大肠杆菌噬菌体的分离、生物学特性及初步应用.pdf

年 月第 卷第 期中 国 渔 业 质 量 与 标 准 ：大肠杆菌噬菌体的分离、生物学特性及初步应用张明，寇文利，张国清，董浩，张永勤，宋钢，张德福，励建荣（渤海大学食品科学与工程学院，渤海大学海洋研究院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 ；锦州市农业农村综合服务中心水产技术推广站，辽宁 锦州 ；山东美佳集团有限公司，山东 日照 ；锦州市龙海馨港科技有限公司，辽宁 锦州 ；凌海市达莲海珍品养殖有限责任公司，辽宁 锦州 ）摘要：本研究以大肠杆菌 为宿主菌，从生活污水中分离到一株大肠杆菌噬菌体，并命名为 ，进一步分析了该噬菌体对温度和 的稳定性、对紫外线和氯仿的敏感性，测定了最佳感染复数及一步生长曲线，最后进行了清除污水中大肠杆菌的初步应用。结果表明，的效价为 ，对 以及氯仿的耐受性较强，但对温度和紫外线较敏感，以上时滴度有明显的下降，经紫外线照射 后便丧失对宿主菌的裂解能力。该噬菌体最佳感染复数是 ，潜伏期为 ，暴发期为 ，暴发量为 。对宿主菌的清除实验表明，在 内对宿主菌有较好的抑制作用，后实验组的 值逐渐升高，但始终远低于对照组值，说明该噬菌体对宿主菌具有一定的裂解效果，但不能将宿主菌完全裂解。污水经 处理 后菌落总数和大肠杆菌数均有明显的下降，说明该噬菌体有较好的抑菌效果。综上可知，的效价较高，对大肠杆菌的去除效果较好，具有作为大肠杆菌生物清除剂的应用潜能。中国渔业质量与标准，（）：关键词：大肠杆菌；噬菌体；分离；生物学特性中图分类号：文献标志码：文章编号：（）收稿日期：；接收日期：资助项目：国家自然科学基金（）；国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（）第一作者：张明和寇文利对本项工作贡献相同。张明（），女，硕士，实验师，主要研究方向为食品贮藏与加工，：；寇文利（），女，硕士研究生，主要研究方向为食品质量与安全控制，：通信作者：张德福，副教授，主要研究方向为食品质量与安全控制，：；励建荣，教授，主要研究方向为生鲜食品贮藏与加工，：大肠杆菌（）是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，是广泛分布在自然界及人和动物肠道中的条件致病菌。一般情况下人和动物的肠道中的大肠杆菌不具有致病性，而且可以抑制肠道其他细菌生长，在维持肠道内环境平衡中发挥着重要作用 。但是，在特殊情况下，比如食用了被致病性大肠杆菌污染的食物，可引起胃肠道疾病，严重威胁着人与动物的健康 。临床及养殖业中通常使用抗菌药物应对大肠杆菌引起的感染，甚至将部分抗菌药物作为添加剂应用于饲料中，但抗菌药物的长期不规范使用既导致动物性食品中药物的残留，还会导致耐药性细菌的产生 ，。耐药菌携带的耐药基因不仅可以垂直传播，还可以在细菌间水平转移，造成耐药基因的播散，使得细菌的耐药性问题日益严重，给细菌性疾病的防控与治疗带来了极大困难 。噬菌体是一类可以感染细菌、真菌、放线菌或螺旋菌等微生物的病毒 。噬菌体可以特异性地识别、感染宿主菌，并利用宿主菌体内的游离氨基酸、能量及转录系统等完成自身核酸复制与组装，然后裂解宿主菌，释放出子代噬菌体 。世纪初，和 先后发现了噬菌体，掀起了一股噬菌体研究的热潮 。但不久之后，由于青霉素等抗生素的发现及其杀菌谱广、稳定性好、易于大规模生产等优点，许多科学家停止了噬菌体相关的研究，转而关注抗菌药物的研发 ，。由于近几十年来耐药菌的大量出现及新药研发困难、成本高等原因，噬菌体因特异性强、专一性好、不影响其他正常菌群等优点而再次成为研究热点 ，。噬菌体降解产物只含有核苷酸和氨基酸，不含其他有害物质，安全性高，而且噬菌体不仅广泛存在于自然界中，也存在中 国 渔 业 质 量 与 标 准 年于人体器官组织中，一般对人体无害 。这些优势使得噬菌体有望补充或替代抗菌药物，成为新型抗菌剂 。材料与方法 材料与仪器样品来源：渤海大学松山校区一餐厅下水道；宿主菌：实验室保存的分离自食品的 。肉汤培养基、琼脂培养基、琼脂粉：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；一次性针式过滤器：、，上海兴亚净化材料厂；氯化钠：福晨（天津）化学试剂有限公司；明胶：国药集团化学试剂有限公司；：北京索莱宝科技有限公司。立式自动压力蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；小型台式高速离心机：德国 公司；电热恒温水槽：上海精宏试验设备有限公司；酶标仪：美国 公司；生化培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂。方法 菌悬液的制备将 冻存的大肠杆菌 解冻，用接种环挑取一环划线接种在 固体培养基上，过夜培养。挑取平板上的单克隆菌落接种于 肉汤培养基中，、振荡过夜培养。培养的菌液存放于 冰箱备用。噬菌体的分离纯化从下水道采集污水 ，静置 ，将上层液体 离心 。取 离心后的上清液经 滤膜过滤除菌，与 大肠杆菌悬液共同置于无菌锥形瓶中。加入 无菌 肉汤培养基，、振荡过夜培养。取培养液 离心 ，滤膜过滤上清，滤液即为噬菌体原液。取 菌悬液和 噬菌体原液混匀，静置 后与 、的 半固体培养基混匀，倒入配置好的琼脂固体培养基中，制成双层琼脂平板，过夜培养。挑取大小均一、圆形透明的单个噬菌斑在 液中混匀，静置过夜后取 进行 倍系列梯度稀释，制成双层琼脂平板。重复上述过程 次以上，直至平板上出现大小和形态较为均一的噬菌斑。噬菌体的大量增殖将纯化后的噬菌体液和处于对数期的大肠杆菌悬液按一定比例混合，静置 ，加入 液体培养基，、振荡培养过夜，离心 ，用 滤膜过滤除菌，得到的滤液即为噬菌体增殖液，置于 冰箱保存备用。噬菌体微观形态观察向噬菌体增殖液中加入 的 和 ，静置过夜后 离心 ，弃上清液，加入 缓冲液重悬沉淀，吹打混匀后获得噬菌体浓缩液。将 目的铜网浸没在噬菌体浓缩液中吸附 ，室温晾干 ，使用 的乙酸铀染色 ，用滤纸吸去多余水分。将处理后的铜网用透射电子显微镜观察。噬菌体效价测定本研究采用双层平板法测定噬菌体的效价。取 噬菌体增殖液用 液进行 倍系列梯度稀释，每个梯度做 个平行对照，再与 宿主菌悬液混匀，静置 ，配制成双层琼脂平板，静置过夜培养。计数平板上的噬菌斑，每个梯度的噬菌斑数取 个平行板的平均值，以下述公式计算噬菌体效价：噬菌体效价（）噬菌斑数 稀释倍数 式（）噬菌体热稳定性的测定取 效价为 的噬菌体增殖液分别于 、及 水浴锅中孵育 和 ，测定效价。噬菌体 稳定性的测定取 的 液体培养基，将 分别调为、，置于 水浴锅中孵育 ，加入 噬菌体增殖液，继续置于 水浴锅中作用 ，测定效价。噬菌体最佳感染复数的测定将初始浓度为 的大肠杆菌 被不同数量的噬菌体感染，裂解周期结束后产生子代噬菌体最多时的噬菌体与细菌的数量比例即为噬菌体最佳感染复数（，）。以 值分别为 、和 对宿主菌进行第 期张明，等：大肠杆菌噬菌体的分离、生物学特性及初步应用研究感染，、培养 ，测定效价。噬菌体一步生长曲线的测定按照最佳 比例，将噬菌体与处于对数生长期的宿主菌混合，、振荡培养，分别在、和 时间点取样，经 离心 ，取上清液测定噬菌体效价。噬菌体对紫外线和氯仿敏感性的测定取 的噬菌体增殖液于无菌培养皿中，放在距离紫外灯 处，每隔、和 取 于无菌离心管中，置于黑暗处 后，加入处于对数生长期的宿主菌，、培养 ，测其 值。同时设置不加噬菌体对照组。取 噬菌体增殖液，加入 氯仿（对照组用液体培养基代替氯仿），充分混匀后 静置过夜，倍系列梯度稀释后测定效价。噬菌体抑菌实验为观察噬菌体对大肠杆菌的清除效果，将噬菌体和宿主菌按照最佳感染复数的比例混合，置于 振荡培养，每隔 用酶标仪测定混合液的 值。噬菌体处理生活污水中的大肠杆菌采集生活污水，静置过夜，待杂质沉淀完全，取 上层液体于无菌锥形瓶中，从中取出 作为处理前对照组样品，在剩余的液体中加入 噬菌体液混匀，常温静置 后取样。对照组和实验组样品 倍梯度稀释，每个梯度取 分别涂布在 固体培养基和 固体培养基上，静置培养过夜。根据 固体培养基上所有菌落数计算菌落总数，固体培养基上符合以下特征的所有菌落均计为大肠杆菌数：（）紫黑色、不带或略带金属光泽；（）淡紫红色、中心颜色较深；（）深紫黑色、有金属光泽。将对生活污水处理前后的菌落总数及大肠杆菌数进行比较，观察噬菌体对污水中大肠杆菌的清除效果。结果与分析 噬菌体的形态和效价以 作为宿主菌，从生活污水中分离到一株噬菌体，命名为 。纯化 次后得到边缘整齐、圆形、透明、大小和形态均一的噬菌斑，其直径最高可达 （如图 所示）。经透射电镜观察发现（图 箭头所示），可见 头部直径约为 ，有较短的尾部结构。参考国际病毒分类委员会（，）最新发布的标准分类（：），推测噬菌体 属于有尾噬菌体目（）中的短尾噬菌体科（）。经液体法增殖后，计算其效价为 。图 的噬菌斑（）和微观形态（）（）（）噬菌体热稳定性的测定热稳定性的测定结果如表 所示。时噬菌体仍然保持原来的活性；时，效价为 以上；时，效价随着温度的升高而降低，且作用时间越长，降低越明显；时，效价降为 ，噬菌体失活。噬菌体 稳定性的测定 稳定性的测定结果如图 所示。值在 、和 时，噬菌体失活，所对应的效价为 ；值为 时，效价稳定维持在 。因此，的最适生长 范围为 。噬菌体最佳感染复数（）的测定 的测定结果如表 所示。在 组不同感染复数的实验组中，当 时，噬菌体的效价达到最高值，为 ，因此噬菌体的最佳 值为 。噬菌体一步生长曲线的测定一步生长曲线的测定结果如图 所示。噬菌体的潜伏期大约 ，此时噬菌体的数量基本保持不变；在 期间，噬菌体的数量大幅上升，为暴发期，噬菌体的暴发量为 ，随后进入稳定期。中 国 渔 业 质 量 与 标 准 年表 温度对噬菌体 效价的影响 温度 初始效价（）效价（）效价（）图 对噬菌体 效价的影响 噬菌体对紫外线和氯仿敏感性的测定噬菌体对紫外线的敏感性测定结果如图 所示。噬菌体原液在紫外线照射的 内，对照组 值大于实验组 值，且二者差值逐渐缩小，说明噬菌体经紫外线照射后还可以继续保持活性。但随着照射时间的延长，噬菌体活性逐渐降低；后，对照组与实验组的 值基本保持一致，波动不大，说明噬菌体失活，丧失了裂解细菌的能力。由于氯仿通常用于噬菌体 基因组的提取，而且其能溶解脂溶性物质，因此对 进行了氯仿敏感性测定。实验结果表明，噬菌体在加入氯仿前后其效价几乎保持不变，说明 对氯仿不敏感。表 最佳感染复数的测定 噬菌体最佳感染复数 细菌数量（）噬菌体数量（）噬菌体效价（）第 期张明，等：大肠杆菌噬菌体的分离、生物学特性及初步应用研究图 的一步生长曲线 图 紫外线对噬菌体 效价的影响 噬菌体体外抑菌实验体外抑菌实验结果如图 所示。阳性对照组（组）值呈指数上升，而实验组（组）在 内的 值基本维持在较低水平，说明噬菌体对大肠杆菌在初始的 内有较好的抑制作用；后，实验组的 值逐渐升高，但仍远小于对照组 值，说明该噬菌体对宿主菌的裂解能力较好，但是不能完全裂解。图 噬菌体 对大肠杆菌 的体外抑制曲线 噬菌体处理生活污水中的大肠杆菌生活污水经效价为 的 处理 后，菌落总数和大肠杆菌数均有明显的下降，其中菌落总数降低了 ，大肠杆菌数降低了 （表 ），说明该噬菌体对生活污水中的大肠杆菌具有一定的裂解效果。表 噬菌体 的杀菌结果 噬菌体滤液效价（）菌落总数（）处理前 处理后 菌落总数降低比例 大肠杆菌数（）处理前 处理后 大肠杆菌数降低比例 讨论当前细菌耐药的问题日益严重，多药耐药菌的出现使得可供人们选择的抗菌药物越来越少，而开发新型的抗菌制剂尤为艰难，需要投入大量的时间和资金，并且不能保证研发的成功率，因此找寻新的抗菌剂势在必行 ，。噬菌体作为一类能够特异性感染细菌的病毒，在自然界中分布广泛，种类繁多 ，。与抗菌药物相比，噬菌体能够靶向裂解宿中 国 渔 业 质 量 与 标 准 年主菌，专一性强，且不易产生耐药性，使用安全，而且生产成本低、研究周期短，是理想的抗菌剂 ，。对于噬菌体清除宿主菌而言，效价越高效果越好，而且 和热稳定性也是影响噬菌体裂解活性的重要 因 素。本 研 究 从 污 水 中 分 离 的 噬 菌 体 效价高达 ，而且在 时具有较高的活性，效价保持在 以上，耐热性优于杨慧敏等 分离到的噬菌体 ，其在 作用 噬菌体全部失活。而且，在 为 范围内活性比较稳定，优于赵尊福等 分离到的噬菌体 ，其最适 值为 。综合来看，本研究分离的 的热稳定性和 稳定性较好。最佳感染复数低、潜伏期短、暴发量大的噬菌体杀菌效 率 更 高，生 产 成 本 更 为 低 廉 。噬 菌 体 与王海磊等 分离到的噬菌体 （最佳 为 ）和吴圆圆 分离的噬菌体 相比，的潜伏期为 ，暴发期为 ，暴发量为 ，的最佳感染复数更低，潜伏期更短，暴发量更多，具有更好的应用前景。为应对水资源短缺的问题，人们将污水再生处理后用于日常生活。但目前的污水处理工艺无法完全去除致病菌，尤其大肠杆菌在污水中居多，作为条件致病菌严重威胁着人类健康，因此需要更有效的方法处理污水 。噬菌体作为细菌的天敌，在污水微生物菌群中广泛存在，具有来源广、特异性强、安全性高等优点，是污水处理较为理想的选择 。徐焰等 分离的大肠杆菌噬菌体 和 对环境水样本中的大肠杆菌杀灭率分别为 和 。郭秋菊等 报道的大肠杆菌噬菌体对污水处理后，菌落总数下降了 。陈海阳等 利用广谱噬菌体 处理生活污水，菌落总数降低了 。本研究中分离的大肠杆菌噬菌体 处理后的生活污水中菌落总数降低了 ，大肠杆菌数降低了 ，效果优于上述多个噬菌体。本研究分离的 对大肠杆菌具有较好的裂解效果，虽不能完全裂解，但可以利用噬菌体“鸡尾酒”疗法来解决该问题。此法是将具有不同宿主谱的多种噬菌体进行混合、共同杀菌，不仅使得宿主谱的范围更广，杀菌能力更强，还能降低耐受菌的产生 。除此之外，还可以通过对噬菌体进行改造，比如噬菌体尾丝蛋白的改造，扩大噬菌体的宿主谱，提高噬菌体对大肠杆菌的清除效果 。因此，噬菌体特异性强、安全性高、成本低及来源广泛等优势，将在污水处理领域中有着良好的应用前景。参考文献：，（），（），（）：，：，：，：，（）：龚梦馨，李明源噬菌体在水产养殖中治疗细菌感染的研究进展和挑战 海洋科学，（）：，：，：，：马迎飞，王冉，童贻刚噬菌体：微小却不简单 微生物学通报，（）：，（）：，：，（）：，第 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