次氯酸钠对口腔综合治疗台水路消毒效果的研究.pdf

247Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 次氯酸钠对口腔综合治疗台水路消毒效果的研究*刘振华，陈永刚，姜楠，李洋，卢冬梅，杨怀义，范婷文，富大鹏 摘要 目的观察 7.5 次氯酸钠对口腔综合治疗台水路（dental unit water lines,DUWLs）的消毒效果，并通过电镜观察消毒前后旧管路及全新管路的生物膜结构变化，为 DUWLs 的有效消毒方案提供参考。方法 随机选取 13 台使用 3.5 年的 A-dec 口腔综合治疗台（dental chair unit,DCU）作为研究对象，用 7.5 的次氯酸钠进行水路消毒，对消毒前即刻、消毒后 0、24、48 h 的水样进行菌落计数；同时随机选取两台 DCU 对消毒前即刻、消毒后 0、24、48 h 水气枪处出水管管路内壁进行电镜生物膜观察；上面两台 DCU 在更换全新管路后进行 30 d的水样菌落计数和 60 d 的生物膜电镜观察。结果 使用 3.5 年的 DUWLs 消毒后即刻与消毒前相比，细菌菌落数量明显降低，差异有统计学意义（P 0.01），消毒后 24 h 与消毒后即刻相比，差异无统计学意义（P 0.05），均 100CFU/ml，符合北京市口腔综合治疗台消毒技术规范诊疗用水标准；电镜下观察消毒后 DCU 内壁的生物膜结构受到一定程度破坏，但是基质及部分细菌仍然存在；新管路消毒后 30 d 内的细菌菌落计数基本符合诊疗用水标准，全新管路 60 天内未见成熟生物膜形成。结论 7.5 的次氯酸钠消毒液能有效地降低 DUWLs 内的菌落总数，并破坏管壁的生物膜结构，起到较好的消毒效果，但对不同使用年限的DCU，为达到北京市诊疗用水标准，消毒频次应有所区别。关键词 口腔综合治疗台水路；细菌感染；感染控制；生物膜 中国图书分类号 R783 文献标识码 ADOI:10.19749/.cjgd.1672-2973.2023.04.011A Study of the Disinfection Effect of Sodium Hypochlorite on the Dental Unit waterlinesLIU Zhen-hua,CHEN Yong-gang,JIANG Nan,LI Yang,LU Dong-mei,YANG Huai-yi,FAN Ting-wen,FU Da-peng(Department of Stomatology,Beijing Zhongguancun Hospital,Beijing 100190,China)AbstractObjective To observe the disinfection effect of 7.5 sodium hypochlorite on dental unit water lines(DUWLs),and observe the changes of biofilm structure of old and new pipes before and after disinfection through electron microscopy,so as to provide reference for effective disinfection of DUWLs.Methods Thirteen A-dec dental chair units,which have been used for 3.5 years,were randomly selected as the research objects,and 7.5 sodium hypochlorite was used for disinfection.The colonies were counted in the water samples immediately before disinfection and 0,24 and 48 h after disinfection Two DCUs were randomly selected to observe the biofilm before and after disinfection at 0,24,and 48 hours by scanning electron microscopy(SEM).The bacterial colony count of the water samples was counted for 30 days and the biofilm was observed by SEM for 60 days after the two DUWLs was replaced.Results Immediately after disinfection,the number of bacterial was significantly lower compared to before disinfection,and there was significant between them(P 0.01).The difference between 24 hours after disinfection and immediately after disinfection was not statistically significant(P 0.05).The biofilm structure on the inner wall of the DUWLs was partially destroyed for 48 hours after disinfection under SEM,but the matrix and some bacteria still existed.The bacterial colony count within 30 days after disinfection of the new waterlines basically met the local standard in Beijing,which is less than 100 CFU/mL,and no mature biofilm was formed within 60 days.Conclusion The 7.5 sodium hypochlorite can effectively reduce the total number of colonies in DUWLs and destroy the biofilm structure of the tube wall,and play a good disinfection effect.However,the disinfection frequency should be different for DCUs with different years of use to meet the local standards in Beijing.Key wordsDUWLs;Bacterial infections;Infection control;Biofilm 基金项目 海淀区卫生健康发展科研培育计划(HP2021-12-20101)作者单位 100190，北京市中关村医院口腔科（刘振华，陈永刚，姜楠，李洋，卢冬梅，富大鹏）100101 北京，中国科学院微生物所（杨怀义，范婷文）前两位作者对本文有同等贡献，均为共同第一作者 通信作者 富大鹏，E-mail:论著248 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 口 腔 综 合 治 疗 台 水 路（dental unit water lines,DUWLs）为水气枪、牙科手机、超声洁牙器等 DCU 的附属设备提供诊疗用水，由于其管路细窄而长，在使用过程中容易形成生物膜，在水流冲击作用下生物膜不断脱落，造成DUWLS 持续污染。研究证实，未经化学消毒处理的 DUWLS 中，细菌含量可高达 105 CFU/mL1-2。在治疗过程中，污染的 DUWLs 中大量的微生物会进入患者口腔，或形成气溶胶散发在诊室空气中，成为医院感染的潜在危险因素3-7。因此，应加强对 DUWLs 的管理，目前以化学方法处理为首选。国内用于 DUWLS 的消毒剂主要有次氯酸钠、酸性氧化电解水、臭氧水、过氧化氢、二氧化氯、草本植物等8-13。次氯酸钠是目前进行DUWLs 消毒最常使用的消毒剂之一，研究表明，110 的 NaClO 均可有效杀灭管路中的细菌12。根据牙椅水路维护保养说明，同时考虑到临床工作中的方便配制，易于操作，本研究选用 7.5 次氯酸钠消毒剂对水路进行消毒干预，评估消毒效果；并在电镜下观察使用 3.5 年 DUWLs 中的生物膜在消毒前后的变化，以及全新 DUWLs 中生物膜的形成，为探寻有效的消毒方案提供证据支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 营养琼脂培养基 按照 GB/T 5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标14配制营养琼脂培养基。本实验所需材料包括：蛋白胨 10 g、肉膏 3 g、氯化钠 5 g、琼脂 15 g、蒸馏水定容至 1 L，9 cm 培养皿、500 ml 锥形瓶、无菌封口膜、7.5 次氯酸钠消毒液、无菌生理盐水、离心管 15 ml、75%乙醇棉球。培养基PH 值调至 7.2。使用高压蒸汽灭菌锅，121C下高压灭菌 15 min。1.1.2 仪器设备 A-dec 300 DCU（A-dec Inc，美 国），迅 数 supreG 10 全 自 动 菌 落 计 数 仪（杭州迅数科技有限公司），SU8010 扫描电镜（Hitachi，日本），生物安全柜。1.2 实验方法1.2.1 研究对象 实验一：简单随机抽样选取某二级医院口腔科 20 台 Adec 300 口腔综合治疗台中的 13 台，均正常用于口腔诊疗工作，使用年限 3.5 年，每天接诊 810 人，采集高速手机、水气枪这两个位点消毒前即刻、消毒后 0、24、48 h 的水样用于细菌菌落总数计数。简单随机抽样选择 2 台 DCU，剪取消毒前即刻、消毒后0、24、48 h 水气枪管路内壁进行电镜下生物膜观察。实验二：实验一完成后将上述 2 台 DCU 的所有管路更换为全新管路，正常进行诊疗工作，每日接诊 810 人，消毒后进行 30 d 每天的水样菌落计数和 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 d 水气枪处出水管管路内壁生物膜进行电镜下观察。1.2.2 水路消毒及采样方法 水路消毒 根据牙椅水路维护保养说明进行消毒，先对储水罐进行消毒，导入 100ml 消毒液至储水罐中，瓶口朝上，约 5 s，静置 10 min，再次摇动，清空，用蒸馏水冲洗两次。倒空余水，将储水罐安装于 DCU，按压排空按钮直至各连接管路排出空气。摘下储水罐，注入新鲜配制的 7.5NaClO消毒液 500 ml，反复摇动 10 s 后，将储水罐安装于 DCU，踩脚踏控制板，冲洗水路 2 min 关闭电源，保持消毒剂与 DUWL 内壁接触 20 min后摘下储水罐，倒掉多余的消毒液，将空储水罐安装回 DCU，打开电源，按排空按钮，排干水分直至各连接管路排出空气。关闭电源，切换用水为市政用水，打开电源，踩脚踏控制板，冲洗管路，直到诊疗用水均匀稳定的流出后再继续冲洗约 2 min。水样采样：采样时冲洗管路 30 s，用 75%乙醇棉球擦拭采样点，干燥后使用无菌采样管，每一个采集点采集 10 ml 水样。贴标签后保存在4 冰箱中，2 h 内送往中科院微生物实验室进行检验。生物膜采样：采样前先用 75%乙醇消毒水气枪管路外表面，0.9%氯化钠溶液冲洗后剪取水气枪出水口处管路 1cm，置于做好标识的戊二醛溶液试管内密封 4冷藏，2 h 内送至中科院微生物所实验室进行生物膜结构观察。以上操作均由 2 名经过实验室操作培训的医务人员完成。按国家卫生部 2002 版消毒技术规范要求常规消毒、采样与运送样本，整个实验过程遵守无菌操作原则。1.2.3 检测方法 菌落培养和计数：以无菌操作方法，用灭菌吸管吸取 1 ml 充分混匀的水样，249Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 注入灭菌平皿中，倾注已融化并冷却到 45左右的培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀，均匀铺板于培养皿中，保证稀释样品后平铺后，每个培养皿的菌落数大于 20 CFU，不超过 300 CFU，进行菌落总数记录，每次检验做 3 个平行接种，结果取平均数，另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。生物膜的电镜观察：将样本置于无菌的 4%多聚甲醛内固定 1 h，采用 30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水各 10 min 取出，自然干燥。将标本固定于专用铝座上，使用喷金仪喷涂约 2 nm 金粉，在电镜下，采用各种放大倍数进行观察，对代表性区域采用黑白胶片拍摄。拍 摄 比 例 放 大 倍 数 为：500、1000、2000等。扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察，由中国科学院微生物所扫描电镜室完成。1.3 统计分析 应用Excel表格进行数据录入，SPSS 23.0 进行数据分析。计数资料采用例数或百分比表示，定量资料的描述采用平均值 标准差，消毒前后细菌菌落总数的比较采用单因素方差分析，P 0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 消毒前后 不同时间点高速手机和水气枪中的细菌菌落总数计数对比（表 1，图 1）表 1 消毒前后不同时间点高速手机和水气枪中的细菌菌落总数(xs),CFU/mL采样位点消毒前即刻消毒后即刻1 天2 天3 天4 天5 天水气枪3077350832471852469382672353496618197高速手机21536920.81731413312227743249238283685图 1 消毒前与消毒后 5 天内高速手机和水气枪中的细菌菌落总数（CFU/ml）消毒后即刻与消毒前相比，细菌数量明显降低，差异有统计学意义（P 0.01），消毒后 24 h 与消毒后即刻相比，差异无统计学意义（P 0.05），消毒后即刻和消毒后 24 h 其细菌菌落总数均符合北京市口腔综合治疗台消毒技术规范地方标准，低于 100 CFU/mL。图 1 提示消毒后水路中的细菌菌落总数升高并非线性，期间会出现一定反复。2.2 使用 3.5 年 DCU 消毒前后管路生物膜形态观察 消毒前的 DCU 管路表面，具有丰富的菌落形态和生物产生的基质（图 2），形成了致密的生物膜结构，其中球菌和杆菌分布于基质中。而消毒后的 DCU 管路中，菌落明显减少，但仍然存在少量的生物膜基质和残留微生物未完全消除（图 3-5）。图 2 消毒前生物膜图 3 消毒后即刻 DCU 管路生物膜形态250 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 图 4 消毒后 24 小时 DCU 管路生物膜图 5 消毒后 48 小时 DCU 管路生物膜2.3 更换全新管路后菌落计数（表 2）和生物膜电镜观察（图 6）2.3.1 更换全新管路后 1 个月内 DUWLS 菌落计数 两台 DCU 更换了全新管路后，一个月内DUWLS 中细菌菌落总数基本控制在 100CFU/ml以内。而旧管路在 48 h 之后已严重超标（图 7）。表 2 应用 7.5次氯酸钠消毒剂消毒新的 DUWLs 后的细菌菌落总数（CFU/ml）采样时间（天）1 号 DCU 各位点细菌菌落数（CFU/ml）2 号 DCU 各位点细菌菌落数（CFU/ml）水气枪高速手机洁牙机水气枪高速手机洁牙机 1 0 00000 2 0 0 0000 3 0 00000 4 0 00000 5 0 00000 6 0 00000 7 0390000 8 0 000180 942 3162024610 16023717203211129 00362891272 0 0970013 0 0000014 0 0 000015 0 0000016 1 0010017 0 1010018 7 00190019 0 0000020 0 0000025 5 2021230 2 0 12212图 6 两台牙椅新旧管路消毒后 5 天内菌落总数（CFU/ml）2.3.2 更换全新管路后生物膜电镜观察 电镜观察结果显示，全新管路从第 1 天开始，微生物数量逐渐增多，但在使用 60 d 时，尚未形成具有一定厚度和均质的生物膜。使用 3.5 年的旧管路消毒后即刻电镜观察结果（图 3）生物膜比新管路生物膜明显致密。3 讨 论3.1 次氯酸钠对 DUWLs 内生物膜的影响 DUWLs中存在着细菌生物膜，在 DCU 工作时，水流的剪切力会导致生物膜从管壁分离，分离的生物膜可在管路内重新定植形成新的生物膜或者随水流流出，进入患者口腔或者形成气溶胶以及喷溅物污染环境，增加院内交叉感染的风险4,15。因此，对于 DUWLs内的生物膜，应注意及时清洗和消毒，以保证管路251Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 图 7 全新 DCU 管路不同时间点生物膜电镜图内微生物数量的控制，避免院内感染的发生。生物膜的形成是一个复杂的过程，包括初级附着、次生附着、稳定和成熟等阶段16。在第三阶段生物膜初步形成后，生物膜内部的细胞密度不断增加，其中部分能分化成浮游微生物释放到水路中，细胞间的相互作用也不断加强，此阶段生物膜更加稳定和难以清除16-18。Meiller 等19研究表明，化学消毒剂可以杀死细菌和其他微生物并破坏生物膜结构。次氯酸钠是目前进行DUWLs消毒最常使用的消毒剂之一，它是一种广谱抗菌消毒剂，能够破坏细胞结构和代谢功能，从而杀死细菌和其他微生物；此外次氯酸钠能够释放出氯离子，降低水的 pH 值，形成酸性环境，这种环境不利于细菌和其他微生物生长和繁殖，从而杀灭细菌并抑制生物膜的重新形成17,20本研究结果显示，经 7.5 次氯酸钠消毒后诊疗用水中的细菌菌落总数明显降低，与消毒前存在显著差异，证明次氯酸钠对细菌有显著的杀灭作用。同时电镜结果显示，消毒前管路内壁生物膜致密，细菌分布密集，形态多样，呈点状、线状、片状等；可见球菌和杆菌（图 1），具有成熟生物膜的结构特征。经过次氯酸钠消毒后生物膜结构被破坏，但仍有基质存在（图 3-5）。因此，7.5次氯酸钠消毒剂有明显的杀菌和破坏生物膜结构的作用，但一次消毒并不能完全去除生物膜。对于使用 3.5 年的 DCU，本实验仅观察了消毒后 48 h 的生物膜，发现次氯酸钠消毒后生物膜基质仍有残留，至于完全清除生物膜所需要的消毒时间尚需进一步深入研究。同时次氯酸钠对于真菌、病毒等的消毒效果、长期使用后的金属腐蚀性等仍需进一步探索5。3.2 DCU 管路维护常用方法 在 DCU 管路维护中，有物理措施和化学方法，用于清洁水路，保证水质的安全。物理措施如安装过滤器、使用无菌水、防回吸手机，冲洗水路等，然而生物膜一旦形成，物理措施并不能去除20-23，需要采用化学消毒的方法，以达到最佳的清洁效果，化学消毒有间歇性消毒和持续性消毒两种方式。本实验采用 7.5%次氯酸钠冲洗进行持续消毒，操作相对复杂，并且不能保证 DCU 水路的长时间内稳定的消毒效果，最佳的作用浓度、时间、频次等因素需要进一步的实验探索，但与低浓度消毒因子（如次氯酸）持续消毒方式比较，经过充分冲洗后，消毒剂不会有余氯积聚在水路中，不会对治疗产生不利影响。3.3 更换全新管路后菌落计数及扫描电镜的观察 对于更换全新管路后的 DUWLs，菌落微生物检测发现，其菌落总数计数在 30 d 内基本控制在 100CFU/ml 以内，符合北京市口腔诊疗用252 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 水的卫生标准。生物膜电镜观察发现，新换管路10 d 时管壁上开始有微生物的附着，随着时间的延长管壁微生物逐渐增加，30 d 时可达到一定数量，但还不足以形成生物膜，45 d 时管壁上开始有大量的微生物积累，生物被膜开始形成，到60 d 时，生物被膜虽未完全形成，但已在电镜下可见（图 7）。这提示我们需要提前综合考虑各方面的影响因素，采取措施来减少管路上微生物的附着，抑制生物膜的形成，以保证水质符合卫生标准。3.4 本研究局限 本研究仅针对 DCU 管路进行了消毒前后细菌培养和电镜下的生物膜观察，此品牌牙椅在制造过程中加入 AlphaSan，其中的银离子有抑制生物膜形成的作用。不同品牌的牙椅在设计和制造材料上存在差异，可能具有不同的表面性质和抗菌能力，会影响管路内生物膜的形成；同时不同品牌牙椅的管路内径不同，Sacchetti 等24对比了 1.6 mm 和 4.0 mm 内径的管路中的水质情况，结果表明 4.0 mm 的管路中的菌落数量更少，这可能是因为小直径的管路拥有更高的表面积体积比，更有利于细菌定植。此外，本研究只截取了水气枪出水口处的管路进行生物膜电镜观察，并未对不同出水口管路的不同位置同时进行观察，而不同出水口由于使用频次及诊疗中所起的功能不同，也会导致生物膜菌落的差异，不同位置由于重力作用不同，在最低位置可能会有更多生物膜形成，这也是本研究的局限性之一。由于这些潜在的影响因素，应对不同品牌、型号和内径的牙椅管路进行比较研究，以更全面地了解管路内生物膜的形成规律。4 结 论 本研究表明，7.5 的次氯酸钠在短时间内能有效地杀灭 DUWLs 中的细菌，一定程度上破坏生物膜的结构，但其长期的应用观察、杀灭管路中微生物的种类和数量，以及长期使用后对管壁的腐蚀程度尚待进一步的深入研究；对于新、旧管路的化学消毒频次，尚需根据各单位牙椅的品牌、不同使用年限、诊疗情况等因素进行具体分析。本研究结果提示，对于 A-dec 300 新牙椅在规范使用的基础上，可保持每月消毒 1 次的频率，而对使用过已形成成熟生物膜的使用期限为 3.5年的牙椅，前期需要 2 天消毒一次，直至生物膜完全清除，回到基线后，可保持每月一次的频次。但因本研究样本量小，此结论尚需进一步研究。参考文献1 江宁，徐春华，田靓，等.上海市医疗机构口腔综合治疗台水污染情况调查 J.中国消毒学杂志,2014,31(7):729-731,735 Jiang N,Xu CH,Tian L,et al.Investigation of contamination situation of dental unit waterlines in department of stomatology in shanghai.Chin J Disinfect,2014,31(7):729-731,7352 沈瑾，苏静，孙惠惠，等.牙科综合治疗台水路污染状况调查J.中国卫生标准管理,2014,5(8):71-74 Shen J,Su J,Sun HH,et al.Investigation of Water Pollution in Dental Units WaterlinesJ.Chin Health Stand Manage,2014,5(8):71-743 Francolini,Donelli.Prevention and control 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