提取分离与鉴定的方法与技术.pptx

第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术学习目标：1.熟悉系统溶剂分离法的原理及应用。2.掌握两相溶剂萃取法的原理和操作技术。3.掌握分配系数的概念。4.熟悉两相溶剂萃取法的溶剂选择。第一节 提取方法与技术第二节 分离精制和鉴定的方法与技术第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术第二节 分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术二、两相溶剂萃取法三、沉淀法四、结晶与重结晶法五、透析法六、分馏法七、色谱法第二节第二节 分离精制和鉴定的方法与技术分离精制和鉴定的方法与技术 一、系统溶剂分离法一、系统溶剂分离法是是一一种种按按极极性性由由小小到到大大的的顺顺序序选选用用不不同同极极性性的的溶溶剂剂组组成成溶溶剂剂系系统统，依依次次分分离离提提取取液液中中的的各各种种不不同同成成分分，使使各各溶溶解解度度有差异的成分得到分离的方法。有差异的成分得到分离的方法。操操作作技技术术：提提取取液液适适当当浓浓缩缩，或或拌拌入入适适量量随随性性吸吸附附剂剂如如粗粗硅硅胶胶、纤纤维维素素粉粉、硅硅藻藻土土等等，低低温温或或自自然然干干燥燥后后，依依次次选选用用3 37 7种种不不同同极极性性的的溶溶剂剂（石石油油醚醚或或苯苯、乙乙醚醚、三三氯氯甲甲烷烷、乙乙酸酸乙乙酯酯、丙丙酮酮、乙乙醇醇、水水），由由低低极极性性至至高高极极性性分分步步对对总总提提取取物物进进行行提提取取分分离离。因因总总提提取取物物中中各各类类成成分分的的极极性性不不同同，可可被被相相应应极极性性的的溶溶剂剂所所分分离离。也也可可以以选选择择其其中中的的三三、四四种种不不同同极极性性的的溶溶剂剂组组成成溶溶剂剂系系统统，按按极极性性由由低低到到高高分分步步进进行行抽抽提提，分分成成若干部位。若干部位。适用范围：适用范围：适用于有效成分尚未明确的天然药物提取液适用于有效成分尚未明确的天然药物提取液的分离。的分离。特点：特点：操作繁琐，相同成分会分散在不同的抽提部位，操作繁琐，相同成分会分散在不同的抽提部位，不易收集。微量成分、结构相似成分的纯化分离受限制。不易收集。微量成分、结构相似成分的纯化分离受限制。提示：提示：在研究不明成分中最为常用。在研究不明成分中最为常用。天然药物成分天然药物成分极性极性 天然药物成分天然药物成分类型类型 适用的适用的提取溶剂提取溶剂 强亲脂性强亲脂性 挥发油挥发油,脂肪油脂肪油,蜡蜡,甾醇类甾醇类,石油醚石油醚,已烷已烷 脂溶性色素脂溶性色素,某些苷元某些苷元 亲脂性亲脂性 苷元苷元,生物碱生物碱,树脂树脂,醛醛,酮酮,乙醚乙醚,氯仿氯仿 醇醇,酯酯,有机酸有机酸,某些苷类某些苷类 中等极性中等极性 某些苷类（如强心苷等）某些苷类（如强心苷等）氯仿氯仿:乙醇乙醇(2:1)某些苷类（如黄酮苷等）某些苷类（如黄酮苷等）乙酸乙酯乙酸乙酯 某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）正丁醇正丁醇 亲水性亲水性 极性很大的苷极性很大的苷,糖类糖类,丙酮丙酮,乙醇乙醇,甲醇甲醇 氨基酸氨基酸,某些生物碱盐某些生物碱盐 强亲水性强亲水性 蛋白质蛋白质,黏液质黏液质,果胶果胶,糖类糖类,水水 氨基酸氨基酸,无机盐类无机盐类第二节 分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术二、两相溶剂萃取法三、沉淀法四、结晶与重结晶法五、透析法六、分馏法七、色谱法二、两相溶剂萃取法二、两相溶剂萃取法*(液液-液萃取法、萃取法）液萃取法、萃取法）1 1 概概念念：是是指指在在提提取取液液中中加加入入一一种种与与其其不不相相混混溶溶的的溶溶剂剂配配成成两两相相溶溶剂剂系系统统，利利用用混混合合物物中中各各种种成成分分在在两两相相溶溶剂剂中中分分配配系系数数不不同同而而将将所所需需成成分分萃萃取取出出来来的的分离方法。分离方法。2 2 基基本本原原理理：利利用用混混合合物物中中各各成成分分在在两两相相溶溶剂剂中中的的分配系数（分配系数（K）不同而达到分离的方法。）不同而达到分离的方法。分配系数分配系数*：是指在一定温度和压力下，某物质溶解是指在一定温度和压力下，某物质溶解在两种不相混溶的溶剂中，当达到动态平衡时，根据分在两种不相混溶的溶剂中，当达到动态平衡时，根据分配定律，该物质在两相溶剂中浓度的比值为一常数，称配定律，该物质在两相溶剂中浓度的比值为一常数，称为分配系数（为分配系数（K），即：），即：K=Cu/CL 上层上层下层下层分离难易可用分离因子分离难易可用分离因子表示。表示。分离因子：分离因子：是两种溶质在同一溶剂系统是两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。即：中分配系数的比值。即：=KA/KB 一般地，一般地，100，只需一次即可分离；，只需一次即可分离；10010，需需经经1012次次才才能能达达到到分分离；离；1，即即KA KB，两两种种成成分分性性质质相相似似，无法分离无法分离两相溶剂两相溶剂萃取法的萃取法的“两相两相”一般是指互相饱和的水相与亲脂性一般是指互相饱和的水相与亲脂性有机溶剂相，混合物中各成分在两相溶剂中分配系数差别越大，有机溶剂相，混合物中各成分在两相溶剂中分配系数差别越大，则越容易分离，分离效果越高。则越容易分离，分离效果越高。3 3 萃取溶剂的选择萃取溶剂的选择萃取溶剂的选择应遵循下列萃取溶剂的选择应遵循下列原则原则：(1)(1)萃取溶剂应与原溶剂不相混溶或仅能部分混溶，振萃取溶剂应与原溶剂不相混溶或仅能部分混溶，振摇、静置后，应能较好地分层。摇、静置后，应能较好地分层。(2)(2)有效成分有效成分(或杂质或杂质)在萃取溶剂中应有较大的溶解度，在萃取溶剂中应有较大的溶解度，而杂质（或有效成分）在萃取溶剂中的溶解度要小，而杂质（或有效成分）在萃取溶剂中的溶解度要小，即二者的分配系数应有一定的差别，差别越大越容易即二者的分配系数应有一定的差别，差别越大越容易分离。分离。注注：两两相相溶溶剂剂的的极极性性应应有有一一定定差差异异，极极性性差差别别太太小小或或太太大大，分分离离效效果果都都不不好好。酸酸、碱碱性性成成分分常常用用pHpH梯度萃取法分离。梯度萃取法分离。酸、碱、两性成分酸、碱、两性成分调节调节pHpH改变的分子存在状态改变的分子存在状态改变溶解度改变溶解度 根据物质的溶解度差异进行分离根据物质的溶解度差异进行分离 调节pH解离型解离型/离子态离子态游离型游离型/分子态分子态H H+BHBH+B BOHOH-H H+A A-HAHAOHOH-脂溶性脂溶性水溶性水溶性pH梯度萃取法梯度萃取法*：利用混合物中各成分酸：利用混合物中各成分酸(或碱或碱)性强弱不同，相应改变溶液性强弱不同，相应改变溶液pH值使成分相继成盐值使成分相继成盐或游离，改变其在溶剂系统中的分配系数而与其他或游离，改变其在溶剂系统中的分配系数而与其他成分达到分离的方法。成分达到分离的方法。如如：黄黄酮酮苷苷元元的的分分离离。利利用用黄黄酮酮类类化化合合物物酸酸性性强强弱弱不不同同，先先将将其其苷苷元元溶溶于于有有机机溶溶剂剂，然然后后依依次次用用pH值值由由低低到到高高的的碱液萃取，使黄酮类成分与碱成盐后被依次萃取而分离。碱液萃取，使黄酮类成分与碱成盐后被依次萃取而分离。又如：生物碱的分离。生物碱多具有碱性，可用酸水进又如：生物碱的分离。生物碱多具有碱性，可用酸水进行提取，然后用行提取，然后用pH由低到高的碱调节溶液由低到高的碱调节溶液pH值，使生值，使生物碱按碱性强弱不同依次游离，再用有机溶剂依次进行物碱按碱性强弱不同依次游离，再用有机溶剂依次进行萃取而达分离。萃取而达分离。药材药材+酸水溶液酸水溶液酸水提取液酸水提取液生物碱盐生物碱盐生物碱具有生物碱具有亲脂性亲脂性，不溶或难溶于水，可溶于有，不溶或难溶于水，可溶于有机溶剂。因结构中含有氮原子，具有机溶剂。因结构中含有氮原子，具有碱性碱性，提取提取时常用时常用酸水酸水为溶剂进行，酸水提取液碱化后，用为溶剂进行，酸水提取液碱化后，用有机溶剂进行萃取，从而与水溶性杂质达到分离。有机溶剂进行萃取，从而与水溶性杂质达到分离。用碱水调节溶液用碱水调节溶液pH值至碱性值至碱性(碱化碱化),使生物碱转为游离状态后再用氯仿使生物碱转为游离状态后再用氯仿等有机溶剂进行萃取。等有机溶剂进行萃取。水溶性杂质（留在水中）水溶性杂质（留在水中）（1）简单萃取法简单萃取法（2）逆流连续萃取法）逆流连续萃取法（3）逆流分溶法）逆流分溶法（CCD，countercurrent distribution）（4）液滴逆流分配法（色谱）液滴逆流分配法（色谱）（DCCC，droplet countercurrent chromarography）（5）纸色谱）纸色谱（PC，paper chromatography）（6）液液分配柱色谱）液液分配柱色谱（7）高速逆流色谱）高速逆流色谱 （HSCCC，high speed countercurrent chromarography）4 4 萃取技术萃取技术 50 A有机溶剂有机溶剂/水水B有机溶剂有机溶剂/酸、碱水酸、碱水 pH 物质存在状态物质存在状态溶解性溶解性KCpH梯度萃取梯度萃取 梯度调节梯度调节pH，每次改变一种成分的存在状态，依次分离，每次改变一种成分的存在状态，依次分离特特点：点：操作简便，设备简单，实验室常用。但操作简便，设备简单，实验室常用。但溶剂用量大溶剂用量大、易乳化。易乳化。适用范围：适用范围：适用于分配系数差异较大成分的分离。适用于分配系数差异较大成分的分离。（1 1）简单萃取法）简单萃取法*(分次萃取分次萃取)：是常用的一种萃取方是常用的一种萃取方法，小量萃取可使用分液漏斗进行。法，小量萃取可使用分液漏斗进行。上层上层下层下层 例：例：HA1、HA2、B，且，且HA1 HA2，如何分离，如何分离?pH 12 B A-3 BH+HA提示：提示：若分离水提取液中的成分，则若分离水提取液中的成分，则水提取液浓度不可过稀或水提取液浓度不可过稀或过浓。过浓。过稀，萃取溶剂用量过大；过浓，两相溶剂不易充过稀，萃取溶剂用量过大；过浓，两相溶剂不易充分接触，影响萃取效果。一般水提取液比重在分接触，影响萃取效果。一般水提取液比重在1.11.2之之间为宜；间为宜；萃取溶剂与提取液应保持一定比例，萃取溶剂与提取液应保持一定比例，第一次萃取一般为第一次萃取一般为提取液的提取液的1/3 1/2，以后用量为，以后用量为1/6 1/4；分配系数差别较大时，分配系数差别较大时，一般萃取一般萃取3 4次次即可。若亲水即可。若亲水性成分不易转入有机溶剂层时，需要增加萃取的次数或更性成分不易转入有机溶剂层时，需要增加萃取的次数或更换新的萃取溶剂；换新的萃取溶剂；防止乳化防止乳化。碱性水提取液，用氯仿萃取时，易发生乳化。碱性水提取液，用氯仿萃取时，易发生乳化现象，萃取时应尽量防止乳化，如：采用旋转混合方式，现象，萃取时应尽量防止乳化，如：采用旋转混合方式，避免强烈振摇，或改用氯仿和乙醚混合溶剂作萃取剂等。避免强烈振摇，或改用氯仿和乙醚混合溶剂作萃取剂等。若已经形成乳化层，采用破乳措施若已经形成乳化层，采用破乳措施*：较长时间放置；：较长时间放置；轻度乳化可用细金属丝或细玻棒在乳化层中搅动；加入轻度乳化可用细金属丝或细玻棒在乳化层中搅动；加入食盐以饱和水溶液，增加水的密度；滴入数滴戊醇食盐以饱和水溶液，增加水的密度；滴入数滴戊醇,改变改变其表面张力，使乳化层破坏；乳化严重时可分出乳化层，其表面张力，使乳化层破坏；乳化严重时可分出乳化层，用加热、冷冻、将乳化层抽滤或更换新溶剂进行萃取等用加热、冷冻、将乳化层抽滤或更换新溶剂进行萃取等方法处理；根据实际情况不同，还可以加入其他破坏乳方法处理；根据实际情况不同，还可以加入其他破坏乳化的物质，如乙醇、磺化蓖麻油等。化的物质，如乙醇、磺化蓖麻油等。中量萃取可使用下口瓶，工业生产上大量萃取可在密中量萃取可使用下口瓶，工业生产上大量萃取可在密闭的萃取罐内进行。闭的萃取罐内进行。(2)(2)逆流连续萃取法逆流连续萃取法逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。是利用逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。是利用两相溶剂密度不同，即两相溶剂密度不同，即相对密度小的作为分散相（流动相对密度小的作为分散相（流动相）相）逆流连续穿过逆流连续穿过相对密度大的固定相相对密度大的固定相，在相对运动中，在相对运动中,使提取液中的不同成分因分配系数差异分溶于两相溶使提取液中的不同成分因分配系数差异分溶于两相溶剂中而达到分离。剂中而达到分离。操作技术：操作技术：逆流连续萃取装置是用一根或数根萃逆流连续萃取装置是用一根或数根萃取管串联制成。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈取管串联制成。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。装置见填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。装置见图：图：例如：用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素例如：用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素将氯仿装于萃取管内，开启活塞，则水提取液在高位将氯仿装于萃取管内，开启活塞，则水提取液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大、萃取就比较完全。氯仿接触面增大、萃取就比较完全。如果用的是比水轻的溶剂如苯、乙酸乙酯等进行萃取，如果用的是比水轻的溶剂如苯、乙酸乙酯等进行萃取，则水提取需装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位则水提取需装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。容器内。萃取过程中可用薄层色谱、纸色谱及显色反应或沉淀萃取过程中可用薄层色谱、纸色谱及显色反应或沉淀反应随时检查萃取是否完全。反应随时检查萃取是否完全。适用范围：适用范围：各种密度的溶剂萃取。各种密度的溶剂萃取。特点：特点：操作简便，萃取较完全。操作简便，萃取较完全。提示：提示：可以可以避免乳化避免乳化现象产生。现象产生。(3)逆流分溶法（逆流分溶法（CCD)：是一种在加样量一定，容量也一是一种在加样量一定，容量也一定的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而使混合物中的各种定的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而使混合物中的各种成分分离的方法。也称逆流分配、逆流分布或反流分布法等。成分分离的方法。也称逆流分配、逆流分布或反流分布法等。适用范围：适用范围：中等极性、分离因子较小（中等极性、分离因子较小（5050）及不稳定）及不稳定的物质。的物质。工作原理：工作原理：多次、连续的液液萃取多次、连续的液液萃取特点：特点：避免手工操作，分离效率高，操作条件温和，试样避免手工操作，分离效率高，操作条件温和，试样回收容易。但溶剂用量大，机械操作导致破损、漏液、易回收容易。但溶剂用量大，机械操作导致破损、漏液、易乳化。乳化。提示：提示：混合物各成分的分配系数很接近时，一般方法不易混合物各成分的分配系数很接近时，一般方法不易分离时可用此法。但操作繁琐，消耗溶剂多，含量微小的分离时可用此法。但操作繁琐，消耗溶剂多，含量微小的成分易损失于大体积的溶液中，易乳化等，极性过大或过成分易损失于大体积的溶液中，易乳化等，极性过大或过小的成分，或分配系数受温度或浓度影响过大及易乳化的小的成分，或分配系数受温度或浓度影响过大及易乳化的溶剂系统均不宜采用此法。溶剂系统均不宜采用此法。(4)液滴逆流分配法液滴逆流分配法(DCCC)：是利用流动相形成液是利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。可有效防止乳化现象的产生。可有效防止乳化现象的产生。流动相液滴垂直上下，经过固定相液体流动相液滴垂直上下，经过固定相液体 操作技术：操作技术：装置：分为三个部分。微型泵、移动相溶液贮槽和试样装置：分为三个部分。微型泵、移动相溶液贮槽和试样液注入品组成输液部分；第二部分由液注入品组成输液部分；第二部分由300-500根内径约根内径约2mm、长度为、长度为20-40cm的萃取管连接而成；第三部分的萃取管连接而成；第三部分由检出器和分步自动收集仪组成。由检出器和分步自动收集仪组成。操作：先将选择好的两相溶剂中的固定相充入全部萃取操作：先将选择好的两相溶剂中的固定相充入全部萃取管内，然后从加样口注入已溶于（管内，然后从加样口注入已溶于（1:1）两相溶剂中的）两相溶剂中的待分离试样，再由微型泵注入移动相，移动相在萃取管待分离试样，再由微型泵注入移动相，移动相在萃取管中形成液滴，不断地与固定相有效地接触、摩擦形成新中形成液滴，不断地与固定相有效地接触、摩擦形成新的表面，促使演技在两相溶剂中实现充分的分配，获得的表面，促使演技在两相溶剂中实现充分的分配，获得很高的分离效果。不易乳化或产生泡沫，若用氮气驱动很高的分离效果。不易乳化或产生泡沫，若用氮气驱动流动相，可避免被分离成分的氧化。从萃取管中流出的流动相，可避免被分离成分的氧化。从萃取管中流出的移动相通过检出器进行分部收集，完成液滴逆流分配的移动相通过检出器进行分部收集，完成液滴逆流分配的全过程。全过程。适用范围：适用范围：皂苷类化学成分的分离。皂苷类化学成分的分离。特点：特点：使用溶剂较少，可定量回收试样，分离效使用溶剂较少，可定量回收试样，分离效果比果比CCD法好。法好。提示：提示：广泛用于分离纯化多种天然药物化学成分，广泛用于分离纯化多种天然药物化学成分，如：皂苷、生物碱、蛋白质、多肽、酸性成分及如：皂苷、生物碱、蛋白质、多肽、酸性成分及糖类等。分离效果好！糖类等。分离效果好！复习思考题1.1.两相溶剂萃取法的原理是什么？什么是分两相溶剂萃取法的原理是什么？什么是分配系数？配系数？2.2.分次萃取如产生乳化，应如何分次萃取如产生乳化，应如何“破乳破乳”？The End