不同酶处理的啤酒酵母蛋白酶解液功能肽组学分析.pdf
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1、 年 月 研究论文:收稿日期:通讯联系人:(张鸿伟);:(赵雪)基金项目:国家自然科学基金();山东省泰山学者计划():();“”()不同酶处理的啤酒酵母蛋白酶解液功能肽组学分析燕禹彤,高春雨,张晓梅,安子哲,马蕴真,韩林林,张鸿伟,赵 雪(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛;青岛海关技术中心,山东 青岛;山东大学国家糖工程技术研究中心,山东 青岛;青岛农业大学巴瑟斯未来农业科技学院,山东 青岛)摘要:采用超高效液相色谱高分辨质谱()联用技术,结合 肽组学分析软件和、数据库,分析比较了啤酒酵母的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的肽指纹谱图和活性肽差异,旨在探究不同酶处理的啤酒酵母蛋白酶解液
2、的肽组学差异。采用 测序,相较于传统数据库,更全面地分析得到五肽及其以下寡肽,使样品中的肽段数据更加完整。实验在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解工艺下制备得到啤酒酵母蛋白酶解液,然后进行 分离鉴定及数据检索和分析。研究结果表明,中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解产物中分别鉴定出 和 条多肽,其中共有肽为 条,而特有肽分别为 条和 条,说明两种不同蛋白酶降解产物的肽指纹谱图有很大的差异。使用 预测出中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解产物中有 和 条肽为潜在活性肽,其占比分别为 和。搜索 数据库发现,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解产物中有 条和 条活性肽,其中主要是血管紧张素转化酶()抑制肽、二肽基肽酶抑制肽和
3、抗氧化肽。比较发现,木瓜蛋白酶产物中活性肽数量高于中性蛋白酶产物,但是活性肽的相对含量低于中性蛋白酶产物,本研究更好地揭示了不同蛋白酶对啤酒酵母蛋白肽产品组成的影响。上述结果为啤酒酵母蛋白肽的功能产品开发和啤酒酵母资源的高值化利用提供了参考。关键词:超高效液相色谱高分辨质谱;肽指纹谱图;活性肽;啤酒酵母中图分类号:文献标识码:,(,;,;,;,):,(),色谱第 卷 ,;,()(),;(),引用本文:燕禹彤,高春雨,张晓梅,安子哲,马蕴真,韩林林,张鸿伟,赵雪 不同酶处理的啤酒酵母蛋白酶解液功能肽组学分析 色谱,():,():();啤酒酵母()是一种由酿酒酵母()和真贝酵母()杂交获得的重要工
4、业生产菌株,年我国啤酒生产的副产品酵母粉的总产量约 万吨。啤酒酵母可用于生产蛋白质、超氧化物歧化酶(,)和酵母抽提物等活性物质,已广泛地应用于饲料、健康食品和调味料中。啤酒酵母蛋白质含量丰富,是一种便宜、丰富的蛋白质资源。目前研究报道表明,酵母蛋白酶解物中发现了抗氧化肽、血管紧张素转化酶()抑制肽、抗糖尿病肽、抗菌肽、免疫调节肽等,且广泛地应用于健康食品和化妆品中,。目前,生产酵母蛋白肽主要使用酶解法和发酵法降解酵母蛋白,酶解法主要采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等高效蛋白酶酶解制备啤酒酵母蛋白肽,酶解工艺以水解度、多肽的相对分子质量、多肽含量等指标来优化。比较发现,虽然复合酶解可以获得较
5、高的水解度和肽得率,但是深度酶解会导致很多活性肽被水解,不是制备活性肽的最佳方式。蛋白酶解产物中多肽种类和结构复杂,酶的种类和酶解条件对蛋白肽的肽指纹谱图和活性肽的影响还缺少系统的研究。对于啤酒酵母而言,已有研究对其特有蛋白质、独特功能以及不同条件下的蛋白质变化等进行了蛋白质组学分析,而对于肽序列及其活性方面的肽组学研究较少。因此酶解工艺与产物组成之间的关系仍然需要进一步系统的研究,对揭示蛋白肽产品的构效关系具有重要作用。肽组学是蛋白质组学的一个分支,是对生物样品中的肽进行全面定性和定量描述的技术。基于质谱平台的肽组学分析技术有着一定的分析优势:可以获得反映生物样品特质的足够的分子信息且可以进
6、行数据采集后回溯分析;质谱方法具有检测准确性高、在线分离能力强、灵敏度高以及多目标和高通量分析的优势;多肽的序列结构对于某些加工过程(如加热、剪切等)具有更好的分析稳定性。因此,基于质谱平台的肽组学分析技术已经广泛地 第 期燕禹彤,等:不同酶处理的啤酒酵母蛋白酶解液功能肽组学分析应用于蛋白质酶解产物中多肽指纹谱图、鲜味肽和活性肽的分析鉴定。但是质谱分析的难点在于需要计算和鉴定生物样品中几千或几万个长短肽的序列和含量,工作量非常巨大。多肽的鉴定最常见的方法是质谱法,其通过对多肽离子质荷比()的分析,测定其相对分子质量和分子结构,依赖现有可用的数据库匹配实验中的质谱数据,实现对多肽的定性分析。并且
7、通过研发一系列联用设备、开发多项新化学技术和优化仪器参数等方法,形成更稳定的“”或“”离子来更好地实现质谱数据的匹配。但该法的一个显著缺点是不能用于鉴定来自未知基因组的蛋白质。而基于人工智能算法的 云计算平台,解决了批量质谱数据集高通量解析的难题,。是一种基于 技术路线的蛋白质组学质谱数据分析软件,采用蛋白质从头测序 算法,不依赖于蛋白质数据库,计算所有可能的氨基酸组合中的最佳可能序列,用于在不使用数据库的情况下提取氨基酸序列信息,进行数据转化,对蛋白质进行鉴定及定量分析。研究发现,与目前国际上其他算法平台相比较,平台可以多解析出 的肽段序列,把对质谱数据依赖型采集(,)和数据非依赖型采集(,
8、)数据的解析和挖掘能力提升到了一个全新的高度。本研究采用超高效液相色谱高分辨质谱(,),结合 云计算平台和、在线数据库,分析比较了酵母蛋白的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的肽指纹谱图和活性肽的差异,揭示了不同蛋白酶对酵母蛋白肽产品组成的影响。实验部分 仪器、试剂与材料 色谱仪和 四极杆轨道阱高分辨质谱仪(美国 公司);微量层析柱()、超滤管()、超纯水制备系统(美国 公司);低温冷冻离心机(德国 公司);软件(版本,加拿大 公司);在线数据库(),用于预测多肽的生物活性;数据库(:),用于预测多肽的生物功能活性。中性蛋白酶(比活力 )、木瓜蛋白酶(比活力 )均购自北京索莱宝科技有限公司;质谱级甲
9、酸购自美国 公司;质谱级乙腈、质谱级甲醇均购自德国 公司。啤酒酵母粉由青岛啤酒有限公司提供。样品前处理 啤酒酵母粉以料液比 ()加入蒸馏水清洗酵母,离心 ,收集酵母沉淀,重复洗涤 次。酵母沉淀以料液比 ()加入蒸馏水混匀,制成酵母悬浮液。用高压均质机在 下破壁处理 ,破壁后的酵母悬浮液分别在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳条件下进行酶解(中性蛋白酶:添加量 ,温度,时间 ;木瓜蛋白酶:添加量 ,温度 ,时间 )。酶解液在 加热 灭酶活后,离心 ,收集上清液,用 超滤膜过滤,收集小于 的滤液为啤酒酵母蛋白酶解液。酵母蛋白酶解液用 微量层析柱脱盐,收集乙腈甲酸(,)洗脱液,真空干燥。用 ()乙腈水溶液
10、溶解成 ,用 超滤膜过滤后,进行 分析。条件 色谱条件色谱柱:(,);柱温:;流速:;进样量:;进样时间:;流动相:含 甲酸的乙腈(),甲酸水溶液();流动相梯度:,;,;,;,;,;,;,。质谱条件 电喷雾正离子()模式;喷雾电压为 ;在数据依赖型采集模式下,扫描范围:;其他参数设置如下:()一级质谱:分辨率 ;扫描阱容量为。()二级质谱:分辨率 ;扫描阱容量为;每个采集循环中监测的最强离子数目为;碰撞能量分别为、;鞘气(氮气)流速为 ;辅助气色谱第 卷体流速为;毛细管温度为;辅助气体加热温度为 ;信号强度阈值为 。多肽质谱数据的分析 使用 软件分析不同酶解产物中所有多肽的一级和二级质谱,根
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