丹参多糖低分子量组分抗小鼠肝肾损伤及对其免疫保护作用机制的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211054丹参多糖低分子量组分抗小鼠肝肾损伤及对其免疫保护作用机制的研究李巍1，陈贵才2，胡伟莲2，戴德慧2*(1.浙江大学 实验动物中心，浙江 杭州 310058；2.浙江科技学院 生物与化学工程学院，浙江 杭州 310012)摘要：为筛选体外抗氧化能力最强的丹参多糖组分，并研究其对小鼠抗肝肾损伤与免疫保护作用及机制，本研究通过分光光度法测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)、超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(OH)清除能力及总还原力等评价丹参多糖不同分子量组分的体外抗氧化能力。结果显示相同的条件下，丹参多糖低分子量组分具有更强的体外抗氧化能力；将60只ICR小鼠分为对照组、模型组及丹参多糖低分子量组分低、中、高剂量给药组(75 mg/kg，150 mg/kg，300 mg/kg)共5组。除对照组外，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)制备肝肾损伤及免疫抑制小鼠，给药组每日灌胃给药1次，共给药30 d。给药结束后称量小鼠体质量并剖杀各组小鼠，取肝脏、肾脏、脾脏及胸腺等脏器称重并计算脏器指数。利用血液生化仪测定小鼠肝肾功能主要生化指标(ALT、AST、TP、ALB、GLOB、T-BIL、UREA、CREA)，采用分光光度法检测各组小鼠肝组织中抗氧化指标(SOD、MDA、CAT、GSH-Px)、采用流式细胞术检测小鼠血液中T细胞分型。结果显示，与对照组比，高剂量给药组小鼠能够抵抗CTX所致的体质量下降(0.05)。与模型组比，高剂量给药组小鼠肝脏和脾脏指数、血清AST及ALT、肝组织MDA含量极显著降低(0.01)；血清CREA、肝组织SOD及GSH-Px活性、外周血CD3+CD4+T细胞亚群比例及CD4+/CD8+T细胞的比值极显著升高(0.01)；胸腺指数、血清中TP、UREA及ALB含量、肝组织CAT活性显著升高(0.05)；中剂量给药组小鼠肝脏指数及肝组织MDA含量极显著降低(0.01)，ALT含量显著降低(0.05)，血清TP含量显著升高(0.05)；低剂量给药组小鼠肝脏指数显著降低(0.05)。以上结果表明丹参多糖低分子量组分(10 ku)具有较高的体内外抗氧化能力，从而对CTX所致肝肾损伤及免疫抑制模型小鼠具有抗肝肾损伤及免疫保护作用。本研究为丹参水提醇沉药渣的资源化利用及丹参多糖在动物生产中的应用提供了参考依据。关键词：丹参多糖；小鼠；抗氧化；肝肾损伤；免疫功能中图分类号：S853.7文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0635-08Ameliorative effect and mechanism of low-molecular-weightpolysaccharide fromagainst liver and kidneydamage and immunosuppressionLI Wei1,CHEN Gui-cai2,HU Wei-lian2,DAI De-hui2*(1.Laboratory Animal Center of Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310012,China)收稿日期：2022-11-30基金项目：浙江省重点研发计划项目(2021C02008)；浙江省领雁研发攻关计划项目(2022C02043)作者简介：李巍(1980-)，女，陕西延安人，助理研究员，主要从事实验动物与药理学研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorAbstract:This study aimed to screen out the polysaccharide with the highest antioxidant capacity from,and explore its effects and mechanism on liver damage,kidney damage and immunosuppression.Antioxidant capacitywas evaluated by determining scavenging activity of DPPH,O2-,OH and total reducing power ofpolysaccharideswith differentmolecular weight.The resultsshowed that the low-molecular-weight polysaccharides fromexhibited the highest antioxidant activityamong these components under the same conditions.Sixty ICR mice wererandomly divided into five groups(=12 in each group).The normal control group,Cyclophosphamide(CTX)model group,low-molecular-weight polysaccharides groups(75,150,300 mg/kg).Mice were injected intraperitoneally with CTX to establishliver damage,kidney damage and immunosuppression model except the normal control group.Each dose group was intragastricadministration once a day for 30 days.The body weight of every mouse was measured before being killed,and their liver,kidney,spleen and thymus were weighed and the corresponding indexes were measured.The main biochemical indexes(ALT,AST,TP,ALB,GLOB,T-BIL,UREA,CREA)of liver and kidney function were measured by blood biochemical instrument,the antioxidantindexes in liver tissue(SOD,MDA,CAT,GSH-Px)were tested by spectrophotometric method,and T-lymphocyte subsets inperipheral blood of mice were measured by flow cytometry.The results showed that compared with the control group，the highdose group showed significant improvements in the loss of weight in CTX model group(0.05).Compared with the modelgroup，the high dose group showed significantly decrease for the amounts of liver index,spleen index,AST and ALT in serum,MDA in liver(0.01);and significant improvements for the activities of CREA,SOD and GSH-Px in the serum,the amount ofCD3+CD4+in peripheral blood,and the ratio of CD4+/CD8+(0.01);and significant improvements for the percentage of thymusindex,TP in serum,ALB,UREA and the activities of CAT in liver(0.05)；The middle dose group showed significantlydecrease for the amount of MDA in liver(0.01)and ALT(0.05)and significant improvements for the amount of TP inserum(0.05).The low dose group showed significantly decrease in liver index(0.05).Those suggested the low-molecular-weight polysaccharide fromexhibited the high antioxidant abilityand,and exerted protective effecton liver damage,kidney damage and immunodeficiency induced by CTX in mice.It provided a theoretical basis for the resourceutilization ofresidues and the application of polysaccharides fromon breeding industry.Key words:Polysaccharide frommouse;antioxidant ability;liver and kidney damage;immunologicfunction丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Bge.)的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦以及凉血消痈的功效1。其主要有效成分为水溶性的丹参酚酸类和脂溶性的丹参酮类化合物，在临床上广泛应用于治疗心血管相关疾病2。近年来，丹酚酸相关制剂产业规模已突破百亿，其生产过程主要采用丹参水提取乙醇沉淀工艺3。因此，在生产过程中会有根茎固体药渣及醇沉半固体膏状药渣排放。对于根茎固体药渣的资源化处理已有大量的文献报道，包括丹参酮的提取、食用菌的培养等4-5。而醇沉药渣的资源化利用却鲜有报道。醇沉药渣粘度高，不利于运输及存放，还易引起环境污染。醇沉药渣中含有大量的丹参多糖，其含量高达干重的73%以上。研究表明，丹参多糖具有抗肝损伤及免疫增强等多种生理活性6，同时又有较高的食用安全性7。目前对丹参多糖药理作用研究对象主要集中在对粗多糖的研究8，而丹参水提醇沉后的粗多糖成分复杂，除了少量蛋白外可能还有大量生理活性不明显的多糖组分，很难确定是哪一种多糖组分真正发挥了功效。利用离子交换和分子筛层析等纯化方法虽能获得均一组分，但成本过高难以产业化。通过膜分离方法可以获得不同分子量范围的多糖组分，其生产成本低，易于实现工业化。有文献报道丹参多糖具有较高的体内外抗氧化能力9，但未见丹参多糖不同分子量组分的抗氧化能力比较及其在小鼠模型抗肝肾损伤及免疫保护作用的相关研究。本研究以丹参水提醇沉药渣为原料，通过不同孔径的超滤膜对丹参粗多糖进行了级分，比较了不同分子量组分的体外抗氧化能力。在此基础上，以环磷酰胺(CTX)诱导构建肝肾损伤及免疫抑制小鼠模型，分析了不同剂量丹参多糖低分子量组分对其中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年636的抗肝肾损伤、免疫保护的能力及其作用机制，为丹参多糖的进一步开发及其在动物生产中的应用提供了参考依据。1材料与方法1.1实验动物60只SPF 级ICR小鼠，体质量18 g22 g，雌雄各半。所有小鼠均喂养于屏障环境(使用许可证号：SYXK(浙)2017-0010)(空气洁净度万级，换气次数1520次/h，温度2026，日温差臆4，相对湿度40%70%)，小鼠饲喂60Co-酌射线灭菌的营养配合饲料，饮用超滤水，笼器具、垫料等均经121 高压灭菌20 min。1.2主要试剂丹参水提醇沉药渣购自正大青春宝药 业 有 限 公 司；1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)购自北京索莱宝科技有限公司；维生素C(Vitamin C,VC)购自国药集团化学试剂有限公司；注射用CTX购自通化茂祥制药有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide Dis-mutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒均购自南 京 建 成 生 物 科 技 有 限 公 司；CD3-PE-Cy5、CD4-FITC、CD8-PE 单 克 隆 抗 体(MAb)均 购 自 BDPharmingen公司。1.3丹参多糖组分的制备将丹参醇沉药渣加去离子水至完全溶解后，5 000 r/min离心收集上清液，Sevag法脱蛋白至OD250nmOD280nm无明显吸收峰，活性炭脱色后通过不同孔径的中空纤维膜，超滤收集以下几部分：100 ku以上、50 ku100 ku、10 ku50 ku及10 ku以下共4个组分，真空浓缩，冻干后备用。1.4丹参多糖不同分子量组分体外抗氧化能力分析将4种丹参多糖不同分子量组分用去离子水溶解，配制成浓度为0.2 g/L1.2 g/L及0.15 g/L0.75 g/L的溶液，以同浓度VC作为阳性对照，参照参考文献10的方法进行DPPH自由基及超氧阴离子清除活性测定，参照参考文献11的方法进行总还原力及羟自由基清除活性的测定。1.5丹参多糖低分子量组分对CTX所致小鼠肝肾损伤与免疫抑制功能的影响60只ICR小鼠适应性喂养一周后分性别按体质量随机分为对照组、模型组(CTX注射组)、根据1.4的结果选用低分子量丹参多糖低、中、高剂量给药组(75 mg/kg、150 mg/kg、300 mg/kg)，每组12只，雌雄各半。除对照组外，其余各组腹腔注射CTX，剂量80 mg/kg，连续注射3 d后，对照组及模型组用生理盐水灌胃，给药组灌胃各剂量的丹参多糖低分子量组分，每周测定体质量，并根据体质量调整给药量，连续给药30 d。在实验过程中除对照组外，其余各组分别于第9 d11 d、19 d21 d再次每天腹腔注射剂量为80 mg/kg CTX强化免疫抑制。给药结束后小鼠禁食12 h左右，称重后麻醉采血。取部分血液置于抗凝管中用于T淋巴细胞亚群的分析，其余血液自然凝固后离心取血清。实验结束后剖杀各组小鼠取肝脏、肾脏、脾脏及胸腺，剥离外部脂肪和结缔组织，用吸水纸吸去表面的血液后称重，计算各脏器指数，即脏器的重量与小鼠体质量的比值。采用全自动血生化仪测定各组小鼠血清中谷丙转氨酶(Glutamicpyruvic transaminase，ALT)、谷草 转氨酶(Glutamicoxaloacetic transaminase，AST)、总 蛋 白(Total pro-tein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、球蛋白(Globu-lin，GLOB)、总胆红素(Total bilirubin，T-BIL)、血尿素(UREA)以及血肌酐(Creatinine，CREA)等生化指标。准确称取各组小鼠肝组织0.5 g，加入4.5 mL生理盐水捣碎匀浆，再用生理盐水稀释10倍，制成1%肝组织匀浆，按检测试剂盒说明书方法测定MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性。吸取各组小鼠抗凝血100 滋L加入到流式管中，分别加入稀释后的CD3-PE-Cy5、CD4-FITC、CD8-PE MAb各5 滋L混匀，避光室温孵育30 min。再加入稀释后的溶血素2 mL混匀，避光孵育10 min。1 200 r/min离心5 min，弃上清，用2 mL PBS缓冲液洗涤一次，再加入含1%多聚甲醛的PBS溶液0.5 mL混匀。采用流式细胞术检测小鼠外周血中的辅助性T细胞(CD3+CD4+)和 细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)的比例，并计算 二者比值(CD4+/CD8+)。1.6数据的统计与分析利用SPSS Statistics 19.0统计学软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，李巍，等.丹参多糖低分子量组分抗小鼠肝肾损伤及对其免疫保护作用机制的研究第 6 期637利用LSD 法进行各组实验数据的多重比较，0.05表示差异显著，0.01表示差异极显著12。2结果2.1丹参多糖不同分子量组分体外抗氧化能力的分析通过DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除率、羟自由基清除率及总还原力等4种主要体外抗氧化分析方法评价了丹参多糖不同分子量组分的体外抗氧化能力。结果显示，超滤分段收集的4个丹参多糖不同分子量组分在还原力、清除DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基等方面均有一定作用，其活性随着多糖浓度的增加而增强。在相同条件下，4种丹参多糖不同分子量组分的抗氧化能力大小为：100 ku以上组分50 ku100 ku组分10 ku50 ku组分小于10 ku组分，10 ku以下组分的总还原力能力甚至高于同浓度的阳性对照VC(图1)。这表明丹参多糖的抗氧化活性与其分子量大小有密切关系，分子量越小，作用越强。有研究表明丹参多糖组分主要集中在10 ku100 ku分子量区及10 ku以下分子量区两个部分。低分子量区组分呈单一相对分子量特征，相对分子量约为0.854 ku，该部分多糖组分粘度低，水溶性好，易被纯化13。因此，本研究选择丹参多糖低分子量组分(10 ku)进行后续试验。2.2丹参多糖低分子量组分对小鼠体质量的影响将体外抗氧化能力最强的丹参多糖低分子量组分(10 ku)以高中低3个剂量对小鼠灌胃给药，并设置对照组和模型组。结果显示，实验期间模型组及其它组小鼠饮水进食正常，大、小便无异常，在给定的CTX剂量内无死亡动物。但模型组小鼠出现精神沉郁，毛色不光亮等症状。与对照组相比，模型组小鼠注射CTX后体质量增量持续下降(0.05)(图2)。表明摄入适量的丹参多糖低分子量组分能有效地抵抗CTX所致的体质量增量的降低。2.3丹参多糖低分子量组分对小鼠脏器指数的影响脏器指数为脏器与体质量的比值，动物正常时该比值比较恒定。若脏器出现充血、水肿或增生等情况，脏器指数升高，若脏器萎缩或有其他退行性改变，脏器指数则降低。与对照组相比，模型组小鼠的肝脏、胸腺及脾脏的脏器指数均发生了显著变化。其中，其肝脏及脾脏指数极显著升高(0.01)，胸腺指数显著降低(0.05)。低剂量给药组可显著降低小鼠肝脏指数(0.05)，中、高剂量给药组可极显著降低小鼠肝脏指数(0.05)；给药组均能降低小鼠脾脏指数，高剂量给药组能使小鼠脾脏指数极显著降低(0.01)，但与对照组相比仍明显肿大(100ku10kuVC1008060402001008060402008060402001.61.20.80.401.21.00.80.60.40.200.150.300.450.600.7500.150.300.450.600.750.150.300.450.600.750BADC注：不同小写字母表示差异显著(0.05)；不同大写字母表示差异极显著(0.05)，下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference(0.05);Different capital letters indicate extremely significantdifference(0.05),the same as below.图2丹参多糖低分子量组分对小鼠体质量影响的测定结果Time/weekControl groupModel groupLow-dose groupMiddle-dose groupHigh-dose group42363024181260420aab bbbbbabab中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年638李巍，等.丹参多糖低分子量组分抗小鼠肝肾损伤及对其免疫保护作用机制的研究第 6 期639显著改善CTX引起小鼠的胸腺萎缩(0.05)。与对照组及模型组相比，所有给药组肾脏指数均未发生显著改变(0.05)(图3)。以上结果表明，摄入适量的丹参多糖低分子量组分可有效地缓解CTX引起小鼠的肝脾肿大及胸腺萎缩。2.4丹参多糖低分子量组分对小鼠肝肾功能生化指标的影响采用血生化仪对小鼠肝、肾功能主要血生化指标进行了分析。结果显示，与对照组比，模型组小鼠肝功能指标中血清TP、ALB极显著下降(0.01)；而AST及ALT极显著上升(0.01)，T-BIL有升高的趋势；与肾功能相关的指标CREA、UREA含量极显著下降(0.01)。给药组能明显改善CTX所致小鼠TP、ALB、AST、T-BIL、ALT、CREA、UREA等指标；其中高剂量给药组极显著降低AST、ALT(0.01)的含量，显著升高TP、ALB、UREA含量(0.05)，极显著升高CREA的含量(0.01)(图4)。表明摄入适量的丹参多糖低分子量组分能显著修复CTX所致小鼠损伤的肝肾功能。2.5丹参多糖低分子量组分对小鼠肝组织抗氧化指标的影响肝组织中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性及MDA含量能够反应机体的抗氧化水平。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝内SOD、CAT、GSH-Px活性 降低，MDA含 量 增 加。其 中GSH-Px活性显著下降(0.05)，CAT极显著 下降(0.01)，MDA显著上升(0.05)。与模型组比，给药组能明显升高小鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活性，降低小鼠肝脏MDA含量。其中高剂量给药组能极显著降低小鼠肝脏 MDA 含 量(0.01)，显 著 升 高 SOD，GSH-Px(0.01)和CAT(0.05)酶活性(图5)。这表明摄入适量的丹参多糖低分子量组分可以有效降低小鼠肝组织中脂质过氧化物的产生，可以增强SOD、CAT、GSH-Px酶的活性，进而有效改善肝组织抗氧化能力，这可能是其能够有效修复CTX所致小鼠肝损伤的重要原因。图3丹参多糖低分子量组分对小鼠脏器指数的影响876543210GroupsGroups2.01.61.20.80.40bAaGroupsGroups0.300.250.200.150.100.0501.00.80.60.40.20AAABbbbaacBaaabBABBBbbb图4丹参多糖低分子量组分对小鼠肝肾功能生化指标的影响GroupsGroupsGroupsGroups60504030201004030201001401201008060402003.02.52.01.51.00.50AAAaaBcBbcBbcBbBbABaABaaABabABaABCabBCbcCcGroupsGroupsGroupsGroups121086420108642050403020100201612840AAABBbbBbcBcBcaABaABbABabABabBCbcBCbcCcaa图5丹参多糖低分子量组分对小鼠肝组织抗氧化指标的影响图6丹参多糖低分子量组分对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响Groups6050403020100CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+/CD8+65432102.6丹参多糖低分子量组分对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响T淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫功能的重要指标。结果显示，与对照组比，模型组小鼠辅助性T细胞(CD3+CD4+)和细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)的比例及CD4+/CD8+T细胞比值均极显著降低(0.01)，表明CTX作用后能够有效抑制小鼠的T细胞增殖和改变T细胞分型的比例，细胞免疫受到明显的抑制。与模型组比，高剂量给药组可极显著提高CTX诱导小鼠外周血中辅助性T细胞的比例(0.05)；给药组细胞毒性T细胞的比例无显著变化(0.05)；高剂量给药组可极显著提高小鼠CD4+/CD8+T细胞的比值(0.05)(图6)。表明摄入适量的丹参多糖低分子量组分能够为小鼠提供较强的细胞免疫保护作用。3讨论免疫抑制是动物机体一种暂时或永久性免疫功能障碍的状态，是养殖业常见的临床病理现象。滥用药物、不良环境、病原微生物感染等多种因素均会引发养殖动物发生免疫抑制14。由于免疫系统受损，使养殖动物对病原体更加敏感。因此，抗生素在集约化养殖中被长期大量滥用，但随之而来的是病原菌的耐药性、食品安全等问题。我国与欧美等国相继全面禁止了抗生素在商品饲料中的使用，开发健康安全有效的饲用抗生素替代物已成为重要的研究方向之一15。近年来，饲用抗生素替代产品在市场上层出不穷，主要包括酸化剂、酶制剂、益生菌、益生元、抗菌肽、中药及其提取物等。其中中药及其提取物具有无残留、耐药性和毒副作用小、兼有营养和药用等优点，是目前临床研究最广的抗生素替代产品16。但中药及其提取物生产成本较高，不易在养殖业中广泛应用。中成药或中药提取物在生产过程中往往受加工目的、生产方法和工艺条件等因素的影响，中药成分提取不彻底，多种活性成分和营养物质仍然保留在药渣中17。合理开发中药渣作为畜牧生产的饲料资源，不仅能够减轻中药企业环保压力，且可达到变废为宝的目的。多糖是中药中广泛存在的主要活性成分之一，大量文献表明中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、改善机体肠道生态环境等多种显著药效18-19。作为饲料添加剂能够提高动物健康水平和生产性能。CTX是恶性肿瘤化疗中常用的药物之一，对多种癌症均有较好的疗效。但其可通过机体肝脏产生的炎性细胞因子和自由基诱导炎症级联反应和氧化应激，从而导致严重的肝损伤20。本研究通过实验开始即经腹腔注射CTX及中间强化注射两次的方法，可以使实验小鼠中的血清TP、ALB 极显著下降(0.01)，AST 及 ALT 极 显 著 上 升(0.01)，同 时T-BIL有升高的趋势。表明模型组小鼠肝脏功能受到严重的损伤。此外，模型组尿素极显著上升(0.01)、肌酐极显著下降(0.01)，表明CTX对肾脏也有明显的毒性作用。与对照组相比，模型组小鼠肝脏极显著肿大(0.05)，这表明CTX对肝脏的毒性作用可能更大，这与文献报道的CTX致小鼠肝肾组织及细胞病理损伤研究结果一致21。中、高剂量低分子量丹参多糖AaAaCcBbBbBbBbAaCcBCcBCcBCcBCbcABbABb中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年640bAaBABabAaCcABabABabABabABCbBCb1401201008060402002.11.81.51.20.90.60.30GroupsGroupsBBbbGroupsGroupsAaABaABabABabBbcBcBcAa4804003202401608003025201510501234李巍，等.丹参多糖低分子量组分抗小鼠肝肾损伤及对其免疫保护作用机制的研究第 6 期641给药组可极显著降低小鼠肝脏指数(0.01)，明显改善其血清TP、ALB、AST、ALT、UREA、CREA、T-BIL等指标，表明丹参多糖低分子量组分对肝、肾功能的损伤均有显著的修复作用。肝脏是动物体内生物氧化的主要场所，细胞在代谢过程中会产生大量的活性氧，导致脂质过氧化损伤周围组织细胞。MDA是活性氧诱导脂质过氧化的最终产物，其含量的变化反映肝细胞脂质过氧化程度。在正常生理状态时，自由基不断产生，通过SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶协同作用不断清除，从而保护机体免受自由基的氧化损伤22。但在用药或病理状态下，该平衡会有所改变。本研究中模型组肝内SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性下降，MDA含量显著升高，表明其体内发生了明显的脂质过氧化和抗氧化功能障碍。不同剂量的丹参多糖低分子组分能明显升高SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量。这些结果表明丹参多糖低分子组分能够有效清除肝细胞中的自由基，增强机体抗氧化能力，从而抵御和修复CTX对肝脏造成的损伤。CTX对机体的免疫性能也有广泛的影响，可显著抑制免疫器官、淋巴细胞及降低细胞因子和抗体产生23。因此常被用于建立实验动物免疫抑制模型，以研究药物对机体免疫功能的影响。目前多采用给药前一次性或多次腹腔注射CTX造模24，但研究表明由于试验动物自身修复作用造成的免疫抑制维持时间很难超过2周25，但对于起效周期较长的多糖类免疫调节物质的研究则需要选择一种效果明显、维持时间较长的免疫抑制模型，从而为机体免疫调节功能的评价提供更好的参考依据。本研究采用CTX诱导造模方法，模型组小鼠免疫器官指数、外周血中T细胞亚群均发生显著改变。免疫器官指数表现免疫器官的发育状况，间接反映机体的免疫状态。与对照组相比，模型组小鼠胸腺缩小，胸腺指数显著降低(0.05)，表明CTX对小鼠胸腺发育具有较强抑制作用。有研究发现CTX可引起脾脏萎缩26，但本实验研究中CTX则引起小鼠脾脏肿大，指数极显著升高(0.01)。这可能与CTX造模的方法、剂量及造模后小鼠脾脏采样时间等因素有关。芃高等以20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg CTX 5次隔日腹腔注射小鼠，首次注射后第10 d测定脾脏指数，结果显示低剂量组小鼠脾脏指数无显著变化，中剂量组小鼠脾脏指数显著低于对照组(0.05)，而高剂量组小鼠脾脏指数显著高于对照组(0.05)27。方秋月等连续3 d给小鼠腹腔注射CTX 100 mg/kg，17 d后 脾 脏 指 数 与 正 常 组 相 比 显 著 升 高(0.01)28。El-Naggar等一次性对小鼠腹腔注射CTX 200 mg/kg，12 d后脾脏指数与正常组相比显著升高(0.05)29。这些文献均表明在较大CTX剂量和较长时间条件下，脾脏受损后会代偿性增生而导致肿大。与模型组相比，高剂量给药组能使胸腺萎缩显著改善(0.05)和脾脏肿大极显著改善(0.01)，表明丹参多糖低分子量组分对由CTX引起的免疫器官损伤有明显的修复作用。以往文献报道丹参多糖能促进小鼠体内淋巴细胞的增殖、扩散、提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力，调节IFN-酌等细胞因子的基因表达30，在无巨噬细胞和B细胞的情况下，可以直接作用并促进T细胞的增殖31，从而提高机体的免疫作用。但丹参多糖对小鼠T细胞亚群的影响却鲜见报道。T细胞是体内重要的特异性免疫细胞，其亚群细胞的数量和比例的变化反应映机体免疫状态32。与对照组比，模型组小鼠CD3+CD4+和CD3+CD8+及其CD4+/CD8+比值均极显著降低(0.01)，表明该组小鼠细胞免疫反应受到明显的抑制。高剂量给药组可极显著提高CTX诱导 小鼠外 周血 中CD3+CD4+的 比 例 及 CD4+/CD8+的比值(0.01)，表明丹参多糖低分子量组份具有修复细胞免疫反应的作用。本研究利用4种主要体外抗氧化评价方法首次评估了丹参多糖不同分子量组分的体外抗氧化活性，发现丹参多糖低分子量组分(10 ku)具有较高的体外抗氧化作用，其通过抗氧化作用修复CTX所致肝肾损伤及免疫抑制，该结果为后期在动物生产中丹参类中药渣的应用提供了参考依据。参考文献：杜娟，杨小敏，周佳慧，等.丹参中各活性部位对心肌保护作用的对比评价J.中国药学杂志，2018，53(9)：690-694.马婧，陈茜，边亚倩，等.基于系统中药学的丹参活血化瘀功效标志物研究J.中国中药杂志，2020，45(14)：3259-3265.郭盛，段金廒，赵明，等.基于药材生产与深加工过程非药用部位及副产物开发替代抗生素饲用产品的可行性分析与研究实践J.中草药，2020，51(11)：2857-2862.戴新新，沈飞，宿树兰，等.酸碱预处理后酶解提升丹参药渣中丹参酮类成分的提取效率研究J.中国中药杂志，5678910111213141516171819202122232425262728293031322016，41(18)：3355-3360.韩文清，王涵，何媛媛，等.丹参药渣栽培糙皮侧耳和毛头鬼伞J.食用菌学报，2016，23(4)：20-23.JIANG YUAN,LI YA-BO,YU JUN,et al.Preliminary struc-ture and bioactivities of polysaccharide SMWP-U&E isolatedfromBunge residue J.Int J Biol Macro-mol,2020,157(15):434-443.李永明.丹参多糖的急性和亚急性毒性试验研究J.药学研究，2016，35(1)：16-18.王霄，秦姣姣，魏媛媛，等.丹参多糖对免疫性肝损伤小鼠肝脏凋亡因子的影响J.中国兽医学报，2019，39(10)：2047-2054.JIANG YUAN,WANG LONG,ZHANG LI,et al.Optimizationof extraction and antioxidant activity of polysaccharides fromBunge residue J.Int J Biol Macromol,2015,79:533-541.CHU LU-LU,YANG LI-CONG,LIN LE-ZHEN,et al.Chemi-cal composition,antioxidant activities of polysaccharide fromPine needle()and hypolipidemic effect inhigh-fat diet-induced mice J.Int J Biol Macromol,2019,125(15):445-452.CHEN FANG,HUANG GANG-LIANG,YANG ZHI-YUAN,etal.Antioxidant activity ofpolysaccharideand its derivatives J.Int J Biol Macromol,2019,138(1):673-680.曾丽，甘思言，杜蓥蓥，等.太子参参须多糖对小鼠OVA蛋白的免疫佐剂作用研究J.中国预防兽医学报，2022，44(6)：648-651.蔡亚平，赵蕊，朱丹.丹参多糖的组成分析J.中国实验方剂学杂志，2010，16(18)：88-90.HOSEINI,S M,YOUSEFI M.Beneficial effects of thyme(Thy-mus vulgaris)extract on oxytetracycline-induced stress response,immunosuppression,oxidative stress and enzymatic changes inrainbow trout(Oncorhynchus my kiss)J.Aquacult Nutr,2019,25(2):298-309.黄恩福，黄柳梅，阮记明，等.肠道菌群与中草药有效成分代谢的相互影响的研究进展J.中国兽医学报，2016，36(9)：1619-1623.陈天宝，蔡蔚游，梁鑫，等.中草药在养猪业替抗中的作用和应用J.猪业科学，2020，37(12)：98-101.刘倩，钟伟，杨雪，等.21种常用中药渣的营养价值分析及抑菌效果评价J.饲料研究，2022，45(12)：94-99.李晨旭，张才.中药多糖生