八味固本化湿降脂方标准汤剂的工艺研究.pdf

63江西中医药 2023 年 12 月第 12 期总第 54 卷第 492 期中药研究八味固本化湿降脂方标准汤剂的工艺研究易玉柳1 陈浩1,2 刘翔2 周丽1 易菲1 李蕊1 刘玉红1 温金华3（1.江西中医药大学 南昌330004；2.江西中医药大学附属医院 南昌 330006；3.南昌大学第一附属医院 南昌330006）摘要目的：规范八味固本化湿降脂方的煎煮工艺过程。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）对八味固本化湿降脂方中荷叶碱、银椴苷、橙黄决明素、槲皮素、党参炔苷 5 个化学成分进行测定。设计煎煮时间、浸泡时间，加水倍数 3 个因素的正交试验，计算各因素对 5 个化学成分含量的影响。结果：八味固本化湿降脂方最佳煎煮条件为荷叶浸泡时加 12 倍水，而其余药材根据正交试验结果，统一为 7 倍水，浸泡时间为 60min，煎煮时间为 30min。结论：通过 HPLC 实验以及正交实验确定最佳煎煮条件，为下一步药理药效学研究提供基础。关键词八味固本化湿降脂方；工艺研究；正交试验；HPLC中图分类号：R284 文献标志码：A八味固本化湿降脂方由党参、炒白术、盐泽泻、绿萝花各 12g，金钱草、炒决明子、荷叶各 15g，红曲 9g 组成，为临床经验方，拟制成中药制剂。方中党参有补中益气、补脾益肺等功效，加上炒白术有健脾利水、益气燥湿的作用1。金匮要略方义有记载泽泻与白术两药并用，既重祛湿，又重健脾，盐泽泻有利水渗湿、化浊降脂的功效，可助白术健脾加渗湿缓泻2-4，金钱草利湿消肿，与白术共为臣药。药效学研究结果显示，决明子、红曲均能降低动物血清血脂水平，荷叶、绿萝花能升清化湿5-6。全方从整体上对脾虚湿阻型单纯性肥胖患者情志、气机、中焦进行调理，诸药同用有化湿降脂之功效。现对八味固本化湿降脂方君药中的党参炔苷，臣药中的槲皮素以及在降脂减肥中起到主要作用的荷叶碱、银椴苷、橙黄决明素进行含量测定，并采用正交试验确定最佳煎煮条件，为制剂的质量控制、药效学实验以及临床用药安全性提供参考。1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色谱仪美国 Waters 公司（型号：Waters2695）；电子分析天平、十万分之一天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司（型号：AE240）；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司（型号：RKQ-500E）；旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂（型号：E-52A/52AA）。1.2 试药1.2.1药物药材饮片均由江西古汉精制中药饮片有限公司提供。党参产自甘肃，其来源于桔梗科植物党参 Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根；炒白术产自安徽，其来源于菊科植物白术 Atractylodes macrocephalaKoidz.干燥根茎的加工品；金钱草产自四川，其来源于报春花科植物过路黄 Lysimachia christinaeHance.的干燥全草；荷叶产自湖南，其来源于睡莲科植物莲 Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥叶；红曲产自福建，其来源于曲酶科真菌紫色红曲霉 Monascus purpureus Went.的菌丝体及孢子经人工培养，使菌丝在粳米部生长，使整个米粒变成红色而形成的红曲米；盐泽泻产自四川，其来源于泽泻科植物泽泻 Alismaplanta goaquaticaLinn.的干燥块茎的加工品；炒决明子产自河北，其来源于豆科植物钝叶决明Cassia obtusifoliaL.的干燥成熟种子的加工品；绿萝花产自西藏，其来源于瑞香科结香属植物滇结香Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn.的干燥花蕾。上述药材经江西中医药大学药学院付小梅教授鉴定均为正品，符合相关标准。见表 1。表1 八味固本化湿降脂方各药信息药材批号产地党参2205007甘肃炒白术220401安徽金钱草210601四川荷叶2207001湖南红曲2207002福建盐泽泻220401四川炒决明子220901河北绿萝花20210711西藏基金项目：江西省卫生健康委员会科技计划项目（202211433）；江西省中医药管理局中医药科研项目（2021B597）；江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ2200959）；江西省卫生健康委员会科技计划项目（202310686）；江西省科技厅杰出青年人才计划项目（20192BCBL23018）。通信作者：温金华，博士，主任药师。E-mail:。64JIANGXI JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE中药研究1.2.2对照品银椴苷（批号：IY302951，纯度98%）、橙黄决明素（批号：KY240621，纯度98%）、党参炔苷（批号：DL120031，纯度98%）、荷叶碱（批号：AL40311，纯度98%）、槲皮素（批号：QL103929，纯度98%），均购自合肥博美生物有限公司。1.2.3 试剂 甲醇（批号：40Y2209FP，美国默克）、乙腈（批号：12Y2208FH，美国默克）、磷酸（批号：H2212477，上海阿拉丁）、纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。2 方法与结果2.1 汤剂制备参考医疗机构中药煎药室管理规范以及中药饮片标准汤剂研究策略中煎煮汤剂的制备方法7-8，取八味固本化湿降脂方一个处方量 102g，由党参、炒白术、盐泽泻、绿萝花各 12g，金钱草、炒决明子、荷叶各 15g，红曲 9g 组成。前期的临床研究发现荷叶需要久煎效果更佳，在此基础上荷叶选择先煎煮 30min。炒制过的决明子以及由红曲霉与粳米发酵而成的中药红曲，在多次实验中发现煎煮15min 为最佳煎煮条件。煎煮浓缩至药液约 100mL，倒出药液趁热滤过，纯净水定容至 100mL。2.2 色谱条件色谱柱为 WAT054275SymmetryC18（4.6mm250mm），5m；流动相为乙腈（B）-0.1%磷酸（A）；梯度洗脱设置为 020min，5%10%乙腈；2030min，10%15%乙腈；3050min，15%18%乙腈；5065min，18%20%乙腈；6576min，20%22%乙腈；7680min，22%30%乙腈；8095min，30%50%乙腈；95105min，50%70%乙 腈；105115min，70%80%乙 腈。进样量为 10L；流速为 1.0mL/min；检测波长设定为 300nm。在上述条件下，目标峰可以完全分离，混合对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图 1。注：A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；1.荷叶碱；2.党参炔苷；3.槲皮素；4.银椴苷；5.橙黄决明素。图1 混合对照品及供试品溶液色谱图2.3 溶液的制备2.3.1 供试品制备 取“2.1”项下得到的汤剂 5mL，离心 10min（4500r/min），1.5mL 一次性针管吸取离心管中的上清液，过微孔滤膜，供试品溶液备用。2.3.2混合对照品制备精密称定对照品荷叶碱0.00082g、党参炔苷 0.00210g、槲皮素 0.00077g、银椴苷 0.00496g、橙黄决明素 0.00143g，10mL甲醇溶解，配制浓度为 82、210、77、496、143g/mL的混合对照品溶液制备。2.4 方法学考察2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”中对照品溶液，稀释至 1、2、4、8、16、32 倍，即可以得到一系列的混合对照品溶液，其中荷叶碱质量浓度梯度 为 82、41、20.5、10.25、5.125、2.5625g/mL，党参炔苷质量浓度梯度为 210、105、52.5、26.25、13.125、6.5625g/mL，槲皮素质量浓度梯度为：78、39、19.5、9.75、4.875、2.4375g/mL，银椴苷质量浓度梯度为 496、248、124、62、31、15.5g/mL，橙黄决明素质量浓度梯度为：144、72、36、18、9、4.5g/mL。分别按照“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，记录色谱峰峰面积。以 5 个对照品的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果表明 5 个对照品在各自范围内线性关系良好。见表 2。表2 各成分线性回归方程成分线性方程线性范围/（g mL-1）R2荷叶碱Y=24405.206X+58657.9252.5625820.9985党参炔苷Y=7754.758X+34601.9056.56252100.9995槲皮素Y=36959.656X-10200.0352.4375780.9999银椴苷Y=23419.34X+3409.14415.54960.9982橙黄决明素Y=24116.797X+95527.9954.51440.99872.4.2仪器精密度试验精密吸取“2.3.2”中对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，重复测定6次，记录色谱峰峰面积，计算 RSD 值。测得荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、橙黄决明素、银椴苷谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.08%，0.80%，1.05%，0.58%，1.10%，结果表明仪器精密度良好。2.4.3方法重复性试验按照“2.3.1”项下供试品制备方法平行制备 6 份，采用“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱峰峰面积。测得荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素色谱峰相对峰面积 RSD 分别为 1.00%，1.29%，1.35%，1.22%，1.01%，结果显示方法重复性良好。65江西中医药 2023 年 12 月第 12 期总第 54 卷第 492 期中药研究2.4.4溶液稳定性试验按照“2.3.1”项下制备供试品溶液，采用“2.2”项下色谱条件，将制得的供试品溶液室温下放置 0、2、4、8、12、24h后进样，记录色谱峰峰面积。测得荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素面积的 RSD 分别为 1.04%，1.93%，1.94%，1.82%，1.76%，结 果显示八味固本化湿降脂方放置室温 24h 内稳定性良好。2.4.5回收率试验取已知指标成分含量汤剂供试品样品 2.5mL，精密量取 6 份，分别置 10mL容量瓶中，容量瓶 16 号瓶中依次加入制备好的相同浓度的混合对照 2.5mL，混合均匀后，过微孔滤膜，即得到回收率实验的供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图并分析，分别计算荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素平均加样回收率分别为 99.76%，99.76%，99.44%，101.95%，100.97%；RSD 分 别 为 2.41%，2.98%，3.21%，2.81%，2.78%，结果表明该方法具有良好的回收率。2.5 工艺研究2.5.1 实验设计 为确定八味固本化湿降脂方最佳煎煮方法，在查阅中药煎煮相关文献的基础上，对其煎煮条件进行 3 水平 3 因素的考察。除去荷叶考察，其余 7 个药材的加水倍数，分别以 6、7、8 倍水；各个药材浸泡时间为 30、40、60min；除去先下后下的药材，考察剩余 5 个药材的煎煮时间，分别为20、30、40min。见表 3。表3 因素水平表水平加水量 A/倍浸泡时间 B/min煎煮时间 C/min1630202740303860402.5.2 正交实验结果 根据正交试验结果分析，得到本方最佳煎煮条件为 A2B3C2，即八味固本化湿降脂方饮片加水量为 7 倍，浸泡时间为 60min，煎煮时间为 30min。最终确定本品的制备工艺为：取荷叶 12 倍纯净水浸泡 60min，煮沸后文火先单独煎煮 30min，再取党参、炒白术、金钱草、盐泽泻、绿萝花 7 倍纯净水浸泡 60min，煎煮时间为 30min，后取红曲、炒决明子 7 倍纯净水浸泡 60min，煎煮15min，趁热过滤后收集药液。二煎加 7 倍纯净水，再次煮沸后文火煎煮 30min，药液倒出趁热过滤，将 2 次煎煮液均过滤后收集在同一个容器中，采用抽滤机进行负压浓缩，用纯净水定容至 100mL。见表 4。表4 正交试验结果组别ABC荷叶碱/g/mL党参炔苷/g/mL槲皮素/g/mL银椴苷/g/mL橙黄决明素/g/mL综合评分/分111140.8337.0610.6261.514.4330.89212250.8953.6310.8180.526.0840.39313343.7744.819.9261.055.8133.07421258.3961.4613.17110.359.2350.52522350.1445.3011.0379.987.5538.80623157.8160.0814.57108.668.2549.88731337.7239.369.0661.015.3330.50832134.4641.8310.5661.485.1530.69933266.2564.0113.17110.048.4352.38K134.7837.3037.15K246.4036.6347.76K337.8645.1134.12根据实验结果，采用 SPSS21.0 统计软件进行分析，结果表明煎煮时间 P0.05，为显著性因素，而加水倍数与浸泡时间无显著性。见表 5。表5 方差分析结果因素偏差平方和自由度F 值P 值加水量217.35218.780.05浸泡时间133.35211.520.08煎煮时间307.70226.580.04误差11.5722.5.3 最佳工艺验证 为确定最佳工艺的可行性，称取八味固本化湿降脂方 3 份，按照上述工艺下提取供试品溶液 3 份，按照“2.2”项下色谱条件进行试验，记录色峰面积谱图，计算八味固本化湿降脂方中荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素的含量，3 组试验各指标的 RSD 均小于 3%，表明工艺合理可行。见表 6。表6 试验验证结果g/mL验证试验荷叶碱党参炔苷槲皮素银椴苷橙黄决明素165.3866.0412.92109.868.43266.2964.7513.09108.378.43364.7166.6512.62113.078.3866JIANGXI JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE中药研究3 讨论中药复方汤剂的煎煮方法对临床疗效有很大的影响9，因此对中药复方汤剂提取工艺的控制非常重要。但目前中药汤剂质量检测方法与标准制定还不够完善，固在药效学实验研究之前进行标准汤剂工艺研究是非常必要。本试验结果符合中药饮片标准汤剂研究策略10中提到的 28 倍的水为根茎类药材的加水量，而蓬松的叶类药材加水量更多，因此本试验研究选择了荷叶浸泡时加 12 倍水，而其余药材根据正交实验结果，统一为 7 倍水，浸泡时间为 60min，煎煮时间为 30min，即可提取药材的大部分有效成分。本试验通过以指标性成分含测及正交试验设计等评价方法为临床汤剂的质控提供了一定的实验依据，该方法对于临床煎煮汤剂起到质控作用。对八味固本化湿降脂方含量进行了测定，在190400nm 范围内对待测标准品溶液进行了全波长扫描，综合考虑各方面因素，最终确定 300nm为此次实验的检测波长。在流动相方面，考察了甲醇-水、乙腈-0.5%磷酸水 2 种流动性梯度的洗脱结果，在乙腈-0.5%磷酸水基础上又调整成了乙腈-0.1%磷酸水，结果显示乙腈-0.1%磷酸水的分离效果最好，因此本次实验选择乙腈-0.1%磷酸水为检测的流动相系统。中药饮片标准汤剂作为临床制剂的标准参照物，是为了保障用药准确性和一致性的重要部分13，也是为开发中药制剂做的前期准备。本实验规范了八味固本化湿降脂方的煎煮工艺过程，确保了用药的准确性和疗效的一致性，为进一步开发成中药制剂打下坚实基础。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典 S.北京:中国医药科技出版社,2020.2刘翔,周丽,盛建洋,等.八味固本化湿降脂方配合热敏灸治疗单纯性肥胖的疗效观察 J.江西中医药,2022,53(2):54-56.3朱广伟,张贵君,汪萌.不同配伍比例的泽泻汤降血脂作用研究 J.中华中医药学刊,2015,33(1):189-191.4谭峰,陈学习,阮时宝.金匮要略泽泻汤研究概况 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