大黄芩鱼散半仿生提取物对鹅沙门氏菌生长的影响.pdf
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1、中国饲料2023 年第 17 期基金项目院2021年大学生创新创业训练项目渊X202110160081冤曰辽宁省民生科技计划项目渊2021JH2/10200009冤作者简介院郑心钰渊2001-冤袁女袁动植物检疫专业袁E-mail院*通讯作者院王宏军渊1977-冤袁男袁博士袁教授袁主要从事中兽 药 新 制 剂 研 发 及 其 抗 菌 机 制 研 究 袁E-mail院大黄芩鱼散半仿生提取物对鹅沙门氏菌生长的影响郑心钰1袁 孙健2袁 王宏军1*袁 古玛纳1袁 杨一妍1袁 博意1渊1.锦州医科大学畜牧兽医学院袁辽宁锦州 121001曰2.北京农业职业学院袁北京房山 102442冤DOI院10.1590
2、6/11-2975/s.2022100011-08摘要 本研究旨在探讨大黄芩鱼散半仿生提取物渊SEDQS冤对鹅沙门氏菌的体外抗菌活性遥 采用微孔-平板法测定最小抑菌浓度渊MIC冤袁分光光度法和试剂盒法测定不同浓度 SEDQS 对鹅沙门菌生长曲线尧呼吸代谢系统尧可溶性蛋白的影响遥 结果显示院SEDQS 对鹅沙门菌的 MIC 为渊9.10 依 0.11冤mg/mL袁1/4 MIC 2 MIC 的 SEDQS 均能显著抑制鹅沙门氏菌的正常生长袁且最高抑制率为 68.4%曰能显著升高碱性磷酸酶渊AKP冤的含量渊P 0.01冤袁升高率达到88.2%曰使细菌的核酸尧蛋白质等大分子物质显著泄漏渊P 0.01
3、冤袁且最高泄漏率为 92%曰还能显著地抑制琥珀酸脱氢酶渊SDH冤和苹果酸脱氢酶渊MDH冤的活性渊P 0.01冤袁并呈现剂量依赖性遥 由此表明袁SEDQS 通过破坏鹅沙门氏菌的细胞壁和细胞膜结构袁影响其呼吸代谢而发挥体外抗菌活性遥关键词 大黄芩鱼散曰半仿生提取物曰抗菌活性曰鹅沙门氏菌中图分类号 S816.7文献标识码 A文章编号 1004-3314渊2023冤17-0062-04大黄芩鱼散渊DQS冤为叶中华人民共和国兽药典曳渊2020 年版冤收录的鱼用抗菌类中兽药制剂袁有清热解毒的功效袁 主治鱼虾类的细菌性烂鳃病遥 王宏江等渊2009冤提出袁大黄芩鱼散通过拌饵给药袁可能混合不均袁出现个体差异袁不
4、能很好地发挥疗效遥 于是本课题组李虹颖等渊2020冤开展了大黄芩鱼复方中药泡腾片制备工艺尧 质量评价的研究袁古玛纳渊2022冤开展了大黄芩鱼散半仿生提取物渊SEDQS冤制备工艺尧化学成分及其体外抗鹅沙门氏菌的研究遥 在此基础上袁本研究探讨了 SEDQS 体外对鹅沙门氏菌生长性能的影响遥1材料与方法1.1材料大黄芩鱼散半仿生提取物渊锦州医科大学动物药学实验室制备冤曰营养肉汤尧营养琼脂渊北京奥星生物技术有限责任公司冤曰 碱性磷酸酶渊AKP冤检测试剂盒尧苹果酸脱氢酶渊MDH冤检测试剂盒尧琥珀酸脱氢酶渊SDH冤检测试剂盒渊南京建成生物技术研究所冤曰Bradford 蛋白浓度测定试剂盒渊碧云天生物科技有
5、限公司冤曰鹅沙门氏菌渊锦州医科大学周铁忠教授鉴定馈赠冤遥1.2仪器DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱渊上海一恒有限公司冤曰HZQ-C 恒温摇床培养箱渊上海一恒科技有限公司冤曰Tecan 酶标仪 渊瑞士Tecan 公司冤曰SW-CJ-2FD 超净工作台渊苏州净化有限公司冤曰UV-1800 紫外可见分光光度计渊上海美谱达仪器有限公司冤遥1.3试验方法1.3.1MIC 的测定精确称取 SEDQS 加水溶解配制成浓度为 100 mg/mL袁 采用徐淑云等渊1994冤提出的活菌计数法调整细菌浓度为106cfu/mL袁采62中国饲料2023 年第 17 期图 1SEDQS 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响
6、图 2SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中核酸物质光密度的影响用 Jiang 等 渊2013冤 报道的微孔-平板法测定SEDQS 对鹅沙门氏菌的最小抑菌浓度 渊MIC冤袁重复 3 次遥1.3.2SEDQS 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响按照朱艳蕾 渊2016冤 报道的细菌生长曲线测定方法袁测定不同时间点 SEDQS 对鹅沙门氏菌在营养肉汤中生长的影响遥 以培养时间为横坐标袁600 nm波长下的 OD 值为纵坐标袁 绘制不同浓度SEDQS渊2MIC尧MIC尧1/2MIC尧1/4MIC冤 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响袁重复 3 次遥1.3.3SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中核酸物质的影响按照黄燕飞渊2016
7、冤报道的方法袁在波长260 nm 下袁用 UV-1800 型紫外-可见分光光度计测定不同浓度 SEDQS 与鹅沙门氏菌共培养后上清液中 DNA尧RNA 的 OD 值袁重复 3 次遥1.3.4SEDQS 对鹅沙门氏菌细胞壁的影响将104CFU/mL 鹅 沙 门 氏 菌 加 入 到 含 不 同 浓 度SEDQS 的营养肉汤中共培养袁按照黄燕飞渊2016冤报道的方法测定样品中碱性磷酸酶 渊AKP冤 的含量袁重复 3 次遥1.3.5SEDQS 对鹅沙门氏菌呼吸代谢系统的影响取鹅沙门氏菌与不同浓度 SEDQS 的共培养物袁按照蛋白浓度测定试剂盒尧SDH 试剂盒尧MDH试剂盒说明书及孙嘉一渊2019冤报道
8、的方法袁测定蛋白标准曲线及样品中 SDH 浓度和 MDH 浓度遥1.3.6数据处理和统计分析试验数据以 野平均数依标准误差冶 表示遥 P 0.01 表示数据差异极显著曰P 0.05 表示数据差异不显著遥2结果2.1SEDQS 体外对鹅沙门氏菌的 MICSEDQS体外对鹅沙门氏菌的 MIC 为渊9.10 依 0.11冤mg/mL遥2.2SEDQS 体外对鹅沙门氏菌生长曲线的影响如图 1 所示袁对照组细菌在 6 h 前快速繁殖袁10 h后进入生长稳定期遥 与对照组相比袁当 SEDQS 浓度为 2MIC尧MIC 时袁 对鹅沙门氏菌增殖有显著的抑制作用 渊P 0.05冤袁 抑制率分别为 50.8%68
9、.4%尧33.9%50.6%曰当 SEDQS 浓度为 1/2MIC时袁早期对鹅沙门氏菌增殖有显著的抑制作用渊P 0.05冤袁抑制率为 30.8%遥 在 1/2MIC 2MIC袁鹅沙门氏菌的生长没有表现出明显的对数阶段遥 这表明 SEDQS 对鹅沙门氏菌有明显的抑制作用遥2.3SEDQS 对鹅沙门氏菌核酸物质的影响如图 2 所示袁不同浓度的 SEDQS 与鹅沙门氏菌共培养的菌液 OD260nm值极显著高于对照组 渊P 0.01冤袁当 SEDQS 浓度为 2MIC 时袁鹅沙门氏菌培养液中DNA尧RNA 核酸大分子物质泄漏率为 74.3%92%袁 当 SEDQS 浓度分别为 MIC尧1/2MIC 和
10、 1/4MIC 时核酸大分子物质泄漏率分别达到 67.2%89%尧56.5%86.3%和 66%83.3%曰 不同浓度的 SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中 DNA尧RNA 等核酸大分子有显著性影响渊P 0.05冤袁且呈现剂量依赖性遥2.4SEDQS 对 AKP 活性的影响不同浓度SEDQS 能够极显著提高鹅沙门氏菌胞外 AKP 含量渊P 0.01冤袁与对照组相比袁当 SEDQS 浓度为2MIC 时袁 鹅沙门氏菌培养液中 AKP 含量升高了44.4%88.2%袁当 SEDQS 浓度分别为 MIC尧1/2 MIC和 1/4MIC 时 AKP 含量升高了 37.5%84%尧16.6%75%和 10.
11、5%63.6%袁 且与 SEDQS 浓度成正比遥图 3 所示袁不同浓度 SEDQS 组 AKP 含量在 10 h 达到峰值袁 由此表明 SEDQS 对细菌细胞壁有一定的破坏作用遥时间/h时间/h63中国饲料2023 年第 17 期组别对照组0.027依0.0080.803依0.091驻OD570nm蛋白质含量/渊mg/mL冤32.978依0.788SDH活性/渊U/mg prot冤1/4MIC0.023依0.0110.717依0.10624.296依0.556*1/2MIC0.012依0.0030.65依0.07919.262依0951*MIC0.008依0.0020.592依0.05710.
12、818依0.689*2 MIC0.003依0.0010.519依0.0297.647依1.127*注院与对照组比较袁*表示有显著差异袁P 0.01曰下同遥表 1SEDQS 对细菌 SDH 的影响表 2SEDQS 对细菌 MDH 的影响组别对照组0.057依0.0190.803依0.091驻OD340nm蛋白质含量/渊mg/mL冤43.013依0.650MDH活性/渊U/mg prot冤1/4MIC0.041依0.0140.717依0.10635.856依0.586*1/2MIC0.03依0.0070.65依0.07930.172依0.281*MIC0.024依0.0040.592依0.0572
13、0.649依0.582*2 MIC0.008依0.0010.519依0.02911.039依0.772*图 3SEDQS 对 AKP 含量的影响时间/h2.5SEDQS 对鹅沙门氏菌呼吸代谢系统的影响标准蛋白质浓度的回归方程为 Y=0.7632X+0.5095袁R2=0.9746渊n=6冤曰表 1 显示袁1/4MIC尧1/2MIC尧MIC 和2MIC 组的 SDH 活性分别比对照组降低了 26.32%尧41.59%尧67.19%和 76.81%渊P 0.01冤曰SEDQS 对MDH 活性 的 影响见 表 2袁1/4MIC尧1/2MIC尧MIC尧2MIC 组的 MDH 活性分别比对照组降低 16
14、.63%尧29.85%尧51.99%尧74.33%渊P 0.01冤遥 由表 1 和表 2可知袁2.27 18.2 mg/mL 的 SEDQS 能够显著抑制鹅沙门氏菌的 SDH尧MDH 活性渊P 0.01冤遥3讨论3.1SEDQS 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响李凡等渊2008冤提出袁细菌生长曲线在科学研究和生产实践中具有指导意义袁朱艳蕾渊2016冤用 OD600 nm值显示细菌生长情况遥 于是本项研究也采用该方法测定了不同浓度的 SEDQS 对鹅沙门氏菌生长的影响袁结果表明 SEDQS 能够显著抑制鹅沙门氏菌的繁殖和生长并呈剂量依赖性遥 另外袁Zhang 等渊2017冤报道袁细菌生长分为 4 个阶
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