大黄素对胶原诱导性关节炎大鼠的骨保护作用:基于抑制铁死亡和降解基质金属蛋白酶.pdf
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1、类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,主要病理表现为滑膜增生,最终可导致患者关节破坏、功能丧失 1,2。RA患者的功能丧失主要源于其晚期骨结构损伤 3,4。近年研究主要集中在成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的增殖、炎症因子对破骨细胞和成骨细胞的影响,破骨细胞和成骨细胞影响骨侵蚀和骨修复的机制,然而,鲜有研究关注铁死亡与RA骨关节结构损伤之间的联系。铁死亡与诸多疾病的病理过程有明显相关性,例如抑制肿瘤增殖、抑制病毒抗原抗体反应、减少滑膜成纤维细胞的异常增殖和滑膜炎症 5,6。随着人们逐渐重视铁元素在RA成纤维滑膜细胞和软骨细胞程序性死亡中的作用 7-9。研究者发现在RA患者和佐剂型关节炎大
2、黄素对大黄素对胶原诱导性关节炎大鼠的骨保护作用胶原诱导性关节炎大鼠的骨保护作用:基于抑制铁死亡基于抑制铁死亡和和降解基质金属蛋白酶降解基质金属蛋白酶周思聪,杨 威,曾 丽,曹春浩,袁 速,荣晓凤重庆医科大学附属第一医院中西医结合科,重庆 400016Emodin alleviates joint inflammation and bone erosion in rats with collagen-inducedarthritis by inhibiting ferroptosis and degrading matrix metalloproteinasesZHOU Sicong,YANG
3、Wei,ZENG Li,CAO Chunhao,YUAN Su,RONG XiaofengDepartmentofIntegratedChineseandWesternMedicine,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400016,China摘要:目的 探讨大黄素对类风湿关节炎(RA)铁死亡相关信号通路介导的骨保护作用机制。方法 除正常组外,使用200 L不完全弗氏佐剂乳化的牛二型胶原构建胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的类风湿关节炎模型。21 d后分为正常组(Normal)、模型组(Model)、甲氨蝶
4、呤组(MTX,0.2 mg/kg,3 次/周)、大黄素(Emo)高(80 mgkg-1d-1)、低(40 mgkg-1d-1)剂量组,10只/组。记录大鼠造模之后的关节炎评分和足趾体积;使用丙二醛(MDA)试剂盒检测组织MDA含量;用番红固绿染色法、苏木精-伊红染色法对踝关节石蜡切片进行染色,光镜下观察大鼠踝关节组织形态学改变;用免疫组织化学法对踝关节切片的基质金属蛋白酶(MMP)3、13进行染色,光镜下观察大鼠踝关节MMPs的表达;Western blot法检测大鼠踝关节组织中长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁
5、蛋白重链1(FTH1)的蛋白质含量。结果 与正常组相比,模型组大鼠的关节炎评分指数、足趾肿胀度增高(P0.05);软骨表面粗糙,软骨细胞丢失、排列杂乱稀疏;MDA含量和ACSL4的蛋白质含量升高,SLC7A11、GPX4、FTH1的含量降低(P0.05);踝关节MMP3和MMP13的表达量升高;与模型组相比,MTX组和大黄素(40 mg/kg、80 mg/kg)组的关节炎评分指数、足趾肿胀度降低(P0.05),软骨表面相对光滑平整,软骨细胞排列整齐,MDA含量升高(P0.05);MTX组和大黄素高剂量组ACSL4的蛋白质含量降低,SLC7A11、GPX4、FTH1的含量升高(P0.05)。结论
6、 大黄素能有效控制CIA大鼠关节炎症、改善关节骨侵蚀。调节铁死亡相关信号通路ACSL4、SLC7A11、GPX4、FTH1的含量,降低MMP3和MMP13的表达,可能是其抑制RA骨破坏的重要机制和途径之一。关键词:类风湿关节炎;胶原诱导性关节炎大鼠;铁死亡;基质金属蛋白酶;骨破坏Abstract:Objective To investigate the osteoprotective mechanism of emodin in light of the ferroptosis signaling pathway in arat model of rheumatoid arthritis.Me
7、thods SD rat models of collagen-induced arthritis(CIA)were treated with methotrexateor low or high doses of emodin,and the changes in arthritis scores and toe volume were recorded.model of CIA rats.Malondialdehyde(MDA)content in the joint cartilage was determined,and ankle joint tissue pathologies w
8、ere observed usingcaffein solid green staining and hematoxylin-spermine red staining.MMP3 and MMP13 expressions in the ankle joint tissueswere detected using immunohistochemistry,and Western blotting was used to detect the protein expressions of ACSL4,SLC7A11,GPX4,and FTH1.Results Compared with the
9、normal control rats,the CIA rats showed significantly increasedarthritis score index with obvious toe swelling(P0.05),rough cartilage surface,and loss and irregular aligment ofchondrocytes.The rat models also showed significantly increased MDA and ACSL4 contents,lowered SLC7A11,GPX4,andFTH1 contents
10、(P0.05),and decreased expressions of MMP3 and MMP13 in the ankle joint(P0.05).The rat models treatedwith either methotrexate or emodin(40 and 80 mg/kg)had significantly reduced arthritis score index and toe swelling withsmooth cartilage surface and neat arrangement of the chondrocytes.The treatments
11、 with methotrexate and emodin bothdecreased the contents of MDA and ACSL4 and increased the contents of SLC7A11,GPX4,and FTH1 in the joint tissues(P0.05).Conclusion Emodin can effectively control joint inflammation and improve joint bone erosion in CIA rats possibly byinhibiting the ferroptosis sign
12、aling pathways and reducing the expressions of MMP3 and MMP13.Keywords:rheumatoid arthritis;collagen-induced arthritis;ferroptosis;matrix metalloproteinases;bone destruction收稿日期:2023-03-10基金项目:国家自然科学基金(81702202);重庆市基础前沿探索基金(cstc2018jcyjAX0325)SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(817022
13、02).作者简介:周思聪,硕士,E-mail:通信作者:荣晓凤,硕士,教授,E-mail:doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.10.16J South Med Univ,2023,43(10):1776-17811776(AA)大鼠的成纤维滑膜细胞和软骨细胞中发生了丰富的铁死亡过程,抑制这一过程已被初步证实能够有效缓解关节损伤 3,然而,目前抑制RA铁死亡以延缓骨破坏的药物仍需进一步研究。在前期研究中我们发现大黄素能有效抑制成纤维滑膜细胞增殖、调控RANKL/OPG等多条信号通路以延缓RA关节结构损伤 10,11,本文将在此基础之上进一步探讨大黄素能否通过干预
14、调节铁死亡来降低基质金属蛋白酶的表达从而抑制RA关节的骨破坏,为大黄素延缓类风湿关节炎骨破坏提供实验依据。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验试剂 型胶原、不完全弗氏佐剂(Chondrex);缩甲基纤维素钠(雷根生物技术有限公司);丙二醛检测试剂盒(南京建成公司);GPX4蛋白抗体(Abmart);ACSL蛋白抗体、FTH1蛋白抗体、SLC7A11蛋白抗体、GAPDH抗体、山羊抗兔HRP二抗、山羊抗小鼠HRP二抗(abcam)。1.1.2 实验仪器 超高速离心机(Thermo Fisher);光学显微镜(Zeiss);电泳仪、电转仪器、酶标仪(Bio-Rad);500L全玻璃注射器(PE
15、ACE);高速匀浆仪(IKA)。1.1.3 实验药物 大黄素Emo(成都百科通生物科技有限公司);甲氨蝶呤MTX(上海上药信谊药厂有限公司,2.5mg/粒。1.1.4 实验动物SPF 级 78 周雌性 SD 大鼠批号:SYXK(渝)2018-0003;重庆医科大学动物实验中心,实验经过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准(动物伦理编号:2022-K296)。1.2 方法1.2.1 动物造模与分组 78周雌性SD大鼠适应性喂养7 d后,除正常组大鼠10只正常饲养外,40只大鼠用于胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型CIA造模,将等体积的牛二型胶原(2 mg/mL)和不完全弗氏佐剂在冰水浴中使用高
16、速匀浆仪混合均匀,至乳滴不能在水中扩散后,每只大鼠尾静脉注射200 L乳液。7 d后对动物进行二次免疫,步骤同前。21 d后,按照关节炎评分标准筛选造模成功的大鼠,分为CIA模型(Model)组10只(相应剂量CMC-Na灌胃)、甲氨蝶呤(MTX,0.2 mg/kg,3 次/周)组10只、低剂量大黄素(Emo,40 mgkg-1d-1)组10只、高剂量大黄素(Emo,80 mgkg-1d-1)组10只,常规称重,给药21 d后,采用戊巴比妥麻醉于腹主动脉处取血,离心后得血清于-80 冻存;脱颈处死后取左膝关节和左踝关节于-80 冻存,右膝关节和右踝关节于4%多聚甲醛固定。1.2.2 关节病变评
17、估 从第1次免疫之后每日采用04级关节评分法进行大鼠关节病变评分。后肢关节肿胀程度评分按照以下标准:0分,无肿胀和泛红;1分,轻度肿胀或者泛红;2分,中度肿胀和泛红同时存在;3分,严重肿胀和泛红同时存在;4分,严重肿胀和泛红,并且出现关节僵硬和活动明显受限。1.2.3 大鼠足趾肿胀度测量 使用足容积排水法测量大鼠踝关节及以下部位的体积。在第1次免疫前和在免疫后的每2d进行1次踝关节和足趾体积测量。1.2.4 踝关节组织病理学HE染色 取材后将踝关节脱钙石蜡固定至脱水:依次将切片放入环保透明剂(1)和(2),每次浸泡10 min;依次浸泡无水乙醇、95%乙醇、75乙醇各5 min,蒸馏水冲洗。再
18、用苏木精染色液(Harris)染色4 min,蒸馏水冲洗2 min,1%盐酸乙醇分化,蒸馏水冲洗,稀碳酸锂水溶液返蓝后蒸馏水冲洗2 min加入伊红染液浸泡30 s,无水乙醇中脱色2 min,最后封片固定用光学显微镜采集图像后分析。1.2.5 踝关节组织病理学番红固绿染色 Weigert苏木精染色5 min,蒸馏水冲洗后,1%盐酸酒精分化1 s,蒸馏水冲洗5 min,固绿染液滴染5 min,水洗去多余染液直至镜下观察软骨无色,番红O染液滴染3 min,倾去多余染液,在4份无水乙醇中分化 5 s、2 s、5 s,快速风干后,置二甲苯透明3 min,中性树胶封片固定用光学显微镜采集图像后分析。1.2
19、.6 踝关节免疫组织化学染色 将各组大鼠踝关节切片放入干燥箱内,66 烤片30 min,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,柠檬酸盐修复液加热2 min抗原高压修复。在5%BSA中封闭30 min,在37 孵育GABA一抗(1 100)60 min,蒸馏水冲洗之后孵育二抗(1 100)孵育30 min,蒸馏水冲洗。滴加DAB显色剂,碳酸锂溶液蓝化30 s,漂洗,脱水封片。随机选取不同组大鼠踝关节切片在光学显微镜下观察关节MMP3和MMP13表达情况。1.2.7 丙二醛含量试剂盒检测脂质过氧化水平 取膝关节软骨组织在液氮中切成小块后置于匀浆管中,加入适当RIPA裂解液后低速匀浆,将匀浆后对液体离心取上清,
20、使用TBA法检测丙二醛(MDA)的含量。标准曲线样本制备和试剂加样实验步骤参照试剂盒说明书进行,使用酶标仪检测各样本吸光度。1.2.8 免疫蛋白印记试验检测关键蛋白在冰上用RIPA裂解缓冲液裂解踝关节,并使用蛋白质分析试剂盒以牛血清白蛋白(BSA)为标准测定蛋白质含量。每个样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上分离,然后转移到硝化纤维素膜上。用QuickBlock 拦 截 后 封 闭 缓 冲 液(BeyotimeBiotechnology)封闭,然后在4 条件下,将相应的膜与抗ACSL4抗体(1 10 000,abcam)、SLC7A11(1 1000,abcam)
21、、GPX4(1 500,abmart)、FTH(1 1000,abcam)、GAPDH(1 10 000,abcam)一级抗体分别一起孵育过http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1776-17811777夜。在用Tris缓冲盐水(TBS)洗涤膜5 min,3 次后,添加适当的辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗小鼠和山羊抗兔二级抗体(1 1000,abcam)孵育2 h。通过增强化学发光(ECL)试剂检测蛋白质。通过图像进行蛋白质水平半定量统计1.2.9 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0对实验结果进行分析,计量资料采用均数标准差表
22、示。所有实验进行3次独立重复,所得实验数据均满足参数检验标准,多组间比较采用单因素方差分析。动物实验中样本计算的检验效能power=0.9,计算得出最小样本量为9。采用双侧检验,P0.05认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 各组大鼠足趾体积和AI指数情况Model组大鼠足趾均有不同程度的红肿变形、皮温升高,AI评分大于4分,部分大鼠出现关节畸形、行动障碍;与Model组相比,MTX组和Emo高低剂量组关节红肿减轻,足趾体积和AI指数明显降低,少见关节畸形和行动障碍;与MTX组相比,Emo高低剂量组的AI指数降低更明显,少见关节畸形;与Emo低剂量组相比,Emo高剂量组大鼠关节红肿减轻更明显
23、,足趾体积和AI指数降低,未见明显关节畸形和行动障碍(图1)。图1 各组大鼠足趾体积和AI指数情况Fig.1 Effects of emodin on severity of arthritis in collagen-induced arthritis(CIA)rats.A:Arthritis score index of the rats.B:Rat paw volume.Data are presented as MeanSE and analyzed using one-way ANOVA followed by ANOVA test.#P0.05,#P0.01vscontrolgro
24、up;*P0.05,*P0.01vsModelgroup.9876543210Arthritics score02224262830323436384042Treatment time(d)ControlModelMTXEmo(40 mg/kg)Emo(80 mg/kg)#*02224262830 3234363840 42Treatment time(d)ControlModelMTXEmo(40 mg/kg)Emo(80 mg/kg)Paw volume(mL)3.63.43.23.02.82.62.42.22.01.8#*AB2.2 各组大鼠踝关节软骨病理变化情况HE染色和番红固绿染色显
25、示,Normal组大鼠踝关节结构完整,表面平滑,软骨细胞排列整齐,关节腔未见成纤维滑膜细胞增殖侵袭,未见炎症细胞浸润;Model组大鼠踝关节表面粗糙有明显破损,软骨细胞丢失排列紊乱,关节腔有成纤维滑膜细胞和炎症细胞浸润;MTX组大鼠踝关节表面有粗糙和破损,滑膜增生不厚,未见炎症细胞浸润;Emo低剂量组大鼠踝关节表面稍有粗糙和磨损,滑膜增生不明显,有少量炎症细胞浸润;Emo高剂量组大鼠踝关节软骨表面极少见粗糙和磨损,滑膜增生不明显,有极少量炎症细胞浸润(图2)。2.3 各组大鼠踝关节MMP3和MMP13表达情况免疫组织化学检测结果显示,与Normal组相比,Model组大鼠踝关节MMP3和MMP
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