（，），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 化合物 淡黄色油状，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，），（，），（，）（），（），（，），（），（，），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 （）化合物 无色油状，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）（），（），（），（，），（），（，），（），（），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 化合物 无色油状，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 （）化合物 浅黄色油状，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），第 期杨家梅，黄磊，陈宁，等：霸王鞭内生真菌 发酵物的次生代谢产物研究（，），（，）（），（），（），（，），（，），（），（），（），（），（），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为（，）（），化合物 浅黄色油状，分子式 （）：，（，）（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）以上数据与文献 报道一致，因此鉴定为 HNN1NNHHOOC2HO3OOOHOMe6OMeONHO5OHNOO7OOHO8HOOCCOOH123451234512345678123456789101121345612312345678911101213141516123456789101145265OHMeOO4317841312图 次生代谢产物的化学结构 结语本实验对大戟属植物霸王鞭（）内生真菌镰刀菌 的次生代谢产物进行研究 从镰刀菌 的 乙醇提取物中发现了 个化合物，根据化合物波谱数据、理化性质以及查阅相关文献鉴定出其化学结构 分别为 （）、（）（）、（，）（），（），个化合物为含氮杂环化合物，（）（）、（），个化合物为含氧杂环化合物，（）、（）（）、（），个为苯环衍生物 其中化合物 、和 为首次从镰刀菌 中分离得到，这为药用植物内生菌的研究以及镰刀菌属 的研究提供了一定的实验依据和理论基础，并对进一步研究霸王鞭内镰刀菌化合物的生物活性和生源途径做了前期工作参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：云南民族大学学报（自然科学版）第 卷 ，（）：，（）：，（）：，（）：梁宇，高玉葆内生真菌对植物生长发育及抗逆性的影响 植物学通报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志 北京：科学出版社，王虹，赵明，张树军霸王鞭化学成分的研究 齐齐哈尔大学学报（自然科学版），（）：杨大松，李资磊，魏建国，等霸王鞭的化学成分研究 中草药，（）：李子燕，杨靖华，汪云松，等霸王鞭化学成分研究 云南民族大学学报（自然科学版），（）：孙伟健，于野，张沛东，等霸王鞭化学成分研究 齐齐哈尔大学学报（自然科学版），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：第 期杨家梅，黄磊，陈宁，等：霸王鞭内生真菌 发酵物的次生代谢产物研究 ，（）：卢丹，王春宇，刘金平，等穿龙薯蓣地上部分的化学成分 中草药，（）：肖定军，邓松之，吴厚铭南海海绵 化学成分研究（一）广州化学，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（，）：，：（），（）（），（），（）（），（），（）（），（，）（），（），（），、：；（责任编辑王琳）云南民族大学学报（自然科学版）第 卷