KJ 201904 水发产品中甲醛的快速检测.docx

附件4

水发产品中甲醛的快速检测
（KJ201904）

1　 范围
本方法规定了水发产品及其浸泡液中甲醛的快速检测方法。
本方法适用于银鱼、鱿鱼、牛肚、竹笋等水发产品及其浸泡液中甲醛的快速测定。
AHMT法（比色卡法）
2　 原理
试样中的甲醛经提取后，在碱性条件下与4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂（AHMT）发生缩合，再被高碘酸钾氧化成6-巯基-S-三氮杂茂[4，3-b]-S-四氮杂苯的紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与甲醛含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，对试样中甲醛进行定性判定。
3　 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1　 试剂
3.1.1　 氢氧化钾（KOH）。
3.1.2　 盐酸（HCl）。
3.1.3　 亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）。
3.1.4　 乙酸锌（ C4H6O4Zn·2H2O）。
3.1.5　 冰乙酸（C2H4O2）。
3.1.6　 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
3.1.7　 高碘酸钾（KIO4）。
3.1.8　 4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂 （C2H6N6S ，AHMT）。
3.1.9　 氢氧化钾溶液（5mol/L）：称取280.5g氢氧化钾（3.1.1），用水溶解并定容至1000mL，混匀。
3.1.10　 氢氧化钾溶液（0.2mol/L）：称取11.22g氢氧化钾（3.1.1），用水溶解并定容至1000mL，混匀。
3.1.11　 盐酸溶液（0.5mol/L）：量取41mL盐酸（3.1.2），用水稀释并定容至1000mL，混匀。
3.1.12　 亚铁氰化钾溶液（106 g/L）：称取10.6 g亚铁氰化钾（3.1.3），用水溶解并定容至100 mL，混匀。
3.1.13　 乙酸锌溶液（220g/L）：称取22 g乙酸锌（3.1.4），加入3mL冰乙酸（3.1.5）溶解，用水稀释并定容至100mL，混匀。
3.1.14　 乙二胺四乙酸二钠溶液（100 g/L）：称取10g乙二胺四乙酸二钠（3.1.6），用5 mol/L氢氧化钾溶液（3.1.9）溶解，并定容至100 mL，混匀。
3.1.15　 AHMT溶液（5 g/L）：称取0.5 g 4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂（3.1.8），用0.5 mol/L盐酸溶液（3.1.11）溶解，并定容至100 mL，混匀后置于棕色瓶中，有效期6个月。
3.1.16　 高碘酸钾溶液（15 g/L）：称取1.5g高碘酸钾（3.1.7），用0.2 mol/L氢氧化钾溶液（3.1.10）溶解，并定容至100 mL，混匀。
3.2　 参考物质
甲醛参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1。
表1 甲醛参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相对分子量
甲醛
Formaldehyde
50-00-0
HCHO
30.03
3.3　 标准溶液的配制
3.3.1　 甲醛标准储备液（100µg/mL）：安瓿瓶封装，冷藏、避光、干燥条件下保存。使用前恢复至室温，摇匀备用。安瓿瓶打开后应一次性使用完毕。
3.3.2　 甲醛标准工作液（10µg/mL）：吸取甲醛标准储备液（100µg/mL）（3.3.1）1.0mL，置于10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，临用前配制。
3.4　 材料
3.4.1　 甲醛快速检测试剂盒（AHMT法-比色卡法）：适用基质为水发产品及其浸泡液，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。
3.4.2　 滤纸：中速定性滤纸。
4　 仪器和设备
4.1　 移液器：200µL，1mL，5mL。
4.2　 涡旋混合器。
4.3　 电子天平或手持式天平：感量为0.01g。
4.4　 离心机：转速≥4000r/min。
4.5　 环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。
5　 分析步骤
5.1　 试样制备
取适量有代表性试样的可食部分或浸泡液，固体试样剪碎混匀，液体试样需充分混匀。
5.2　 试样的提取
准确称取试样1 g（精确至0.01 g）或吸取试样1.0mL，置于15 mL离心管中，加水定容至10 mL，涡旋提取1 min，静置5 min，取上清液作为提取液（如上清液浑浊，加入1mL亚铁氰化钾溶液（3.1.12）和1mL乙酸锌溶液（3.1.13），涡旋混匀，4000 r/min离心5 min或滤纸过滤，取上清液或滤液作为提取液）。
5.3　 测定步骤
准确移取提取液2 mL于5 mL离心管中，加入0.4 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（3.1.14）和0.4 mL AHMT溶液（3.1.15），涡旋混匀后静置10 min，再加入0.1 mL高碘酸钾溶液（3.1.16），涡旋混匀后静置5 min，立即与标准色阶卡目视比色，10min内判读结果。进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。
5.4　 质控试验
每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。
5.4.1　 空白试验
称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，按照5.2和5.3步骤与试样同法操作。
5.4.2　 加标质控试验
准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，置于15 mL离心管中，加入0.5 mL甲醛标准工作液（10 µg/mL）（3.3.2），使试样中甲醛含量为5mg/kg，按照5.2和5.3步骤与试样同法操作。
6　 结果判定要求
观察检测管中样液颜色，与标准色阶卡比较判读试样中甲醛的含量。颜色浅于检出限（5 mg/kg）则为阴性试样；颜色接近或深于5 mg/kg则为阳性试样。色阶卡见图1。
甲醛标准比色卡（mg/kg或mg/L）
0 5 10 20 50 100 200

图1 甲醛标准色阶卡

质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控试验测定结果应与比色卡第二点（5mg/kg或mg/L）颜色一致。
7　 结论
由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则。当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。
8　 性能指标
8.1　 检测限
5mg/kg或mg/L。
8.2　 灵敏度
灵敏度应≥95%。
8.3　 特异性
特异性应≥85%。
8.4　 假阴性率
假阴性率应≤5%。
8.5　 假阳性率
假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。

AHMT法（分光光度法）
9　 原理
试样中的甲醛经提取后，在碱性条件下与4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂 （AHMT）发生缩合，再被高碘酸钾氧化成6-巯基-S-三氮杂茂[4，3-b]-S-四氮杂苯的紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与甲醛含量成正相关，用分光光度计在550nm处测定吸光度值，与标准系列比较定量，得到试样中甲醛的含量。
10　 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
10.1　 试剂
同3.1。
10.2　 参考物质
同3.2。
10.3　 标准溶液的配制
同3.3。
10.4　 材料
10.4.1　 甲醛快速检测试剂盒（AHMT法-分光光度法）：适用基质为水发产品及其浸泡液，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。
10.4.2　 滤纸：中速定性滤纸。
11　 仪器和设备
11.1　 移液器：200 µL，1 mL，5 mL。
11.2　 涡旋混合器。
11.3　 电子天平或手持式天平：感量为0.01 g。
11.4　 离心机：转速≥4000 r/min。
11.5　 分光光度计或相应商品化测定仪。
11.6　 环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。
12　 分析步骤
12.1　 试样制备
同5.1。
12.2　 试样的提取
同5.2。
12.3　 测定步骤
准确移取提取液（12.2）2 mL置于5 mL离心管中，另准确吸取10 µg/mL的甲醛标准工作液（3.3.2）0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（相当于0 µg、1 µg、2 µg、4 µg、6 µg、8 µg、10 µg甲醛）分别置于5mL带刻度的具塞刻度试管中，加水定容至2 mL，涡旋混匀。于标准管和试样管中分别加入0.4 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（3.1.14）和0.4 mL AHMT溶液（3.1.15），涡旋混匀静置10 min，再加入0.1mL高碘酸钾溶液（3.1.16），静置5 min后用1cm 比色杯，以零管调节零点，于波长550 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
12.4　 质控试验
每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。
12.4.1　 空白试验
称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0mL，按照12.2和12.3步骤与试样同法操作。
12.4.2　 加标质控试验
准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，置于15 mL离心管中，加入0.5 mL甲醛标准工作液（10 µg/mL）（3.3.2），使试样中甲醛含量为5 mg/kg，按照12.2和12.3步骤与试样同法操作。
13　 分析结果的表述
13.1　 结果计算
试样中甲醛的含量按式（1）计算：

………………………………（1）

式中：
X——试样中甲醛的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；
ρ——由标准曲线得到的试样提取液中甲醛的含量，单位为微克（µg）；
ρ0——由标准曲线得到的空白提取液中甲醛的含量，单位为微克（µg）；
V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；
V1——测定用试样体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的取样量，单位为克或毫升（g或mL）；
1000——单位换算系数。
计算结果保留两位有效数字。
13.2　 结果判定
当测定结果≥5 mg/kg或mg/L时，判定为阳性，阳性结果的试样需要重复检验2次以上。
13.3　 质量控制要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果回收率应≥60%。
14　 结论
当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。
15　 性能指标
15.1　 检测限
5mg/kg或mg/L。
15.2　 灵敏度
灵敏度应≥95%。
15.3　 特异性
特异性应≥85%。
15.4　 假阴性率
假阴性率应≤5%。
15.5　 假阳性率
假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。

乙酰丙酮法（分光光度法）
16　 原理
试样中的甲醛经提取后，在沸水浴条件下与乙酰丙酮发生反应，生成黄色物质，其颜色的深浅在一定范围内与甲醛含量成正相关，用分光光度计在413 nm处测定吸光度值，与标准系列比较定量，得到试样中甲醛的含量。
17　 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
17.1　 试剂
17.1.1　 无水乙酸钠（CH3COONa）。
17.1.2　 乙酰丙酮（C5H8O2）。
17.1.3　 乙酰丙酮溶液：称取25.0 g无水乙酸钠（17.1.1）溶于适量水中，移入100 mL容量瓶中，加0.40 mL乙酰丙酮（17.1.2）和3.0 mL冰乙酸（3.1.5），加水定容至刻度，混匀，移至棕色试剂瓶中，2℃～8℃保存，有效期1个月。
17.2　 参考物质
同3.2。
17.3　 标准溶液配制
同3.3。
17.4　 材料
17.4.1　 甲醛快速检测试剂盒（乙酰丙酮法-分光光度法）：适用基质为水发产品及其浸泡液，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。
17.4.2　 滤纸：中速定性滤纸。
18　 仪器和设备
18.1　 移液器：200 µL，1 mL，5 mL。
18.2　 涡旋混合器。
18.3　 电子天平或手持式天平：感量为0.01 g。
18.4　 离心机：转速≥4000r/min。
18.5　 水浴锅。
18.6　 分光光度计或相应商品化测定仪。
18.7　 环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。
19　 分析步骤
19.1　 试样制备
同5.1。
19.2　 试样的提取
同5.2。
19.3　 测定步骤
准确移取提取液（19.2）2 mL置于5 mL离心管中，另准确吸取10 µg/mL的甲醛标准工作液（3.3.2）0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（相当于0 µg、1 µg、2 µg、4 µg、6 µg、8 µg、10 µg甲醛）分别置于5 mL带刻度的具塞刻度试管中，加水定容至2 mL，涡旋混匀。于标准管和试样管中分别加入0.2 mL 乙酰丙酮溶液（17.1.3）涡旋混匀后沸水浴5 min，取出冷却至室温后用1 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长413 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
19.4　 质控试验
每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。
19.4.1　 空白试验
称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，按照19.2和19.3步骤与试样同法操作。
19.4.2　 加标质控试验
准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，置于15 mL离心管中，加入0.5 mL甲醛标准工作液（10 µg/mL）（3.3.2），使试样中甲醛含量为5 mg/kg，按照19.2和19.3步骤与试样同法操作。
20　 分析结果的表述
20.1　 结果计算
同13.1。
20.2　 结果判定
同13.2。
20.3　 质量控制要求
同13.3。
21　 结论
当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。
22　 性能指标
22.1　 检测限
5mg/kg或mg/L。
22.2　 灵敏度
灵敏度应≥95%。
22.3　 特异性
特异性应≥85%。
22.4　 假阴性率
假阴性率应≤5%。
22.5　 假阳性率
假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。
23　 其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为SC/T 3025-2006《水产品中甲醛的测定 液相色谱法》或其他现行有效的甲醛检测标准。

附录A

快速检测方法性能指标计算表
表A.1 性能指标计算表
试样情况a
检测结果b
总数
阳性
阴性
阳性c
N11
N12
N1.=N11+N12
阴性
N21
N22
N2.=N21+N22
总数
N.1=N11+N12
N.2=N21+N22
N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(х2)
c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21)，自由度（df）=1
灵敏度(p+，%)
p+=N11/N1.
特异性(p-，%)
p-=N22/N2.
假阴性率(pf-，%)
pf-=N12/N1.=100-灵敏度
假阳性率(pf+，%)
pf+=N21/N2.=100-特异性
相对准确度，%d
(N11+N22)/(N1.+N2.)
注：
a由参比方法检验得到的结果或者试样中实际的公议值结果；
b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。用于确认方法时，结果≥5mg/kg时，判定为阳性（仅用于计算性能指标）；
c本方法规定：用于计算灵敏度和假阴性率的阳性试样，由参比方法检验得到的结果回收率应≥60%。
N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
d为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法负责起草单位：南京工业大学（国家轻工业食品质量监督检测南京站）
验证单位：南京市产品质量监督检验院、厦门市食品药品质量检验研究院、江西省药品检验检测研究院
主要起草人：熊晓辉、汪开银、聂小林、肖有玉、骆和东、章红

— 9 ——