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第 40 卷第 5 期2023 年 10 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.5October 2023论著收稿日期:2023-03-06基金项目:联 勤 保 障 部 队 第 九 四 医 院 骨 稳 态 调 控 与 转 化 应 用 重 点 实 验 室(2021yxky081);甘 肃 省 青 年 科 技 基 金 计 划 项 目(20JR5RA587)作者简介:侯雪峰(1993),男,在读硕士,研究方向:从事中医药及物理疗法加速骨折愈合的研究.E-mail:18643898096 通信作者:陈克明(1968),男,主任技师,博士,研究方向:高原战创伤性骨折的加速愈合研究.E-mail:chenkm 大鼠股骨线性骨折模型建立方法的比较与优化改良侯雪峰1,2 高玉海1 柏 鑫1,2 郭建魁1 任 莉1 吴思敏1 陈克明1,2(1.中国人民解放军联勤保障部队第 940 医院,兰州730050)(2.甘肃中医药大学,兰州730000)摘要:目的本研究旨在通过综合比较本课题组既往研究中建立大鼠骨折模型的不同方法之间的差异性及模型的稳定性,并评价改良后大鼠截骨模型建立方法的科学性及可靠性,为骨折研究提供可靠的动物模型建立方法。方法根据不同造模方式将大鼠分为闭合性骨折模型组以及开放性骨折模型组,闭合性骨折模型组通过自制闭合性骨折造模仪建立股骨中段骨折,砝码 500 g,下落高度分别为 22、26、30 cm。开放性骨折模型组通过手术制造大鼠股骨中段横形或短斜形骨折,其中单纯克氏针固定组采用不同型号克氏针进行髓内固定,克氏针加线固定组在克氏针进行髓内固定的基础上,使用可吸收线将两骨折断端进行牵拉固定。结果闭合性骨折模型组中砝码下落高度为 22、26、30 cm,造模成功率依次为 33%、50%、17%。开放性骨折模型组中使用 1.2 mm 克氏针内固定其骨折断端的稳定性明显优于 0.8 和 1.0 mm 克氏针内固定。克氏针加线固定组相比于单纯克氏针固定组骨折断端更稳定。HE 染色结果显示克氏针加线固定组其固定稳定,骨折愈合良好且未见可吸收线对其产生不良影响。结论开放性骨折模型较闭合性骨折模型更容易控制骨折类型,保证实验对象的同质性。克氏针加线固定组较单纯克氏针固定组固定效果更稳定,可以避免因骨折断端固定不牢造成骨折不愈合甚至延迟愈合,进而导致样本脱落以及因固定不牢造成的实验结果偏差,确保了实验对象的同质性并降低了随机误差。关键词:骨折模型;大鼠;闭合性骨折;开放性骨折中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)05-0065-06DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.05.012Comparison and Improvement of Methods for EstablishingLinear Fracture Model of Femur in RatsHOU Xuefeng1,2,GAO Yuhai1,BAI Xin1,2,GUO Jiankui1,REN Li1,WU Simin1,CHEN Keming1,2(1.the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Peoples Liberation Army,Lanzhou 730050,China)(2.Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)Abstract:ObjectiveThe purpose of this study was to comprehensively compare the differences between different method used in previous studies to establish rat fracture models and the stability of the models,and to evaluate the scientific nature and reliability of the improved method for establishing rat osteotomy models,so as to provide a reliable method for establishing animal models for fracture research.MethodAccording to different modeling method,the rats were divided into closed fracture model group and open fracture model group.In the closed fracture model group,the middle femur fracture was established by self-made closed fracture modeling instrument.The weight was 500 g,and the falling height was 22,26 and 30 cm respectively.In the open fracture model group,transverse or short oblique fractures of the 实验动物科学40 卷middle femur were made by operation.In the simple Kirschner wire fixation group,different types of Kirschner wires were used for intramedullary fixation.In the Kirschner wire plus wire fixation group,on the basis of intramedullary fixation with Kirschner wire,the two fracture ends were pulled and fixed with absorbable wire.ResultIn the closed fracture model group,the falling height of weights was 22,26 and 30 cm,and the success rate was 33%,50%and 17%respectively.In the open fracture model group,1.2 mm Kirschner wire internal fixation was better than 0.8 and 1.0 mm Kirschner wire internal fixation.The fracture ends in the Kirschner wire plus thread fixation group were more stable than those in the simple Kirschner wire fixation group.HE staining result showed that the fixation of Kirschner wire plus thread group was stable,the fracture healing was good,and there was no adverse effect of absorbable line on it.Conclusion The open fracture model is easier to control the fracture type and ensure the homogeneity of the experimental objects than the closed fracture model.The fixation effect of Kirschner wire plus thread fixation group is more stable than that of simple Kirschner wire fixation group,which can avoid nonunion or delayed union of fracture due to unstable fixation of fracture ends,Resulting in sample shedding and deviation of experimental result due to loose fixation,which ensures the homogeneity of experimental objects and reduces random error.Key words:fracture model;rats;closed fracture;open fracture创伤性及应力性骨折等是骨科常见疾病1,愈合过程复杂且漫长,在研究骨折愈合过程中的骨转换和骨修复作用以及促进骨折愈合的相关研究有着广阔的发展前景。近年来,国内外学者对股骨骨折模型进行了诸多探索,Bonnarens 等2在研究中使用闭合性骨折造模仪建立了小鼠的闭合性骨折模型。此后多数闭合性骨折模型都基于此对骨折造模仪进行优化改良,以达到精简准确的目的3-5。而开放性股骨骨折模型的建立需要通过手术暴露股骨干,通过圆锯、摆锯等进行切割后,再使用克氏针进行髓内固定,进而建立股骨骨折模型。而对于髓内针直径的选择,国内外研究结果不一,相关研究指出,克氏针进行髓内固定时,其直径占股骨内径的 85%最为适宜6。鉴于目前造模方式方法较多,本研究根据前人研究基础对大鼠股骨骨折模型进行了诸多探索,包括复制闭合性骨折模型,探讨不同型号克氏针内固定对骨折断端的稳定性,以及对大鼠股骨开放性截骨模型进行优化改良,现通过对本课题组既往研究中采取不同方式方法建立的大鼠股骨骨折模型进行比较研究,客观评价各种方法建立大鼠股骨骨折模型的稳定性及适用性,以期为骨折研究提供可靠的造模方法。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物:70 只 SPF 级雄性 Wistar 大鼠,体质量 180 200 g,购 自 兰 州 大 学 实 验 动 物 中 心【SCXK(甘)2018-0002】,饲养于中国人民解放军联勤保障部队第 940 医院实验动物中心【SYXK(军)2017-0047】,室温 22 26 ,相对湿度 40%70%,使用通用型塑胶笼具饲养,每笼饲养密度不超过10 只,大鼠自由摄食饮水,所有操作均符合中国人民解放军联勤保障部队第 940 医院医学伦理委员会科研伦理相关要求,伦理审批号:2020KYLL128。整体实验的研究方法及过程均符合 3R 原则。1.1.2主要仪器与试剂:Ysio 全自动 DR 双板摄影系统(西门子),钛合金克氏针(张家港市华阳医疗器械厂),自制骨折造模仪、骨科钻(上海紫霭医疗器械有限公司),可吸收性外科缝线(上海浦东金环医疗用品股份有限公司),注射用青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)、碘伏皮肤消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)、75%医用乙醇(山东利尔康医疗科技股份有限公司)、0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)。1.2方法1.2.1实验动物分组:实验动物根据比较需要将其分为闭合性骨折模型组和开放性骨折模型组,其中闭合性模型组中根据砝码下落高度分为 22 cm 组(砝码下落高度为 22 cm)、26 cm 组(砝码下落高度为 26 cm)、30 cm 组(砝码下落高度为 30 cm),开放性骨折模型组根据克氏针型号不同分为 0.8 mm 组(使用 0.8 mm 钛合金克氏针内固定)、1.0 mm 组66第 5 期侯雪峰等:大鼠股骨线性骨折模型建立方法的比较与优化改良 (使用 1.0 mm 钛合金克氏针内固定)、1.2 mm 组(使用 1.2 mm 钛合金克氏针内固定),又依据固定方式不同分为单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组。1.2.2闭合性大鼠股骨线性骨折模型的建立:各组大鼠腹腔注射 3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉,麻醉后大鼠右侧卧位固定,手术区备皮消毒,在膝关节外侧做一纵行 1 cm 切口,暴露股骨远端和股四头肌肌腱,将股四头肌肌腱拨向内侧,沿股四头肌肌腱做一纵行 0.3 0.5 cm 切口,充分暴露股骨内外髁间沟。将 0.8 mm 克氏针于股骨内外髁间沟出,穿进髓腔并从梨状肌窝处穿出。然后将此处皮肤切开 0.5 cm 切口,将克氏针折弯,剪掉膝关节处多余的克氏针,闭合伤口。将大鼠置于骨折造模仪冲撞台上,下肢垂直于砧座,使 500 g 砝码分别从22、26、30 cm 高度下落,使术侧股骨骨折(图 1)。1.2.3开放性大鼠股骨线性骨折模型的建立:大鼠禁食 24 h,麻醉后,术侧区域备皮消毒,在股骨外侧做一长 1.5 2 cm 左右的切口。钝性分离黏膜、肌肉,暴 露 股 骨 中 段,单 纯 克 氏 针 固 定 组 仅 使 用1.2 mm 克氏针进行髓内固定,克氏针加线固定组除使用 1.2 mm 克氏针进行髓内固定外,再使用 3-0图 1闭合性骨折模型造模仪器及操作过程Fig.1Instrument and operation procedurefor modeling closed fracture可吸收缝合线对骨折两断端进行牵拉固定。术后,使用 0.9%氯化钠溶液将伤口处冲洗干净,缝合肌肉和皮肤。肌肉注射青霉素,10 万单位/只。术后连续注射 3 d,防止感染。大鼠开放性股骨骨折模型建模成功的标准:骨折类型为股骨中段横断型骨折或短斜形骨折;骨折断裂间隙0.5 mm;术后骨折对位良好,无移位,无感染及其他并发症(图 2)。图 2开放性大鼠股骨骨折模型制作过程Fig.2The process of modeling open femoral fracture in rats1.2.4X 线检查:模型建立后立即对各组大鼠拍摄X 线,观察是否符合骨折造模标准。每 2 周进行一次 X 线检查,检查时先麻醉大鼠,俯卧位置于 X 线机下进行拍摄,拍摄条件 5055 kV,58 mA。通过X 线片观察骨折类型及各组大鼠的骨痂生长情况,并根据骨痂评分标准对大鼠的骨痂生长情况进行评分。断端未见骨痂为级。断端边缘模糊,少见骨痂为级。断处边缘进一步模糊,骨痂量增多但未达到将缺损填满为级。断处边缘已完全消失,缺损被骨痂填满为级。X 线、级分别记为 0、1、2、3 分并且计算。1.2.5HE 染色观察骨折断端病理学改变:术后 8周,依据随机化原则,分别从单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组中各抓取 3 只大鼠,脱颈处死,迅速取出术侧股骨,并固定于 4%多聚甲醛溶液中 24 h,随后将股骨置于 10%EDTA 溶液中进行脱钙处理,每周更换脱钙液 1 次,8 周后进行石蜡包埋、切片并染色,在显微镜下观察组织病理学变化。1.3统计学分析采用 SPSS 24.0 软件进行统计学分析,计量资76 实验动物科学40 卷料数据采用均值标准差(xs)表示,符合正态分布两组之间比较采用 t 检验,非正态分布采用秩和检验,P0.05 表示两组间差异具有显著性。2结果2.1X 线片比较结果2.1.1闭合性骨折模型 X 线结果:X 线结果显示,砝码下落高度 30 cm 造模成功率为 17%,砝码下落高度 26 cm 造 模 成 功 率 为 50%,砝 码 下 落 高 度22 cm 造模成功率为 33%。X 线片显示该造模方式制造的大鼠股骨骨折模型其骨折类型复杂多样(图3)。结果提示该造模方式建立闭合性大鼠股骨线性骨折模型成功率较低,总体造模成功率未达到理想状态。图 3大鼠股骨闭合性骨折线片,砝码 500 g,下落高度分别为 30、26、22 cmFig.3X-ray images of closed femoral fractures in rats were taken with weights of500 g and falling heights of 30,26 and 22 cm,respectively2.1.2不同型号克氏针内固定的开放性骨折模型X 线结果比较:X 线结果显示,随着克氏针直径的升高,其固定效果也更好,实验结果表明 1.2 mm 克氏针较其他两种型号固定效果更好,并且从 X 线片观察到各组骨痂生长情况未表现出明显差异(图 4)。图 4不同型号克氏针内固定的开放性骨折模型 X 线片Fig.4X-ray images of open fracture models with different types of Kirschner wire internal fixation2.1.3单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组 X线结果比较:X 线结果显示,单纯克氏针固定组有 1只大鼠在造模后第 2 周克氏针脱出,4 只大鼠在造模后第 6 周时克氏针均有不同程度脱出,其中有 2只大鼠的克氏针完全脱出,造成骨折断端严重移位,最终符合实验标准占比为 67%。克氏针加线固定组有 1 只大鼠在造模后第 4 周克氏针脱出,骨折断端成交角移位,最终符合敷衍标准的占比为 93%。2.1.4单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组骨痂评分结果:比较两组造模 2 周和 4 周后骨痂 X 线评分情况,结果显示克氏针加线固定组的评分明显优于单纯克氏针固定组(图 5,6)。86第 5 期侯雪峰等:大鼠股骨线性骨折模型建立方法的比较与优化改良 图 5单纯克氏针固定与克氏针加线固定的开放性骨折模型 X 线片Fig.5X-ray images of open fracture models with KirschnerWire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation2.2单纯克氏针固定组与克氏针加线固定组组织形态学比较HE 染色处理结果显示,治疗 8 周后克氏针加线固定组已经形成骨性连接,骨痂塑性基本完全,骨折断端以成熟的骨细胞为主,并有少量尚未钙化完全的骨细胞。而单纯克氏针固定组骨桥连结仍以软骨及纤维连结为主,两骨折断端均形成了一定的软骨,构成假关节样结构。结果提示克氏针加线固定注:克氏针加线固定组与单纯克氏针固定组的骨痂评分比较,P0.05。Note:Comparison of poroma score between Kirschner Wirefixation and Kirschner wire-sewing threads fixation,P0.05.图 6克氏针加线固定组与单纯克氏针固定组的骨痂评分比较Fig.6Comparison of poroma score between Kirschnerwire-sewing threads fixation and Kirschner Wire fixation组其固定稳定,骨折愈合良好且未见可吸收线对其产生不良影响(图 7)。注:克氏针加线组可见骨折断端以已钙化的骨细胞为主,单纯克氏针固定组以半透明状的软骨为主。Note:In the group with Kirschner wire and suture,the fracture ends predominantly showed calcified bone cells.In the group withonly Kirschner wire fixation,the main feature was translucent cartilage.图 7克氏针加线固定与单纯克氏针固定建模 8 周后的股骨骨折断端的 HE 染色切片Fig.7HE staining images of broken end of a femur fracture between KirschnerWire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation after 8 weeks of modeling3讨论骨折是人类最常见的大器官创伤7,在动态愈合过程中涉及诸多复杂机制。近年来,随着国内外对于骨折、骨不连以及骨延迟愈合的研究日益增多,建立一种理想可靠的骨折动物模型成为了首要问题。目前骨折模型多集中于大鼠、小鼠的股骨骨折和胫骨骨折模型,根据建模方法的不同将其分为闭合性骨折模型和开放性骨折模型。目前国内外研究者多因闭合性骨折模型对周围皮肤、软 组 织 等 损 伤 较 小 而 采 用 闭 合 性 骨 折 模型5,8-9。本研究参考 Bonnarens 等2设计的骨折造模仪,结果显示,500 g 砝码分别从 22、26、30 cm 高度下落其造模成功率均不理想,结果提示虽然闭合性骨折模型其损伤机制更贴合于实际,但由于实验96 实验动物科学40 卷动物之间存在较大的个体差异,同时,大鼠在砧座上的置放位置、角度等均会影响股骨的应力,故可能存在的问题是骨折类型多样,可重复性差,很难保证实验动物的同质性。另外,骨折造模仪的精密程度对骨折模型的影响也较为巨大,骨折造模仪需要人工制作,复制较为困难,对技术要求较高,需要多次实验、改进,人力物力耗费较大。开放性骨折模型,创伤较大,对软组织损伤也较为严重,甚至可能伴有一定的感染风险,但是由于其可控性好,仍然被诸多研究者使用10-11。另外,无论是闭合性骨折模型还是开放性骨折模型都需要采取一定的固定方法,正确固定结构的应用对骨折的愈合和长期稳定性至关重要。国内外相关研究中多数采用髓内针进行固定,研究表明虽然髓内针会破坏骨髓,并干扰髓内血液循环,但并不会阻止骨折修复过程2。但是髓内针的粗细会影响骨折断端的稳定性,其对骨髓破坏的程度也不同,这些因素均会改变骨折愈合的速度。本研究基于参考文献12的建模方法,并进行优化改良,分别采用 0.8、1.0、1.2 mm 的克氏针进行髓内固定,结果显示 1.2 mm的固定效果优于其他两组。此外,在实验过程中发现,虽然髓内针内固定对股骨断端进行轴向固定,控制了横向移位,但是由于克氏针表面光滑,很难控制纵向移位,以及由于大鼠活动造成的克氏针直接脱出,本课题组又对开放性骨折模型造模方法进行改进。结果显示,克氏针加线固定组的稳定性明显提高,骨痂评分优于单纯克氏针固定组,提示其愈合质量更好,两组的骨组织病理学也显示出在造模 8 周后克氏针加线固定组基本愈合,而单纯克氏针固定组骨折断端仍然以纤维软骨的形式存在,可能由于断端活动,已经形成“假关节”样结构。总之,本研究通过综合对比本课题组既往实验中的不同砝码高度下落造成的大鼠股骨闭合性骨折模型、采用不同型号克氏针髓内固定的开放性骨折,以及通过比较单纯克氏针固定与克氏针加线固定的开放性骨折模型发现,闭合性骨折模型骨折类型不确定,重复性较差,而在开放性骨折中 2 mm 克氏针比 0.8、1.0 mm 的克氏针固定效果好,进一步研究发现采用 1.2 mm 克氏针同时加可吸收线对两骨折断端进行牵拉固定效果十分理想,且对骨折的愈合过程未产生不良影响。综上所述,通过对现有大鼠股骨骨折建模方法进行改良,确定了 1.2 mm 克氏针加线固定的开放性大鼠股骨线性骨折模型是一种理想的实验模型,稳定性好,可重复性高,操作难易程度适中,同时可保证实验对象的同质性和均一性。参 考 文 献 1 贺云飞,黄琼,白云,等.磁共振诊断应力性骨折的应用价值研究J.西北国防医学杂志,2018,39(6):375-378.2 BONNARENS F,EINHORN T A.Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone J.J Orthop Res,1984,2(1):97-101.3 UTVG SE,KORSNES L,RINDAL D B,et al.Influence of flexible nailing in the later phase of fracture healing:strength and mineralization in rat femoraJ.J Orthop Sci,2001,6(6):576-584.4 宋扬,韩一生,毕龙,等.新型大鼠闭合骨折模型的建立及研究J.现代生物医学进展,2009(18):3429-3431.5 CHEUNG W H,CHOW S K,SUN M H,et al.Low-intensity pulsed ultrasound accelerated callus formation,angiogenesis and callus remodeling in osteoporotic fracture healingJ.Ultrasound Med Biol,2011,37(2):231-238.6 魏巍,于涛,付庆斌,等.不同直径髓内针固定对骨折愈合影响研究J.黑龙江医药科学,2013,36(2):91-92.7 EINHORN T A,GERSTENFELD L C.Fracture healing:mechanisms and interventionsJ.Nat Rev Rheumatol,2015,11(1):45-54.8 OLOUGHLIN P F,MORR S,BOGUNOVIC L,et al.Selection and development of preclinical models in fracture-healing researchJ.J Bone Joint Surg Am,2008,90(Suppl 1):79-84.9 CHEUNG W H,CHIN W C,QIN L,et al.Low intensity pulsed ultrasound enhances fracture healing in both ovariectomy-induced osteoporotic and age-matched normal bonesJ.J Orthop Res,2012,30(1):129-136.10KANEZAKI S,MIYAZAKI M,ISHIHARA T,et al.Enhancement of the effects of intermittent parathyroid hormone(1-34)by bone morphogenetic protein in a rat femoral open fracture modelJ.J Orthop Surg Res,2019,14(1):403.11MORSE A,MCDONALD M M,SCHINDELER A,et al.Sclerostin antibody increases callus size and strength but does not improve fracture union in a challenged open rat fracture modelJ.Calcif Tissue Int,2017,101(2):217-228.12刘震,于训意,曹长征,等.接骨续筋丸促进大鼠骨折愈合的作用机制研究J.中医正骨,2017,29(10):1-12.07