大黄代煎液中5种蒽醌类成分的稳定性研究.pdf

：12 12山西医药杂志2 0 2 3年8 月第52 卷第16 期ShanxiMedJ,August2023,Vol.52.No.16大黄代煎液中5种葱醌类成分的稳定性研究曹金华支文星贾慧利须秋萍周瑾赵亮李盛建【摘要】目的建立高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)检测大黄代煎液中5种葱醒类成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的含量，考察不同储存状态对其含量的影响。方法采用HPLC-DAD，流动相为0.1%甲酸水-乙睛体系，线性梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，色谱柱温度为2 5,进样体积为5l,测定不同储存温度和时间下大黄代煎液中5种葱醌类成分的浓度。结果5种葱醌类成分在相应浓度范围内线性关系良好，其精密度、重复性、稳定性和加样回收率良好；低温储存2 8 d内药液5种葱醌类成分基本稳定，常温和高温储存3d内基本稳定。结论所建立的HPLC-DAD法稳定性、快速、重复性好，可应用于大黄代煎液中5种蒽醌类成分的含量测定；大黄代煎液在冷藏条件下稳定性较好。【关键词】大黄属；葱醌类；色谱法，高压液相；稳定性Study on the stability of five anthraquinones in rhubarb decoction Cao Jinhua,Zhi Wenxing,Jia Huili,XuQiuping,Zhou Jing,Zhao Liang,Li Shengjian.Health Service Center,Dinghai Community,Yangpu District,Shanghai 200090,ChinaAbstract】O b j e c t i v e T o d e v e l o p a h i g h-p e r f o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y-d i o d e a r r a y d e t e c t i o n (H PLC-DAD)method for the determination of five anthraquinones(aloeemodin,rhein,emodin,chrysophanol and physcion)in rhubarb decoction.Methods A HPLC method was established to investigate the effects of different storagetemperatures and time on the concentration of five anthraquinones in rhubarb decoction.Separation was performedwith a gradient mobile phase system of acetonitrile-0.1%formic water solution,the flow rate was 1.0 ml/min,thetemperature of the column was 25,and the injection volume was 5 l.Results Five anthraquinones weresuccessfully separated using this method,with a good linear relationship in the corresponding concentration range.The precision,repeatability,stability and recovery were good.The five anthraquinones were basically stable within14 days after low-temperature storage,and basically stable within 3 days after normal temperature and high-temperature storage.Conclusion The HPLC-DAD method is stable,rapid and reproducible.It can be used todetermine the contents of five anthraquinones in rhubarb decoction.Rhubarb decoction has good stability under coldstorage conditions.Key words Rheum;Anthraquinones;Chromatography,high pressure liquid;Stability大黄的主要活性成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等一类葱醌类成分1,2 ,具有泻下、解热镇痛、抗癌、抗氧化、抗感染等作用3-7 。临床上常使用自动煎药机代替人工煎煮中药，而中药处方中经常有“先煎”“后下”的药材，一般预煎制备成小包装药液，服用前混入复方中。然而放置温度与时间等因素会影响活性成分的稳定性使代煎汤剂的治疗效果降低8 ,目前鲜有中药代D01:10.3969/j.issn.0253-9926.2023.16.003基金项目：上海市宝山区科技创新资金(19-E-55)作者单位：2 0 0 0 9 0 上海市杨浦区定海社区卫生服务中心药房(曹金华)；上海同济堂药业有限公司（支文星);上海市宝山区罗店医院新药临床研究中心（贾慧利），药剂科(须秋萍、周瑾、赵亮、李盛建）通信作者：李盛建,Email:煎液药效成分质量控制研究报道，质量监管的缺失以至无法保证其临床有效性。高效液相色谱-二极管陈列检测法(HPLC-DAD)是中药含量检测最为常用的方法,具有较高的特异质性、灵敏度、准确度等优点9,10 。本文以“后下”中药饮片大黄代煎液为研究对象，以特征性成分的浓度变化作为观察指标，采用HPLC-DAD法测定大黄代煎中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的浓度,考察放置温度与时间对药液稳定性的影响，并为今后制定“后下”中药代煎药液质量控制标准提供参考。1仪器试药及方法1.1仪器1/10万电子天平（德国sartorius公司），SK7200H型超声波仪（上海科导超声仪器有限公山西医药杂志2 0 2 3年8 月第52 卷第16 期ShanxiMedJ,August2023Vol.52.No.16司）,DK-320型恒温水浴箱子（上海精宏实验设备有限公司），高速低温离心机（赛默飞世尔科技有限公司），110 0 型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。1.2试药对照品芦荟大黄素（批号：518 9，纯度 9 8%）、大黄酸（批号：558 2,纯度 9 8%）大黄素（批号：4887，纯度 9 8%）、大黄酚（批号：5118，纯度98%）、大黄素甲醚（批号：7 38 5，纯度 9 8%)购自于上海诗丹德公司，大黄代煎液（批号：19 12 0 9、191216)购自本院中药房,色谱乙腈和色谱甲酸购自于美国Merck公司，水为双次蒸馏水。1.3色谱条件色谱柱为安捷伦Zorbax Cis柱(内径：4.6 mm,长度：2 50 mm，填料颗粒直径：5m），流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)体系;线性梯度洗脱程序如下:0 7 min,B:40%;716 min,B:40%85%；流速：1.0 ml/min，平衡时间：5min，柱温：25;进样量：5l,检测波长：2 54nm。1.4溶液的制备对照品储存液：使用1/10 万天平分别精密称定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品10.52、10.2 5、10.8 7、10.7 3、10.2 8 mg，加10ml甲醇溶解，得到浓度分别为1.0 52、1.0 2 5、1.087、1.0 7 3、1.0 2 8 m g/m l的各对照品储备液，冷藏备用；供试品溶液：取适量药液，经12 0 0 0 xg高速离心，取上清液体滤过，取续滤液即得大黄代煎液供试品溶液。1.5统计学方法使用SPSS19.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析和LSD-t法比较组间差异，检验水准=0.05。2结 果2.1系统适应性取大黄代煎液供试品、对照品溶液，按照上述色谱条件进样检测,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在色谱柱中的保留时间分别为化合物芦荟大黄素大黄酸大黄素大黄酚大黄素甲醚：12 1312.5、13.3、16.3、19.2、2 0.2 m i n，各成分分离度良好，无明显干扰峰。2.2标准曲线采用逐级稀释法，精密量取适量各对照品储存液加甲醇溶解，得到芦荟大黄素的浓度分别为10.52、2 1.0 4、52.6 0、10 5.2 0、2 10.40 g/ml,大黄酸浓度分别10.2 5、2 0.50、51.2 5、10 2.50、2 0 5.0 0 g/ml,大黄素的浓度分别为3.2 6.6.52、16.30、32.6 1、6 5.2 2ug/ml，大黄酚的浓度分别为5.37、10.7 3、2 6.8 2、53.65、10 7.3g/ml，大黄素甲醚的浓度分别为1.03、2.0 6、5.14、10.2 8、2 0.56 g/ml，将以上混合对照品溶液，按上述色谱条件进样检测。每个浓度样品平行检测分析3次，对浓度与色谱峰面积值进行线性回归分析,得到5种蒽醌类成分的线性回归方程和相关系数,如表1所示,线性关系和线性范围满足本实验要求。2.3精密度实验取低浓度（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的浓度分别为2 1.0 4、2 0.50、6.52、10.73、2.0 6 g/ml）、中（浓度分别为52.6 0、51.2 5、16.3026.82、5.14g/ml）、高（浓度分别为10 5.2 0、102.50、32.6 1、53.6 5、10.2 8 g/ml)浓度混合对照品溶液，按上述色谱条件进样检测，连续测定3d，记录色谱图，计算各待测物的浓度和精密度,结芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在低浓度下的日内精密度RSD值(%)分别为0.7 1%、0.52%、0.54%、0.7 8%0.43%，日间精密度RSD值（%）分别为2.0 4%、1.9 4%、1.9 8%、2.0 3%、2.0 0%；中浓度下的日内精密度RSD值(%)分别为0.49%、0.32%、0.2 0%、0.30%、0.16%，日间精密度RSD值(%)分别为1.35%、1.31%、1.49%、1.14%、1.0%;高浓度下的日内精密度RSD值（%)分别为0.13%、0.13%、0.13%、0.0 6%、0.14%（n=3），日间精密度RSD值(%)分别为1.40%、1.32%，1.56%、1.44%、1.4%；结果显示该方法精密度良好，符合中药含量测定方法学验证要求。表1大黄代煎液中5种葱类成分的标准曲线回归方程线性范围(g/ml)Y=20.22X+55.905.26210.4Y=16.84X+33.875.12205.00Y-15.55X+9.6591.6365.22Y=17.63X+19.962.68107.30Y=16.34X+3.0670.5120.56R20.99950.999 60.999 60.999 60.999 6：12 142.4重复性实验精密量取6 份相同批次的大黄代煎液，按上述制备方法和色谱条件进样分检测，记录色谱图，计算各待测物浓度,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的浓度分别为55.6 5、52.8 3、19.67、2 7.7 3、5.2 2 g/ml,RSD%分别为0.34%、0.25%、1.2 0%、0.8 8%、2.53%，结果示该方法重复性良好，满足实验要求。2.5样品稳定性试验分别在0,4,8,12,2 4h测定大黄代煎液供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，考察大黄代煎液供试品常温放置稳定性,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为0.19%、1.9 9%、2.0 0%、0.88%、3.0 6%，结果显示大黄代煎液供试品在2 4h内较稳定。化合物芦荟大黄素大黄酸大黄素大黄酚大黄素甲醚注：RSD:相对标准偏差组别冷藏组常温组高温组注：与同组内第0 天比较P0.05；第0 天：样品送达日山西医药杂志2 0 2 3年8 月第52 卷第16 期ShanxiMedJ,August2023,Vol.52.No.16精密量取大黄代煎液，加人适量待测物对照品溶液，平行操作6 份，按上述方法操作制备待测样品，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，计算加样回收率,结果如表2 所示，结果示本方法的回收率良好，满足实验要求。2.7大黄代煎液放置稳定性实验取3份大黄代煎液于样品送达日（第0 天），按“上述方法操作制备溶液，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种指标性成分的含量，剩余袋装药液于4(冷藏组),2 0(常温组),40（高温组)环境下保存1、3、7、14、2 1、2 8 d后，检测5种蒽醌类成分的含量，考察环境温度和放置时间对其稳定性的影响。结果如表3所示,与储存第0 天相比，低温存储2 1d、常温和高温储存3d后大黄代煎液中部分葱醌类成分的含量显著性降低(P0.05)。表2 加样回收实验结果回收率(%)12103.3299.56101.81102.50101.30102.8899.21100.48103.1195.97表3不同储存条件下大黄代煎液中5种葱醌类成分含量(xs,n=3)第0 天第1天芦荟大黄素56.620.25大黄酸53.990.67大黄素19.700.34大黄酚26.510.45大黄素甲醚4.970.23芦荟大黄素56.620.25大黄酸53.990.67大黄素19.700.34大黄酚26.510.45大黄素甲醚4.970.23芦荟大黄素56.620.25大黄酸53.990.67大黄素19.700.34大黄酚26.510.45大黄素甲醚4.970.232.6回收率3496.37101.07103.20104.35100.5197.36104.7197.5295.97103.11第3天56.090.4555.350.3553.830.4253.810.2718.990.3419.100.1026.700.1226.980.294.940.304.770.2754.310.7053.982.07452.880.0352.780.6219.360.0718.890.2425.220.9825.091.154.630.314.870.3554.701.9452.941.32a53.250.0352.620.2119.010.2317.960.53a25.091.4823.861.8344.570.354.280.3845101.0796.4899.7299.2198.35第7 天55.450.8052.980.3020.151.4526.740.574.750.4152.530.55a52.460.5918.840.1324.771.3144.380.2551.600.45451.590.48416.740.9722.901.4843.730.3146102.95104.3599.7296.25100.73第14天55.510.4752.560.3919.851.5126.091.204.650.1149.910.81451.710.21a17.391.37423.710.35a4.240.4145.620.96a48.421.18a14.510.83a20.742.22a3.060.12*平均值RSD(%)100.722.52102.122.88100.251.8499.562.9499.543.30第2 1天第2 8 天55.561.2055.201.12a51.270.5150.600.86a19.812.1419.211.6625.431.4625.320.484.550.134.400.24a46.112.64a43.341.56a50.191.19a48.112.41a16.101.87415.011.51422.090.5821.160.943.830.193.500.2540.260.49a37.772.66a44.151.20a41.281.14a12.220.13a10.720.41a18.101.62a16.510.65a2.590.2142.140.184ng/ml山西医药杂志2 0 2 3年8 月第52 卷第16 期ShanxiMedJ,August2023,Vol.52.No.163 讨 论中药材饮片从固体变为液体状态，其质量可能处于不稳定状态，后期的质量控制管理较为重要。本文以我院常用“后下”品种大黄为例，建立有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的HPLC含量测定方法，该分析方法具有快速、准确、方便等特点；采用该法考察储存温度和时间对大黄代煎液稳定性的影响，为今后制定“后下”中药代煎药液质量控制标准提供实验依据。预实验中比较了不同填料色谱柱和甲酸水、甲醇、乙腈、磷酸盐溶液等不同流动相体系对待测成分色谱分离的影响，最终确定AgilentZorbaxCis柱（内径：4.6 mm，长度：2 50 mm，填料颗粒直径：5m)色谱柱、0.1%甲酸-乙腈作流动相梯度洗脱,该方法下样品中5种待测成分峰形良好，能达到基线分离。本文将5种葱醌类成分含量变化作为考察指标，考察储存温度和时间对大黄代煎液稳定性的影响。结果显示冷藏(4)储存的药液质量基本稳定，第2 8 天后，5种葱醌类成分（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)分别降到最初浓度的9 7.5%、9 3.7%、9 7.5%、9 5.5%、8 8.5%；常温(2 0)储存的药液较为稳定,第2 8 天后,5种葱醌类成分分别降到最初浓度的7 6.5%、8 9.1%、7 6.2%、79.8%、7 0.4%；高温（40）储存的药液较为不稳定，第2 8 天后，5种葱醌类成分分别降到最初浓度的6 6.7%、7 6.4%、54.4%、6 2.3%、43.0%。由此提示，低温储存药液种的有效成分较为稳定，冷藏更利于大黄代煎液的质量稳定性。在本院对代煎企业的日常质控中发现代煎中药成品通常室温储存，且部分成品储存时间超过本文药液成分稳定的期限，不当的储存环境和超期限的储存可能影响其临床疗效，这为医疗机构对代煎企业的监管起警示作用。总之,中药饮片被煎煮加工成为液体形态，往往比固体形态更加不稳定，其活性成分的稳定性决：12 15定中药代煎液的储存环境和保质期限，为了使医疗机构对代煎企业开展更好的质量监控，本研究以大黄代煎液为例，建立了5种蒽醌类活性成分的HPLC含量测定方法，该方法能够快速、准确地测定活性成分含量，可以应用于大黄代煎液中蒽醌类成分的稳定性研究。该研究有助提高医疗机构对企业的代煎业务监管能力，并从有效成分含量的角度为代煎液质量体系的制定提供数据支持。参考文献1 王立雪.基于生物活性的大黄质量控制研究D.北京：中国中医科学院,2 0 2 0.D0I：10.2 7 6 58/d.c n k i.g z z y y.2 0 2 0.0 0 0 17 8.【2 何元松，李焙仪，孟保华.大黄的研究现状J.成都大学学报（自然科学版），2 0 2 2，41(2)：113-118.DOI：10.39 6 9/j.isn.1004-5422.2022.02.001.【3】吴晓青，胡昌江，赵玲，等.生、熟大黄泻下作用及其机制研究J.中药材，2 0 14，37(9)：156 2-156 5.D0I:10.13863/j.issn1001-4454.2014.09.014.【4张珊珊，林琦雄，王明.大黄抗肿瘤研究进展J中国中医药现代远程教育，2 0 2 1，19（13)：19 5-2 0 1.D0I:10.3969/j.issn.1672-2779.2021.13.073.5】张开弦，姚秋阳，吴发明，等.大黄属药用植物化学成分及药理作用研究进展J中国新药杂志，2 0 2 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