蛋黄中免疫球蛋白提取副产物的综合利用研究.pdf
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1、研究论文蛋黄中免疫球蛋白提取副产物的综合利用研究高净乐1.2.3顾璐萍12 3,常翠华12 3,李俊华12 3,(1.江南大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室,江苏无锡2 1412 2;2.江南大学国家功能食品工程技术研究中心,江苏无锡2 1412 2;3.江南大学食品学院,江苏无锡2 1412 2)摘要:以蛋黄免疫球蛋白提取后的副产物-冻融蛋黄颗粒(FYP)为原料,经酶解和亚临界萃取后制备具有良好功能特性与品质的低脂蛋黄粉和蛋黄油,以期实现蛋黄资源的综合利用。首先采用蛋白酶对已发生变性的FYP进行酶解,研究酶解对其功能性质的改善效果,进而采用亚临界萃取低脂蛋黄粉和副产物蛋黄油,以低脂蛋黄粉的
2、残油率为主要指标对萃取工艺进行优化,最终选择丙烷为萃取溶剂,萃取温度35,压力1.5MPa,时间12 0 min,料液质量体积比1g:7mL。进一步对低脂蛋黄粉的溶解性和乳化性等特性进行分析。结果表明,随着加酶量的增加,低脂蛋黄粉的溶解度上升,乳化性能提高,残油率明显下降。当加酶量为10 0 0 U/g时,低脂蛋黄粉的残油率为15.50%。而进一步增加酶添加量,反而会降低油脂萃取效率。因此,酶的最适添加量为10 0 0 U/g,此条件下制得的低脂蛋黄粉含脂量低且具有较好的溶解性和乳化性。关键词:冻融蛋黄颗粒;酶解;亚临界萃取;低脂蛋黄粉;功能性质中图分类号:TS201.1杨严俊1.2.3苏宇杰
3、*1,2.3文章编号:16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)10-0 0 7 3-10DOl:10.12441/spyswjs.20220317001Comprehensive Utilization of By-Products from ImmunoglobulinExtraction in Egg YolkGAO Jinglel.2.3,(1.State Key Laboratory of Food Science and Resources,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.NationalFunctional Food Engine
4、ering Technology Research Center,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Schoolof Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstract:The byproduct of yolk immunoglobulin,freeze-thaw egg yolk pellet(FYP),was used asraw material to prepare low-fat egg yolk powder and egg yolk o
5、il with desirable functional propertiesand quality through enzymatic hydrolysis and subcritical extraction,aiming to realize thecomprehensive utilization of egg yolk resources.Initially,denatured FYP was subjected to enzymatichydrolysis with alcalase,and the improvement of functional properties were
6、 investigated.Subsequently,subcritical extraction was employed to obtain low-fat egg yolk powder and thebyproduct(egg yolk oil).The extraction process was optimized primarily based on the residual oilrate of low-fat egg yolk powder.Propane was selected as the extraction solvent,and the optimalextrac
7、tion conditions were determined to be at extraction temperature of 35 C,pressure of 1.5 MPa,extraction time of 120 minutes,and solid-to-liquid ratio of 1 g:7 mL.Furthermore,the solubility and收稿日期:2 0 2 2-0 3-17*通信作者:苏宇杰(19 8 2 一),男,博士,副教授,硕士研究生导师,主要从事食品营养与功能食品研究。E-mail:s u y u j i e j i a n g n a n.
8、e d u.c nGU Lupingl.23,修回日期:2 0 2 2-0 5-0 6CHANG Cuihul23,LI Junhul-23,YANG Yamjun23,SU Yuje2.食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第10 期73RESEARCHARTICLEGAO Jingle,et al:ComprehensiveUtilization of By-Products fromImmunoglobulin Extraction in Egg Yolkemulsification of low-fat egg yolk powder were analyzed.The resu
9、lts demonstrated that the solubilityand emulsifying capacity of low-fat egg yolk powder increased with an increase in enzyme dosage,while the residual oil rate decreased significantly.At the enzyme dosage of 1 000 U/g,the residual oilrate of the low-fat egg yolk powder reached 15.50%.However,further
10、 increasing the enzyme dosageled to a decrease in oil extraction efficiency.Therefore,the optimal enzyme dosage was determinedto be 1 o00 U/g,where the low-fat egg yolk powder has reduced fat content and desirable solubilityand emulsifyingproperties.Keywords:freeze-thaw egg yolk pellet,enzymatic hyd
11、rolysis,subcritical extraction,low-fat egg yolkpowder,functional properties蛋黄中含有多种优质蛋白质,氨基酸配比均衡,消化率高达9 8%,生物学价值高达9 6,远远高于其他动植物性食物蛋白质的消化率和生物学价值!。此外,蛋黄中还含有免疫球蛋白(immunoglobulin ofegg yolk,IgY)、卵磷脂、卵黄高磷蛋白等活性成分,具有极高的营养价值。其中,IgY因具有良好抑菌活性以及廉价易得、不产生耐药性等优点,有望部分代替抗生素用于细菌感染性疾病的治疗及提高免疫力2 。与传统IgY提取方法相比,冻融-水稀释法3能
12、有效简化提取流程、提高产品纯度,因而成为一种极具应用前景的IgY提取新方法。然而,在冻融-水稀释法提取IgY过程中将会产生大量的副产物一冻融蛋黄颗粒(freeze-thaw egg yolk pellet,FYP)。FY P因经过冻融和高速剪切处理而发生严重变性,几乎丧失其原有的溶解性、乳化性等功能特性,无法直接用于食品加工,大大降低了蛋品的附加值。此外FYP中还含有丰富的蛋白质与脂质,具有极高的营养价值,若不加以利用而直接丢弃,势必造成蛋黄资源的严重浪费。因此,如何充分利用FYP成为IgY提取与蛋黄资源综合利用中一个巫待解决的课题。近年来,限制性酶解技术因能显著改善蛋白质功能性质而被广泛应用
13、于各种蛋白质原料,如大豆蛋白4、乳清蛋白5 蛋黄粉 等。Gu等发现限制性酶解可使大分子蛋白质分解为小分子的肽或氨基酸,从而提高蛋白质的溶解性;Bao等认为溶解性与蛋白质的其他功能性质密切相关,如乳化性等,并对碱性、中性及风味蛋白酶的水解效果进行了比较,结果表明碱性蛋白酶能更显著提高蛋白质的功能性质8。因而采用限制性酶解将有望改善FYP的溶解性及其他功能特性,拓宽其应用领域。此外,针对FYP不易保存的问题,可将经酶解74JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 10 2023后的FYP进行喷雾干燥处理,得到酶解蛋黄颗粒干粉(hy
14、drolyzed egg yolk pellet powder,HYP)。H Y P 水分含量低,在运输与保质期方面有显著优势。然而,其脂肪质量分数为50%6 0%,胆固醇质量分数为20 mg/g,这显然与目前大众追求的健康低脂消费观相违背。因此,选择合适的方法对HYP中的油脂进行分离,一方面可降低蛋黄颗粒中的脂质及胆固醇含量,有利于提高酶解蛋黄颗粒的消费者接受度、拓宽其应用范围,与此同时又可以制得副产品蛋黄油,进一步提高蛋黄综合利用率。目前,蛋黄粉中蛋黄油分离的方法主要包括有机溶剂法、酶法9、超临界萃取法、亚临界萃取法等。其中,超临界和亚临界萃取技术是2 种新型绿色油脂萃取技术,具有无溶剂残
15、留,提取率高,保护有益成分等优点o-I。且与超临界萃取技术相比,亚临界萃取成本更低,常温萃取、低温脱溶,易实现大规模工业化应用2。目前国内外对于采用亚临界萃取技术提取蛋黄粉中脂质的研究较少。作者以冻融-水稀释法提取蛋黄免疫球蛋白之后变性严重的冻融蛋黄颗粒副产物为原料,采用限制性酶解结合亚临界萃取技术,制得低脂蛋黄粉与副产物蛋黄油,对亚临界萃取工艺进行优化,并对产品性质进行研究,以期拓宽冻融蛋黄颗粒副产物的应用范围,进而为蛋黄资源的综合利用提供理论依据。材料与方法1.1材料与试剂新鲜鸡蛋和葵花籽油:购自江苏无锡超市;碱性蛋白酶:购自南宁庞博生物工程有限公司;邻苯二甲醛(OPA)1-4-二硫苏糖醇
16、(DTT):购自Sigma公司;其余化学试剂:均为分析纯,购于国药化学试研究论文高净乐,等:蛋黄中免疫球蛋白提取副产物的综合利用研究剂有限公司。1.2仪器与设备分析天平(AB204-N):梅特勒-托利多仪器公司产品;pH计:梅特勒-托利多仪器公司产品;喷雾干燥机(MOBILEMINOR):基伊埃工程技术(中国)有限公司;冷冻离心机(5430 R):德国Eppendorf公司产品;电热恒温鼓风干燥器(DGG-9240A):上海森信实验仪器有限公司产品;凯氏定氮仪(K9840):济南海能仪器股份有限公司产品;紫外分光光度计(UH5300):日本日立公司产品;高速剪切器(T25basic:德国IKA
17、公司产品;激光粒度分析仪(S3500):美国Microtrac公司产品;冷场发射扫描电子显微镜(SU8100):日本株式会社日立高新技术公司产品;CBE-5L亚临界流体萃取实验成套设备:河南省亚临界萃取设备工程技术研究中心产品。1.3实实验方法1.3.1冻融蛋黄颗粒(FYP)的制备参考王旭婷等3人提取IgY的方法并作适当修改,人工分离蛋黄和蛋清,并将蛋黄在吸水纸上小心滚动以去除表面残留蛋清。用镊子刺破蛋黄膜,收集蛋黄液,将其放置在(-18 2)的温度下冷冻8 h,之后在4的温度下解冻,得到蛋黄凝胶。将蛋黄凝胶与去离子水以质量比1:5混合,然后用高速剪切机以11000r/min剪切15s,再将混
18、合液以8 0 0 0 r/min的转速离心2 0 min,得到上清液为IgY粗提液,沉淀即为FYP。1.3.2酶解蛋黄颗粒干粉(HYP)的制备及成分分析将FYP与去离子水以质量比1:2 混合,2 5搅拌30min,使其混合均匀。预热至50,并用1mol/L的NaOH调节体系pH至8.0。加酶量分别为2 50、500、10 0 0 2 0 0 0 U/g,反应4h,酶解过程中用1mol/L的NaOH维持体系pH值恒定,用磁力搅拌器搅拌使FYP始终保持分散均匀。酶解过程中每隔0.5h取0.4mL的水解液,迅速用冰水浴冷却至室温,测定水解度(DH)。同样条件处理的未加酶组为对照组。反应结束后,迅速将
19、水解液用冰水浴冷却至室温,经喷雾干燥得到酶解蛋黄粉(HYP),喷雾干燥人口温度17 5 18 5,出口温度8 0 9 0,适当调整不同水解度水解液的干燥时的进出口温度,确保所得干燥产品的流动性基本接近,HYP在4下贮存。对制得的HYP成分进行测定,水分质量分数按照GB/T5009.3一2 0 16 中的第一法直接干燥法测定;蛋白质含量参照GB5009.5一2 0 16 中的凯氏定氮法进行测定;脂肪含量采用氯仿-甲醇改良法13测定;磷脂含量参照GB/T5537一2 0 0 8 中的钼蓝比色法进行测定,并做适当修改:为排除其他含磷物质的干扰,先提取总脂质,再测定磷脂含量;胆固醇含量按照Sun等14
20、 人的方法进行测定。1.3.3水解度(DH)的测定参照文献15 的方法对酶解过程中蛋白质的水解度(DH)进行测定。首先配置邻苯二甲醛(OPA)试剂,然后选用L-丝氨酸与OPA试剂反应制作标准曲线。将酶解物用去离子水稀释至4mg/mL,将40 0 L稀释液与3mLOPA试剂混合,反应2 min后用紫外分光光度计测定340nm处的吸光度。根据标准曲线和公式(1)计算蛋白质水解度DH:DH=h/htatx100式中:DH为水解度,%;h为每单位质量断裂的肽键质量摩尔浓度,mmol/g;hal为每单位质量的肽键质量摩尔浓度,mmol/gl7。1.3.4酶解蛋黄颗粒干粉(HYP)激光共聚焦分析参照Xu的
21、方法18 用激光共聚焦显微镜观察HYP的微观结构,并做适当修改。将对照组(未酶解)与HYP样品溶解在去离子水中(质量比1:2 0),室温下混匀5min。分别将尼罗红和尼罗蓝溶于质量分数0.1%丙酮中。脂肪用尼罗红染色,蛋白质用尼罗蓝染色。取10 L尼罗红和尼罗蓝溶液加人1mL样品溶液中,染色2 0 min,取2 0 uL样品涂布于显微镜载玻片上。蛋白质的分析模式:绿色荧光通道发射波长为48 8 nm,激发波长为50 0 59 5nm。油脂的分析模式:红色荧光通道发射波长为6 33nm,激发波长为6 49 7 8 0 nm。对焦后扫描并保存图像。1.3.5酶解蛋黄颗粒干粉(HYP)溶解度分析溶解
22、度的测定根据Tang等19 的方法并做适当修改,将1g样品和30 mL去离子水转移至50 mL离心管中,振荡5min,然后于8 0 0 0 r/min离心2 0 min,收集沉淀物,再加入30 mL去离子水,同样条件再次离心。最后将所有收集到的沉淀物于鼓风干燥箱中在105的温度下干燥8 h。以公式(2)计算蛋黄粉溶解度S。S=100-(m-m)100式中:S为溶解度,g;m为样品质量,g;m为沉淀及培养血总质量,g;m为培养血质量,g。食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第10 期(1)(2)75RESEARCHARTICLEGAO Jingle,etal:ComprehensiveU
23、tilizationof By-Products fromImmunoglobulin Extraction in Egg Yolk1.3.6酶解蛋黄颗粒干粉(HYP)乳化性分析采用比浊法测定样品的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)20。将HYP样品分散在去离子水中(2g/dL),室温下磁力搅拌1h。取30 mL样品溶液,加人10 mL葵花籽油,使用高速乳化器以110 0 0 r/min乳化1min。乳化后于0 min和10 min时分别从管底吸取10 0 L乳液移至10 mL的0.1g/dL十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中,然后在50 0 nm下测定稀释溶液的浊度。ESI值通过下
24、式计算:ESI=4o-10Ao-A10式中:ESI为乳化后立即测定的吸光度;A。和Aio分别为乳液在0、10 min时的吸光度。1.3.7亻低脂蛋黄粉制备工艺优化1)亚临界萃取溶剂选择分别选择丙烷或丁烷作为亚临界萃取溶剂,制备蛋黄油与低脂酶解蛋黄粉,以萃取后低脂酶解蛋黄粉中残油率为指标,选择最佳萃取溶剂。具体制备工艺如下:亚临界丙烷萃取:称取适量HYP样品,用150目尼龙纱布袋分装,置于萃取罐,通过设备流量阀送人一定体积丙烷,萃取压力1.1MPa,萃取温度35,每次萃取40 min,重复萃取3次。然后减压脱溶,从分离罐底部收集萃取得到的蛋黄油,离心后取上清液置于4冰箱待分析。从萃取罐内收集剩余
25、低脂酶解蛋黄粉用于进一步分析。亚临界丁烷萃取:称取适量HYP样品,用150目尼龙纱布袋分装,置于萃取罐(与丙烷相同),通过设备流量阀送人一定体积丁烷,萃取压力0.46MPa,萃取温度45,每次萃取40 min,重复萃取3次。后续操作与上述丙烷相同。2)亚临界萃取工艺优化最终选用丙烷作为萃取溶剂,以萃取后低脂酶解蛋黄粉中残油率为指标,对萃取温度、萃取压力、萃取时间、料液质量体积比等可调工艺参数进行优化。萃取温度:分别将萃取温度设定为2 5、30、35、40、45,萃取压力1.5MPa,萃取时间12 0 min,按照料液质量体积比1g:9mL加入亚临界丙烷溶剂进行萃取。萃取压力:分别将萃取压力设定
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