雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞增殖及牙向_骨向分化能力的影响.pdf

文章编号（）雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞增殖及牙向 骨向分化能力的影响李瑶，曹灵，夏涵，周俊波（南京市中西医结合医院口腔科，江苏 南京；南京医科大学江苏省口腔疾病研究重点实验室，江苏 南京；南京医科大学附属口腔医院儿童口腔预防科，江苏省口腔疾病研究重点实验室，江苏省口腔转化医学工程研究中心，江苏 南京）摘要 目的：探讨雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞（）增殖及牙向 骨向分化能力的影响。方法：选取 只 周龄雌性 大鼠随机分为假手术（）组和卵巢去势（）组，每组各 只。全麻下 组摘除双侧卵巢，组行相同切口保留双侧卵巢，术前、术后 个月分别检测两组大鼠血清雌二醇水平。个月后每组各处死 只大鼠，分离切牙根尖牙乳头组织，酶消化法分离培养两组，采用、碱性磷酸酶（）活性检测、实时荧光定量、检测雌激素缺乏对大鼠 增殖及成牙 成骨向分化能力的影响。将两组 细胞以明胶海绵为载体分别植入对应组别大鼠肾被膜下，周后取出植入组织，使用数字化 线牙片机对取出团块曝光成像及 染色观察其矿化能力。结果：组大鼠去势 个月后血清雌二醇水平显著低于术前（），组大鼠血清雌二醇水平术前、术后差异无统计学意义（）。结果显示，组 增殖能力显著下降（）。活性检测结果显示，组 的 活性低于 组（）。实时荧光定量 和 结果均表明 组 的牙本质涎磷蛋白（）、成骨细胞特异性转录因子（）、骨钙素（）等成牙 成骨相关基因和蛋白表达低于 组（）。体内移植结果显示，组形成密度较高的较规则牙髓牙本质复合体，而 组形成不规则结构。结论：雌激素缺乏减弱大鼠 的增殖及牙向 骨向分化能力。关键词 雌激素；根尖牙乳头干细胞；增殖；牙向 骨向分化中图分类号 文献标识码 基金项目：国家自然科学基金（，）通信作者：周俊波，：，（，；，；，）：，：（）：，（）（），（），（），（）：（），（）（）（）（），口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），（），（）（），：；根尖牙乳头干细胞（，）是一种组织工程牙再生种子细胞，该细胞是从牙乳头组织中分离出来的一种干细胞，具有自我更新、多向分化的能力，属于多能成体干细胞，在牙根的发育和形成中起重要作用。有研究证实，在感染环境中仍可存在，具有较强的抗感染能力、增殖活性和牙本质形成能力。将 和羟基磷灰石 磷酸三钙支架材料共同移植到免疫抑制小鼠体内，在支架材料表面可形成典型的牙本质结构，并和支架材料间有连接组织相连。将 和牙周膜干细胞重组后复合支架材料植入小型猪下颌骨，可成功构建生物学牙根结构。可见 在一定条件下能分化为牙本质，如何促进 的成牙本质能力是诱导牙根发育和牙再生的关键因素。多项研究证实 在体外培养时，多种因素可影响其矿化能力，如胰岛素样生长因子（，）、肝细胞生长因子（，）、肿瘤坏死因子（，）、转化生长因子（，）、无机三氧化物聚合体等。雌激素主要由卵巢和胎盘产生，对哺乳动物多种组织的生长、发育及成熟有重要作用，是调控性成熟和骨代谢的重要激素。有文献报道，绝经期妇女由于雌激素缺乏引起骨质疏松症，导致骨密度下降甚至骨折。雌激素缺乏也可导致一系列口腔相关疾病的发生，如牙周组织破坏、拔牙创愈合延迟、种植体与颌骨结合减缓、正畸牙根吸收等。前期研究证实，雌激素缺乏的大鼠切牙密度及钙离子含量均比正常大鼠低，且牙本质层变薄。卵巢去势后大鼠牙髓干细胞、骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化能力都明显降低。作为参与牙根发育、牙再生与组织再生的重要细胞，雌激素缺乏引起的这些改变，是否与 的成牙 成骨分化能力改变有关，值得进一步探讨。本研究建立大鼠雌激素缺乏模型，通过体外和体内移植实验，探讨雌激素缺乏对大鼠 增殖及成牙 成骨向分化能力的影响。材料与方法 实验动物和材料 周龄 级雌性健康 大鼠 只，体质量（），由南京医科大学实验动物中心提供。培养基、青霉素 链霉素双抗、胰蛋白酶（，美国），型胶原酶、分散酶（，美国），大鼠雌二醇 试剂盒（北京伊莱瑞），甲基噻唑基四唑（，）试剂盒、二甲基亚砜（，）（，美国），碱性磷酸酶（，）检测试剂盒（，美国），（，美国），逆转录试剂盒、定量 酶混合物试剂盒（，日本），引物（上海生工），牙本质涎蛋白（，）抗体（，美国），成骨细胞特异性转录因子（）抗体、骨钙素（，）抗体（，英国），抗体（，美国），辣根过氧化物酶标记二抗（北京中杉金桥），苏木素伊红（，）染色试剂盒（北京索莱宝），明胶海绵（北京康特威尔登特）。方法 实验分组与造模取 只 周龄雌性 大鼠随机分为两组：去势（）组和假手术（）组，每组 只；其中每组 只大鼠用于 分离培养，另 只用于体内移植。组：大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠溶液（）麻醉后俯卧固定于手术台，于背腰部中线术区备皮，常规消毒铺巾，纵向切开皮肤，于腰肌与肋缘相交处剪开肌肉，以丝线结扎卵巢下端输卵管，完整摘除两侧卵巢，分层缝合肌肉、皮肤。组：手术方法同 组，但不去除卵巢。术后自由饮食、饮水。研究方案经南京医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理号：）。大鼠血清雌二醇浓度检测手术前将大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠溶液（）全麻下用微量取样器心脏取血，下 离心 ，取上清液，用雌二醇试剂盒检测大鼠血清雌二醇浓度。另外，术后 个月同法检测。分离培养术后 个月每组随机选取 只大鼠，脱颈处死，无菌条件下分离大鼠下颌骨，将其转移到超净台中，李瑶，等雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞增殖及牙向 骨向分化能力的影响生理盐水冲洗，于体视显微镜下挑取切牙根尖牙乳头组织用于后续实验。将大鼠根尖牙乳头组织用含双抗的 的磷酸盐缓冲液浸洗，用眼科剪剪碎至 大小，将剪碎的组织放置在 的型胶原酶和 的分散酶中，消化；加入 含双抗和胎牛血清的 培养基，吹打均匀后接种于底面积为 培养瓶内，置于 、细胞培养箱内培养；次日换液去除悬浮细胞；每 换液 次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况；待细胞达 融合时，胰蛋白酶消化后以 比例传代，取第 代细胞用于后续实验。检测将两组 细胞以密度为 个 孔接种于 孔板，贴壁后换液，每组 个复孔。继续培养、后，加入 的，、孵育 ；弃去培养液，加入 ，将培养板置于微孔板振荡器上振荡 ；待紫色结晶体完全溶解后，酶标仪检测波长 各孔光密度（，）值。活性检测将两组 以密度 个 孔接种于 孔板，贴壁后换液，每组 个复孔。继续培养、后，弃上清液，加 裂解液 ，孵育 ，待细胞形态完全消失后，按照 检测试剂盒说明，使用酶标仪检测 处 值，实验重复 次。实时荧光定量 将第 代 培养 后，收集两组细胞，加入 ，提取细胞，利用逆转录试剂盒将 逆转录为，使用 定量 酶混合物试剂盒和 仪器进行 反应。反应条件如下：，个循环，。以 作为内参，通过 方法计算牙本质涎磷蛋白（，）、等成牙 成骨相关基因的相对表达量，引物序列见表。检测将 培养 后，收集两组细胞，提取细胞总蛋白，测定浓度。取 细胞总蛋白进行 凝胶电泳，湿转至 膜，封闭，孵育一抗（）、（）、（）、（），然后孵育二抗（），洗膜，加入化学发光底物，系统曝光，软件定量分析。表 引物序列及 产物大小 基因名称引物序列（）产物大小：体内移植取 中 只 大鼠和 只 大鼠用于 体内移植实验。收集已分离培养的两组（个 团），将细胞团块轻柔地放置在可吸收明胶海绵上（），然后植入对应组别大鼠双侧肾被膜下，周后取出植入物，使用数字化 线牙片机对取出团块曝光成像，、条件下曝光，焦距 。随后 多聚甲醛固定、脱钙、染色，显微镜下观察拍照。统计学分析 统计软件进行统计学分析，定量结果以均值标准差表示，两组之间数值比较采用独立样本 检验，为差异具有统计学意义。结 果 组大鼠血清雌二醇浓度降低卵巢去势手术前，两组大鼠血清雌二醇浓度差异无统计学意义（）；术后 个月，组大鼠体内雌二醇水平低于 组，差异有统计学意义（）。组大鼠体内雌二醇浓度术前术后相比差异无统计学意义（），组术后 个月大鼠体内雌二醇水平显著低于术前（）（图）。：与同组术前比较，；：与术前 个月 组比较，。图 血清雌二醇浓度比较 组 细胞散在疏松排列口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），显微镜下观察：两组 均贴壁生长，形态呈梭形、纺锤形或星形。原代细胞较为短小，传至第 到 代细胞增大，生长状态较好，核分裂向多见。不同的是，组 生长较密集，呈旋涡状或放射状排列，而 组 生长较为疏松，相同视野下细胞数量少于 组（图）。：组；：组。图 两组 镜下图 组 增殖能力减弱 结果显示：在培养第 天，两组 的 值差异无统计学意义（）；组 细胞在、的 值均低于 组，差异有统计学意义（），两组 在第 天都进入生长平台期（图）。：与 组比较，。图 两组大鼠 生长曲线比较 组 活性降低 结果显示：在第 天及第 天时，组 的 活性均低于 组，差异具有统计学意义（，图）。组 牙向 骨向分化相关基因和蛋白表达降低实时荧光定量 检测结果显示：组 的、基因的相对表达量均低于 组，差异具有统计学意义（，图）。结果显示：组 的成牙 成骨相关蛋白（、）的蛋白条带明显较浅，蛋白表达均低于 组，差异具有统计学意义（，图、）。：与 组比较，。图 两组大鼠 活性比较 ：成牙 成骨向分化基因的表达；、：成牙 成骨向分化蛋白电泳图及定量分析；、：与 组比较，、。图 两组大鼠 成牙 成骨向分化基因和蛋白表达 组 体内移植未形成规则的牙髓牙本质复合体以可吸收明胶海绵为载体将两组 进行肾被膜移植后，周后取出移植团块，线片显示：组可见牙冠样高密度影像，组未见高密度影像；染色显示：组有较规则的牙髓牙本质复合体形成，牙本质样结构中牙本质小管规律排列，包绕富含细胞的牙髓样组织，而 组中观察到 细胞散在于基质中，未形成规则结构（图）。李瑶，等雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞增殖及牙向 骨向分化能力的影响：组 线片，黄色箭头指示高密度影像；：组 线片；：组 图片（）；：组 图片（）。图 两组大鼠 体内移植结果 讨 论雌激素在调控骨代谢过程中发挥重要作用。研究表明，更年期妇女绝经后体内雌激素水平降低，引起成骨细胞凋亡、破骨细胞数目和活性增高，破坏骨形成与骨丧失平衡，进而降低骨密度，导致骨质疏松。牙槽骨作为骨组织的一部分，其骨代谢也受雌激素水平的影响。近年来有研究显示，绝经后骨质疏松女性牙槽骨密度、牙槽骨高度、牙齿数目低于骨密度正常者，附着丧失增加，提示雌激素缺乏是骨质疏松和慢性牙周炎的共同危险因素。大鼠卵巢去势后，正畸牙移动速度明显变快，牙齿移动距离增加，牙根炎性吸收增多，说明雌激素缺乏状态下骨改建更活跃。王斌等发现 岁月经初潮的女性正畸患者在月经周期（雌激素水平低）牙齿移动距离大于排卵期（雌激素水平高），不同生理周期雌激素分泌量差异导致正畸牙移动速率和距离发生相应改变，提示雌激素水平的改变影响骨改建的动态平衡。王燕萍等发现雌激素缺乏时，大鼠牙髓干细胞增殖能力、活性、成骨分化低于正常牙髓干细胞。等研究表明去势大鼠牙周膜干细胞的成骨分化能力下降、活性及 表达降低、矿化结节形成减少。以上研究提示雌激素水平不仅影响了牙源性干细胞的分化能力，也与口腔疾病的发生、发展和治疗密切相关。前期研究表明雌激素缺乏的大鼠颌骨密度下降，切牙硬度降低，而 参与牙齿硬组织形成，为验证这一改变是否与 相关，建立雌激素缺乏的大鼠模型，以观察雌激素缺乏时 的增殖和牙向 骨向分化能力的改变。本研究中，大鼠去势手术 个月后，血清雌二醇浓度显著下降，证明雌激素缺乏模型建立成功。在此基础上，分离培养两组，进一步探讨 在不同雌激素水平下增殖能力和分化能力的改变。检测结果显示，组 的增殖能力下降，表明雌激素缺乏抑制 的增殖，提示雌激素在 的增殖过程中发挥重要的调控作用。有研究报道 蛋白和 基因只在分泌型成牙本质细胞中表达，是成牙本质细胞晚期分化的标志物。、是成骨细胞分化的早期标志物，是成骨细胞分化晚期标志物。在基质形成阶段早期表达于分化中的成骨细胞中，随着分化完成，其表达逐渐下降。在有活性的成牙细胞或成骨细胞中表达，对成骨分化及骨质形成起着重要作用。在骨质形成的晚期阶段表达，与骨质成熟有重要关系。本研究中 组 的成牙 成骨标志物均表达下降，提示雌激素在 分化的全程都起着调控作用。有学者将 和含有聚乙丙交酯的支架材料结合后放入断牙，移植入免疫豁免小鼠体内，最终在断牙表面形成牙本质样组织，同时根管内形成含有血管的牙髓样组织。等将 嵌入富血小板血浆支架材料中，移植到免疫豁免大鼠背部，个月后观察到牙本质样、牙髓样组织形成。本研究中将 复合明胶海绵进行体内移植，组形成典型的牙髓牙本质样复合体，并且在 线下可观测到高密度影像，而 组仅能观察到少量细胞散在于基质中，未形成规则结构，线下也不可见高密度影像。因此我们推测雌激素可能通过调控 的分化进而影响其成牙本质能力以及牙齿硬组织的密度、硬度。综上，卵巢去势后大鼠体内雌激素缺乏可导致 成牙 成骨能力降低，因此，在组织工程牙再生 骨再生研究中应尽量避免选择雌激素缺乏个体来源的。参 考 文 献 ，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：许涛，曹灵，雷港，等 卵巢去势后大鼠牙槽骨及牙齿的组织学观察 口腔生物医学，（）：王燕萍，宋卫健，曹灵，等 卵巢去势对大鼠牙髓组织成牙成骨能力的影响 口腔生物医学，（）：王燕萍，宋卫健，景双林，等 雌激素缺乏对大鼠颌骨骨髓间充质干细胞增殖及成骨向分化能力的影响 中华口腔医学杂志，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：王斌，杨曦，周建萍，等 青少年女性月经周期不同阶段加力对正畸牙移动的影响 中国组织工程研究，（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：尚海霞）李瑶，等雌激素缺乏对大鼠根尖牙乳头干细胞增殖及牙向 骨向分化能力的影响