农业农村部公告第628号-8-2022 （代替农业部1782号公告-6-2012）转基因植物及其产品成分检测 bar或pat基因定性PCR方法.pdf

2022?12?19发布2023?03?01实施转基因植物及其产品成分检测bar和pat基因定性PCR方法04中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准备案号：XXXX-XXXX65.020.01BDetection of genetically modified plants and derived productsQualitative PCR method of bar and pat genes中华人民共和国农业农村部发 布农业农村部公告第 628 号82022CCS代替农业部 1782 号公告62012农业农村部公告第 号 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件代替农业部 号公告 转基因植物及其产品成分检测b a r或p a t基因定性P C R方法,与农业部 号公告 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:更改了“范围”中关于检测方法的表述(见第章,年版的第章);更改了“原理”中关于试验方法和结果判断的表述(见第章,年版的第章);更改了普通P C R引物(见 、,年版的 、);增加了实时荧光P C R方法引物/探针(见 、)、实时荧光P C R试剂盒(见 );将“仪器”更改为“主要仪器和设备”,增加了实时荧光P C R仪,删除了紫外透射仪、重蒸馏水发生器或纯水仪、其他相关仪器和设备(见第章,年版的第章);在“分析 步 骤”中 更 改 了 普 通P C R扩 增 体 系 的 配 制(见 、表,年 版 的 、表),增加了实时荧光P C R方法(见 );更改了“结果分析与表述”中普通P C R方法的结果分析与表述(见 ,年版的 ),增加了实时荧光P C R方法的结果分析与表述(见 );增加了“检出限”(见第章);更改了资料性附录A(见附录A,年版的附录A).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、吉林省农业科学院、山东省农业科学院、上海交通大学.本文件主要起草人:李飞武、王颢潜、闫伟、张旭冬、李葱葱、龙丽坤、董立明、夏蔚、刘娜、谢彦博、邢珍娟、路兴波、杨立桃.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:农业部 号公告 .农业农村部公告第 号 转基因植物及其产品成分检测b a r和p a t基因定性P C R方法范围本文件规定了转基因植物中b a r和p a t基因的定性P C R检测方法.本文件适用于转基因植物及其制品中b a r和p a t基因成分的定性P C R检测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(P C R)检测方法农业部 号公告 转基因植物及其产品成分检测D NA提取和纯化农业部 号公告 转基因植物及其产品成分检测抽样NY/T 转基因植物及其产品检测通用要求S N/T 转基因成分检测玉米检测方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件.b a r基因b i a l a p h o s r e s i s t a n c eg e n e来源于土壤吸水链霉菌(S t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s),编码膦丝菌素乙酰转移酶(p h o s p h i n t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s e,P AT)的基因.p a t基因p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s eg e n e来源于绿产色链霉菌(S t r e p t o m y c e sv i r i d o c h r o m o g e n e s),编码膦丝菌素乙酰转移酶(p h o s p h i n t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s e,P AT)的基因.原理根据转基因植物中b a r和p a t基因的核苷酸序列,分别设计普通P C R方法引物、实时荧光P C R方法引物和探针,对试样进行P C R扩增.依据是否扩增获得预期的D NA片段或典型扩增曲线,判断样品中是否含有b a r和p a t基因成分.试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水.琼脂糖.g/L溴化乙锭(E B)溶液:称取 g溴化乙锭,溶解于 mL水中,避光保存.警告 溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物.注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂.m o l/L氢氧化钠(N a OH)溶液:在 mL水中加入 g氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容到 mL.农业农村部公告第 号 mm o l/L乙二胺四乙酸二钠(E D TA N a)溶液(p H ):称取 g乙二胺四乙酸二钠,加入 m L水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见 )直至E D TA N a完全溶解,用氢氧化钠溶液(见 )调p H至 ,加水定容至 mL.在 k P a()条件下灭菌 m i n.m o l/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(T r i s HC l)溶液(p H ):称取 g三羟甲基氨基甲烷溶解于 m L水中,用盐酸调p H至 ,加水定容至 mL.在 k P a()条件下灭菌 m i n.T E缓冲液(p H ):分别量取 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(见 )和mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见 ),加水定容至 mL.在 k P a()条件下灭菌 m i n.TA E缓冲液:称取 g三羟甲基氨基甲烷(T r i s),先用 mL水加热搅拌溶解后,加入 m L乙二胺四乙酸二钠溶液(见 ),用冰乙酸调p H至 ,然后加水定容到 mL.使用时用水稀释成TA E.加样缓冲液:称取 m g溴酚蓝,加入 mL水,在室温下溶解 h;称取 m g二甲基苯腈蓝,加 mL水溶解;称取 g蔗糖,加 mL水溶解.混合以上种溶液,加水定容至 mL,在下保存.D NA分子量标准:可以清楚区分 b p b p的D NA片段.d NT P s混合溶液:将浓度为 mm o l/L的d AT P、d T T P、d G T P、d C T P种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.T a qD NA聚合酶、P C R扩增缓冲液及 mm o l/L氯化镁(M g C l)溶液.b a r基因引物 普通P C R方法引物:b a r F:A C AAG C A C G G T C AA C T T C C ;b a r R:A C T C G G C C G T C C AG T C G TA .注:预期扩增目的片段大小为 b p(参见附录A中的A ).来源:S N/T ,附录A 实时荧光P C R方法引物/探针:b a r q F:A C AAG C A C G G T C AA C T T C C ;b a r q R:A C T C G G C C G T C C AG T C G TA ;b a r q P:C C GAG C C G C AG GAA C C G C AG GAG .注:预期扩增目的片段大小为 b p(参见A ).注:b a r q P为b a r基因的T a q M a n探针,其 端标记荧光报告基团(如F AM、HE X等)、端标记对应的淬灭基团(如TAMR A、B HQ 等).来源:G B/T ,附录A p a t基因引物 普通P C R方法引物:p a t F:C C G GAGAG GAGA C C AG T T GAGAT ;p a t R:T T C C AG G G C C C AG C G TAAG .注:预期扩增目的片段大小为 b p(参见A ).实时荧光P C R方法引物/探针:p a t q F:G T C GA C AT G T C T C C G GAGAG ;p a t q R:G C AA C C AA C C AAG G G TAT C ;p a t q P:T G G C C G C G G T T T G T GATAT C G T TAA .注:预期扩增目的片段大小为 b p(参见A ).注:p a t q P为p a t基因的T a q M a n探针,其 端标记荧光报告基团(如F AM、HE X等)、端标记对应的淬灭基团(如TAMR A、B HQ 等).来源:G B/T ,附录A农业农村部公告第 号 内标准基因引物:根据样品种类选择合适的内标准基因,确定对应的检测引物.引物/探针溶液:用T E缓冲液(见 )或水分别将上述引物或探针稀释到 m o l/L.石蜡油.D NA提取试剂盒.定性P C R试剂盒.P C R产物回收试剂盒.实时荧光P C R试剂盒.主要仪器和设备 分析天平:感量 g和 m g.P C R扩增仪:升降温速度 /s,孔间温度差异 .实时荧光P C R仪.电泳槽、电泳仪等电泳装置.凝胶成像系统或照相系统.分析步骤 抽样按NY/T 和农业部 号公告 的规定执行.试样制样按NY/T 和农业部 号公告 的规定执行.试样预处理按农业部 号公告 的规定执行.D N A模板制备按农业部 号公告 的规定执行.P C R扩增 普通P C R方法 试样P C R扩增 内标准基因P C R扩增 每个试样P C R扩增设置个平行.根据选择的内标准基因及其P C R检测方法对试样进行P C R扩增,具体P C R扩增条件参考选择的内标准基因检测方法.扩增结束后取出P C R管,对P C R扩增产物进行电泳检测.b a r和p a t基因P C R扩增 每个试样P C R扩增设置个平行.按表依次加入反应试剂,混匀,分装到P C R管中,再加 L石蜡油(有热盖设备的P C R仪可不加);也可采用经验证的、效果相当的定性P C R试剂盒配制反应体系.表普通P C R扩增体系试剂终浓度体积d d HO P C R缓冲液 L mm o l/L氯化镁溶液 mm o l/L Ld N T P s混合溶液(各 mm o l/L)mm o l/L L农业农村部公告第 号 表(续)试剂终浓度体积 m o l/L上游引物 m o l/L L m o l/L下游引物 m o l/L LT a qD NA聚合酶 U/L m g/LD NA模板m g/L L总体积 L“”表示体积不确定,如果P C R缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据T a q酶的浓度确定其体积,并相应调整d d HO的体积,使反应体系总体积达到 L.在b a r基因P C R扩增体系中,上、下游引物分别为b a r F和b a r R;在p a t基因P C R扩增体系中,上、下游引物分别为p a t F和p a t R.若采用定性P C R试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系,但上下游引物用量按表执行.将P C R管放在离心机上,g g离心 s,然后取出P C R管,放入P C R仪中.进行P C R扩增.反应程序为:变性m i n;变性 s,退火 s,延伸 s,共进行 次循环;延伸m i n;保存.反应结束后取出P C R管,对P C R扩增产物进行电泳检测.对照P C R扩增在试样P C R扩增的同时,应设置P C R阳性对照、P C R阴性对照和P C R空白对照.以与试样相同种类的非转基因植物基因组D NA作为阴性对照;以含有b a r或p a t基因的转基因植物基因组D NA(转基因质量分数为 )作为阳性对照;以水作为空白对照.除模板外,对照P C R扩增与试样P C R扩增相同(见 ).P C R产物电泳检测按 g/L的质量浓度称量琼脂糖,加入TA E缓冲液中,加热溶解,配制成琼脂糖溶液.每 m L琼脂糖溶液中加入LE B溶液或适量的其他核酸染料,混匀,稍适冷却后,将其倒入电泳板上,插上梳板,室温下凝固成凝胶后,放入TA E缓冲液中,垂直向上轻轻拔去梳板.取 LP C R产物与L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔,同时在其中一个点样孔中加入D NA分子量标准,接通电源在V/c mV/c m条件下电泳检测.凝胶成像分析电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,置于凝胶成像仪上成像.根据D NA分子量标准估计扩增条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照.如需通过序列分析确认P C R扩增片段是否为目的D NA片段,按照 和 的规定执行.P C R产物回收按P C R产物回收试剂盒说明书,回收P C R扩增的D NA片段.P C R产物测序验证将回收的P C R产物测序,与转基因植物中转入的b a r或p a t基因序列(参见附录A)进行比对,确定P C R扩增的D NA片段是否为目的D NA片段.实时荧光P C R方法 试样P C R扩增 内标准基因P C R扩增 每个试样P C R扩增设置个平行.根据选择的内标准基因及其P C R检测方法对试样进行P C R扩增,具体P C R扩增条件参考选择的内标准基因检测方法.b a r或p a t基因P C R扩增 每个试样P C R扩增设置个平行.农业农村部公告第 号 按表依次加入反应试剂,混匀,分装到P C R管中.也可采用经验证的、效果相当的实时荧光P C R试剂盒配制反应体系.表实时荧光P C R扩增体系试剂终浓度体积d d HO P C R缓冲液 L mm o l/L氯化镁溶液 mm o l/L Ld N T P s混合溶液(各 mm o l/L)mm o l/L L m o l/L上游引物 m o l/L L m o l/L下游引物 m o l/L L m o l/L探针 m o l/L LT a qD NA聚合酶 U/L m g/LD NA模板 m g/L L总体积 L“”表示体积不确定.如果P C R缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据T a q酶的浓度确定其体积,并相应调整d d HO的体积,使反应体系总体积达到 L.在b a r基因P C R扩增体系中,上、下游引物和探针分别为b a r q F、b a r q R和b a r q P;在p a t基因P C R扩增体系中,上、下游引物和探针分别为p a t q F、p a t q R和p a t q P.若采用实时荧光P C R试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系,但上下游引物及探针用量按表执行.将P C R管放在离心机上,g g离心 s,然后取出P C R管,放入实时荧光P C R仪中.运行实时荧光P C R扩增.反应程序为 变性m i n;变性 s,退火延伸 s,共进行 个循环;在第二阶段的退火延伸()时段收集荧光信号.注:可根据仪器和试剂要求将反应参数作适当调整.对照P C R扩增在试样P C R扩增的同时,应设置P C R阳性对照、P C R阴性对照和P C R空白对照.以与试样相同种类的非转基因植物基因组D NA作为阴性对照;以含有b a r或p a t基因的转基因植物基因组D NA(转基因质量分数为 )作为阳性对照;以水作为空白对照.除模板外,对照P C R扩增与试样P C R扩增相同(见 ).结果分析与表述 普通P C R方法 对照检测结果分析在P C R扩增中,阳性对照内标准基因及b a r或p a t基因均得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致;而阴性对照仅扩增出内标准基因片段;空白对照没有扩增片段,表明P C R扩增体系正常工作.否则,重新检测.样品检测结果分析和表述 b a r基因检测结果分析和表述 试样内标准基因和b a r基因均得到扩增,表明样品中检测出b a r基因,表述为“样品中检测出b a r基因成分,检测结果为阳性”.试样内标准基因得到扩增,但b a r基因未得到扩增,表明样品中未检测出b a r基因,表述为“样品中未检测出b a r基因成分,检测结果为阴性”.试样内标准基因未得到扩增,表明样品中未检测出对应植物成分,表述为“样品中未检测出对应植物基因组D NA成分”.农业农村部公告第 号 p a t基因检测结果分析和表述 试样内标准基因和p a t基因均得到扩增,表明样品中检测出p a t基因,表述为“样品中检测出p a t基因成分,检测结果为阳性”.试样内标准基因得到扩增,但p a t基因未得到扩增,表明样品中未检测出p a t基因,表述为“样品中未检测出p a t基因成分,检测结果为阴性”.试样内标准基因未得到扩增,表明样品中未检测出对应植物成分,表述为“样品中未检测出对应植物基因组D NA成分”.实时荧光P C R方法 基线与阈值的设定实时荧光P C R扩增结束后,以P C R扩增刚好进入指数期来设置荧光信号阈值,并根据仪器噪声情况进行调整.对照检测结果分析在P C R扩增中,阳性对照内标准基因及b a r或p a t基因均出现典型扩增曲线且C t值小于或等于;阴性对照仅内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于;空白对照无典型扩增曲线,表明P C R扩增体系正常工作.否则,重新检测.样品检测结果分析和表述 b a r基因检测结果分析和表述 试样内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,b a r基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,表明样品中检测出b a r基因,表述为“样品中检测出b a r基因成分,检测结果为阳性”.试样内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,但b a r基因无典型扩增曲线或C t值大于,表明样品中未检测出b a r基因,表述为“样品中未检测出b a r基因成分,检测结果为阴性”.试样内标准基因未出现典型扩增曲线或C t值大于,表明样品中未检测出对应植物成分,表述为“样品中未检测出对应植物基因组D NA成分”.p a t基因检测结果分析和表述 试样内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,p a t基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,表明样品中检测出p a t基因,表述为“样品中检测出p a t基因成分,检测结果为阳性”.试样内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,但p a t基因无典型扩增曲线或C t值大于,表明样品中未检测出p a t基因,表述为“样品中未检测出p a t基因成分,检测结果为阴性”.试样内标准基因未出现典型扩增曲线或C t值大于,表明样品中未检测出对应植物成分,表述为“样品中未检测出对应植物基因组D NA成分”.注:个P C R平行扩增结果出现不一致的,应重做P C R扩增样品次,最终以多数结果为准.检出限普通P C R方法和实时荧光P C R方法的检出限均为 (含靶序列样品D NA/总样品D NA).注:本文件的检出限是在P C R扩增体系中加入 n gD NA模板进行测算的.农业农村部公告第 号 附录A(资料性)b a r和p a t基因特异性序列A b a r基因特异性序列A C AAG C A C G GT C AA C T T C C GTAC C GAG C C GC AG GAA C C G CAG GAG T G GA CG GA C GA C C T C G T C C G T C T G CG G GAG C G C TAT C C C T G G C T CG T C G C C GAG GT G GA C G G C GAG G T C G C C G G C A T C G C C TA C GC G G G C C C C T GGAAG G C A C G CAA C G C C TA C GA C T G GA C G G CC GAG T注:序列方向为 .注:端下划线部分为普通P C R方法和实时荧光P C R方法上游引物序列,端下划线部分为普通P C R方法和实时荧光P C R方法下游引物的反向互补序列,方框内部分为实时荧光P C R方法探针序列.A p a t基因特异性序列G T C G A C A T G TC T C C G G A G A GGAGA C C AG T TGAGA T TAG G CC AG C TA C AG CAG C T GA TAT G G C C G C G G T T TG T GA TA T C G TTAAC C A T TA CA T T GAGA C G TC TA C AG T GAAC T T TAG GA C A GAG C C A C AAAC A C C A C AAGAG T G GA T T GA TGA T C TAGAGAG G T T G C AAGATAG A T A C C C T T G G T T G G T T GCT GAG G T T GAG G G T G T T G T GG C T G G TA T T GC T TA C G C T G GG C C C T G GAA注:序列方向为 .注:端下划线部分为普通P C R方法上游引物序列,端下划线部分为普通P C R方法下游引物的反向互补序列;端斜体部分为实时荧光P C R方法上游引物序列,端斜体部分为实时荧光P C R方法下游引物的反向互补序列,方框内部分为实时荧光P C R方法探针序列.