刺玫果提取物“谱-效-型”质量评价体系研究.pdf

，（）：邵静媛，郭俊林，郭尚鑫，等 基于质量源于设计理念的三叶糖脂清汤剂定量指纹图谱研究 中国中药杂志，（）：王超越，龚行楚，付泽飞，等 确定性筛选设计结合设计空间法优化黄芩提取物的纯化工艺 中国中药杂志，（）：应园园，张梦迪，王航利，等 滋阴降糖方提取工艺评价指标的研究 中药材，（）：宋 妍 紫花地丁药理作用的研究现状 中医临床研究，（）：王瑞雅，王惠平，赵薇，等 野菊花的生物活性成分及药理作用研究 甘肃科技，（）：聂文佳，徐帅师，张咏梅 蒲公英有效成分及其药理作用研究进展 辽宁中医药大学学报，（）：吴 娇，王 聪，于海川 金银花中的化学成分及其药理作用研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：牛 锋 天葵子的化学成分及质量标准研究 沈阳：沈阳药科大学，刺玫果提取物“谱效型”质量评价体系研究赵胜男，王梦丽，李艳荣，杜义龙，潘海峰（承德医学院，河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德）收稿日期：基金项目：河北省高校重点学科建设项目资助（冀教高 号）作者简介：赵胜男（），女（回族），硕士，副教授，研究方向为中药质量分析。：，：通信作者：潘海峰（），女，硕士，教授，研究方向为中药分析。：（），：摘要：目的 建立刺玫果提取物“谱效型”质量评价体系。方法 考察不同提取物的抗氧化作用，建立 指纹图谱，灰色关联度分析研究共有峰峰面积与抗氧化作用之间的关联度，聚类分析、判别分析构建质量评价数学模型。结果 乙醇提取物抗氧化作用最强。批样品指纹图谱中有 个共有峰，关联度大于 的有 个。各批样品聚为 类。结论“谱效型”质量评价体系可为刺玫果药理作用研究及质量评价体系完善提供依据。关键词：刺玫果提取物；“谱效型”质量评价体系；抗氧化作用；指纹图谱；灰色关联度分析；聚类分析；判别分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：年 月，国家药品监督管理局发布了 中药生物效应检测研究技术指导原则（征求意见稿），指出目前以指标性成分检测为主的质量控制方法与药品有效性、安全性的关联不强，难以充分反映后者整体质量，需探索反映中药有效性、安全性、整体质量的手段。年版中国药典 通过增加与临床功效相关成分的控制来体现中医药特点，例如金银花功能清热解毒，现代药理研究证明其中的环烯醚萜苷类成分具有保肝利胆、抗炎镇痛等作用，故药典增加了关于该类成分控制的特征图谱项目。虽然相关学者已认识到质量评价体系完善的重要性，但如何找到符合中医药特点的活性成分是根本问题，也是需要许多学者从不同药材出发共同解决的问题。刺玫果是蔷薇科蔷薇属植物山刺玫 、光叶山刺玫 的干燥成熟果实，中药大辞典 谓其有健脾理气、抗氧化、抗衰老等药理作用。近年来，大量研究表明刺玫果活性成分主要有黄酮类（芦丁、金丝桃苷、槲皮素）、三萜皂苷类（熊果酸、齐墩果酸）、多酚类（没食子酸）等，在药品、保健品、化妆品等方面的开发应用具有广阔前景。年版 中国药典 中山玫胶囊以山楂叶、刺玫果为原料，其中后者选取 乙醇提取物，质量评价方法为 定性鉴别，相对简单。本实验探索刺玫果不同提取物的抗氧化作用，对 乙醇提取物进行指纹图谱研究，采用灰色关联度法构建谱效关系，寻找有效物质群，再通过聚类分析、判别分析对有效物质群建立质量评价数学模型，以期为该药材药理作用研究及质量评价体系完善提供依据。材料 仪器酶标仪（美国 公司）；高效液相色谱仪（美国 公司）；年 月第 卷 第 期中 成 药 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。试 剂 金 丝 桃 苷（批 号，纯 度 ）、没食子酸（批号，纯度）对照品 均 购 自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院；芦 丁（批 号，纯度）对照品购自上海融禾医药科技有限公司；维生素 （批号，纯度）、，联氮双乙基苯并噻唑啉磺酸（，批号，纯度 ）、，二 苯 基三 硝 基 苯 肼（，批 号，纯度）对照品均购自昆明泽浩科技有限公司。过硫酸钾（）购自天津欧博凯化工有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯（美国 公司）；无水乙醇、冰醋酸为分析纯（天津市光复科技发展有限公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。药材 刺玫果共 批，编号，经河北民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫 、光叶山刺玫 的成熟果实，具体见表。表 样品信息编号采集地编号采集地吉林长白山河北承德 黑龙江伊春野生河北承德 黑龙江伊春 山东大同黑龙江鸡西湖南长沙黑龙江大兴安岭 广西桂林黑龙江大兴安岭 安徽亳州大兴安岭加格达奇贵州安顺辽宁葫芦岛吉林长春山东济南辽宁大连山东平阴野生山东德州 方法与结果 色谱条件 色谱柱（，）；流动相 冰醋酸（）甲醇（），梯度洗脱，程序见表；体积流量 ；柱 温；检测波长 ，；进样量 。表 梯度洗脱程序时间 冰醋酸 甲醇 溶液制备 供试品溶液药材用研钵研碎后过 号筛，取约，精密称定，置于 锥形瓶中，分别以纯水、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇各 提取，超声处理 ，过滤后在蒸发皿中蒸干，得到相应提取物，再用对应体积分数乙醇 洗涤后转移至量瓶中，混匀静置，离心 ，即得。对照品溶液 精密称取没食子酸、金丝桃苷、芦丁对照品适量，甲醇溶解，即得（各成分质量浓度分别为、）。阳性对照溶液 精密称取维生素 对照品 ，加 水，即得，稀释成不同质量浓度。溶液精密称取 对照品 ，置于 量瓶中，加水定容；精密称取过硫酸钾对照品 ，置于 量瓶中，加水定容，取上述 种溶液各 ，置于 量瓶中，加水定容，即得（避光 ）。溶液 精密称取 对照品 ，置于 量瓶中，乙醇稀释成溶液，加水定容，即得。抗氧化作用研究 自由基清除能力参考文献 报道，将提取物稀释成系列质量浓度的样品溶液，以维生素 为对照，相应溶剂为空白，测定吸光度，计算清除率，公式为清除率 （空白样品）空白 。自由基清除能力 参考文献 报道，将提取物稀释成系列质量浓度的样品溶液，以维生素 为对照，相应溶剂为空白，测定吸光度，按“”项下公式计算清除率。随机选取、批次药材，按“”项下方法制备不同体积分数乙醇提取物，以维生素 为对照，按“”“”项下方法测定清除率，计算，平行 份，取平均值，结果见表、图。由此可知，乙醇提取物抗氧化作用最强。表 测定结果（）样品清除率 自由基（）自由基（）维生素 提取物 提取物 提取物 提取物 提取物 图 提取物 自由基清除能力曲线 指纹图谱建立基于“”项下结果，取 乙醇提取物适量，按“”项下方法制备供试品溶液，在“”项色谱条件下进样测定，结果见图，共有 年 月第 卷 第 期中 成 药 图 提取物 自由基清除能力曲线 个共有峰，与非共有峰的平均峰面积比值为 ，并鉴定出没食子酸（号峰）、金丝桃苷（号峰）、芦丁（号峰），结果见图。图 批样品 指纹图谱图 对照指纹图谱 方法学考察 精密度试验取 乙醇提取物（）适量，按“”项下方法制备供试品溶液，在“”项色谱条件下进样测定 次，测得各共有峰峰面积 在 之间，表明仪器精密度良好。稳定性试验取 乙醇提取物（）适量，按“”项下方法制备供试品溶液，室温下于、在“”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰峰面积 在 之间，表明溶液在 内稳定性良好。重复性试验取 乙醇提取物（）份，按“”项下方法制备供试品溶液，在“”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰峰面积 在 之间，表明该方法重复性良好。、自由基清除能力取 批药材，按“”项下方法制备 乙醇提取物，按“”“”项下方法测定清除率，计算，结果见表。表 测定结果（）样品清除率 自由基（）自由基（）维生素 化学计量学研究 灰色关联度分析 参考文献 报道，对 批药材 乙醇提取物 指纹图谱中共有峰峰面积与、自由基 建立灰色关联，关联度以 表示，结果见表。与对照品比对后，确定依次为芦丁金丝桃苷没食子酸，其中前两者关联度均大于 。表 灰色关联度分析结果（自由基）峰号关联度峰号关联度峰号关联度 表 灰色关联度分析结果（自由基）峰号关联度峰号关联度峰号关联度 聚类分析根据“”项下结果，选取关联度大于 的色谱峰，即、，以其所代表成分的峰面积为自变量，采用 软 件 进 行 聚 类 分 析，选 择 组 间 联 接 法，以 平 均 年 月第 卷 第 期中 成 药 距离为区间，结果见图。由此可知，当类间距为 时，各批样品聚为 类，其中类为，类为，类为。图 批样品聚类分析图 判别分析 以“”项下 个色谱峰代表成分的峰面积为自变量，采用 软件进行判别分析，以典型判别函数系数法（非标准化系数）建立模型，方程为 （、起主要作用）、（、起主要作用），其中 为峰面积原始数值，、分别为横坐标、纵坐标数。样品预判另取未知样品（采集地辽宁，不属于，命名为）适量，按“”项下方法制备 乙醇提取物及其供试品溶液，在“”项色谱条件下进样测定，测得、分别为 、，代入“”项下方程，得 ，再以数字、将图形划分为 个区域，分别对应、类样品，见图。由此可知，该样品坐标对应结果归为类；类只有 批样品（），而且抗氧化作用最差；类也只有 批（），可认为是特异性差异所致。综上所述，类是基于抗氧化作用、化学计量学筛选得到的优质药材 乙醇提取物，可预判样品 以抗氧化作用为基础时质量较好，符合要求。讨论与结论本实验分别采用、法评价刺玫果 乙醇提取物的抗氧化作用，发现 分 别 为 、，其主要原因是这种方法针对的成分不同，前者是通过与亲水性、亲脂性物质结合来测定，而后者是通过与具有孤对电子的物质结合来测定。另外，采用 法评价刺玫果提取物清除能力时发现，其 、乙醇提取物 分别为 、，两者清除能力相似，结合 法结果可知 乙醇提取物抗氧化能力最强。在 年版 中国药典 中，山玫胶囊所含刺玫果是以 乙醇提取物入药，而根据本实验中的抗氧化作用研究图 样品 区域图结果，可考虑改为 乙醇提取物。然后，以指纹图谱结合化学计量学来建立刺玫果提取物质量评价体系。首先建立 批刺玫果 乙醇提取物的 指纹图谱，指认出 个共有峰。然后对共有峰峰面积与抗氧化作用进行灰色关联度分析，当、法所测得的抗氧化作用都满足关联度大于 时，可认为相关性较强，结果发现 个满足要求的共有峰。最后，以筛选出的成分为指标，采用聚类分析、判别分析建立模型，得到数学表达式，发现、类样品分别都只有一批，其中前者抗氧化作用较差，而后者目标成分峰面积值异常，故将两者剔除。另外，当有未知待预判样品时，可直接将目标成分峰面积代入数学模型，如果其坐标符合图 中类坐标范围，则以抗氧化作用为基础的质量较好，符合效果要求。前期报道，刺玫果的主要药理作用为抗氧化。本实验采用 指纹图谱，以刺玫果主要临床作用为指标筛选质量控制目标测定成分，建立数学模型，最终构建“谱效型”质量评价体系，以期使该药材质量控制方法更加多样、简便、科学。但该模型构建还需通过测定大量样品来进一步完善，并且 种成分目前只鉴定出芦丁、金丝桃苷，还需经质谱谱库等分析手段识别剩余成分。另外，今后还将继续对刺玫果其他主要药理作用，如抗血栓、抗衰老等进行研究，综合多种活性交叉验证，最终建立全面的刺玫果质量评价体系。参考文献：国家药品监督管理局 中药生物效应检测研究技术指导原则（征求意见稿）：年 月第 卷 第 期中 成 药？，（）：南京中医药大学 中药大辞典（上册）版 上海：上海科学技术出版社，：郭海欢 刺玫果提取物化学成分分离及黄酮苷元的制备 吉林：吉林化工学院，王光函，姜 鸿，张振秋，等 刺玫果药材中黄酮类成分测定 中成药，（）：孟永海，怀 雪，翟春梅，等 刺玫果提取物总黄酮含量以及体外抗氧化活性的测定 化学工程师，（）：，（）：刘金璐 刺玫果总皂苷的制备工艺及体外活性研究吉林：吉林化工学院，钟方丽，王晓林，杨 扬 刺玫果提取物中总三萜酸的定性定量分析研究 林产化学与工业，（）：杨 扬，王晓林，薛健飞，等 刺玫果提取物中没食子酸的含量测定 食品工业，（）：钟方丽，王晓林，薛健飞，等 刺玫果化学成分的研究 林产化学与工业，（）：王晓林，钟方丽，张帅，等 刺玫果总黄酮饮料加工工艺研究 河南工业大学学报（自然科学版），（）：；雷永平 刺玫果总黄酮的纯化工艺及保健食品的研究吉林：吉林化工学院，何媛媛，陈 凡，孙爱东 刺玫果功效及食品开发研究进展 中国食物与营养，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典：年版一部 北京：中国医药科技出版社，：赵胜男，周维维，潘海峰 基于指纹图谱结合抗氧化作用研究刺玫果汤剂质量 药物分析杂志，（）：王子怡，穆文成，李艳荣，等 山楂叶标准汤剂指纹图谱及抗氧化活性谱效关系研究 天然产物研究与开发，（）：；魏 颖，刘 艳，林峰，等 刺玫果免疫调节和体外抗氧化活性研究 中国食品学报，（）：孟永海，怀 雪，翟春梅，等 刺玫果提取物总黄酮含量以及体外抗氧化活性的测定 化学工程师，（）：小儿氨酚黄那敏颗粒中人工牛黄质量控制及抽验质量评价方法杨海源青海省药品检验检测院，国家药品监督管理局中药（藏药）质量控制重点实验室，青海省中藏药现代化研究重点实验室，青海 西宁 收稿日期：基金项目：国家药品抽检计划项目（国药监药管 号）作者简介：杨海源（），男，硕士，从事药物质量控制、药物分析研究。：，：摘要：目的 建立小儿氨酚黄那敏颗粒中人工牛黄的质量控制及抽验质量评价方法。方法该药物 鉴别采用硅胶 薄层板，以冰醋酸乙酸乙酯异辛烷（）为展开剂，点样薄层板凉干后，喷以 硫酸乙醇溶液，在 下加热至有斑点出现，在紫外灯（）下检视。该药物的分析采用 色谱柱（，）；流动相甲醇三氯甲烷 磷酸（）；柱温 ；体积流量 ；检测波长。结果 胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸 特征斑点清晰，分离度好。胆红素在 范围内线性关系良好（），平均加样回收率 ，。添加人工牛黄的 批制剂中，胆红素含量为每袋 。以胆红素不得少于每袋 计算，合格率约为 。批人工牛黄中，胆红素平均含量约为 ，人工牛黄、体外培育牛黄与牛黄对照药材的扫描电镜图谱结构均有一定差异。结论 该方法简便，专属性强，可用于小儿氨酚黄那敏制剂中牛黄的质量控制。关键词：小儿氨酚黄那敏颗粒；人工牛黄；体外培养牛黄；胆红素；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：年 月第 卷 第 期中 成 药