白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用.pdf

植物研究 2023，43（5）：667 678Bulletin of Botanical Research白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用何旭 高源 张群野 周晨光 李伟 李爽*（东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室，哈尔滨 150040）摘 要 以白城小黑杨（Populus simoniiP.nigra Baicheng）组培苗茎段为外植体，MS为基本培养基，通过调节不同植物生长激素6-BA、NAA、TDZ和IBA浓度诱导其离体再生。基于组织培养系统，经过卡那霉素浓度筛选、侵染时间确定，最终建立适用于白城小黑杨的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化体系。利用该系统成功创制了杨树应拉木形成关键调控基因LBD39（Lateral Organ Boundaries Domain）的过量表达转基因植株。结果表明：白城小黑杨组织培养体系包括不定芽分化诱导、抽茎诱导、生根诱导3个阶段，不定芽分化诱导最适培养基为MS+0.5 mg L-1 6-BA+0.1 mg L-1 NAA+0.001 mg L-1 TDZ，分化率92.6%；抽茎诱导最适培养基为MS+0.2 mg L-1 6-BA+0.05 mg L-1 NAA，抽茎增值系数6.5；生根诱导最适培养基为1/2 MS+0.4 mg L-1 IBA，生根率100%。遗传转化最适卡那霉素质量浓度为30 mg L-1、最佳侵染时间为20 min，经30 d不定芽诱导、1530 d抽茎诱导、25 d生根诱导即可成功获得转基因植株，GUS基因的转化效率为2%。应用此遗传转化体系，对杨树应拉木关键调控基因LBD39进行了过表达植株创制，最终获得5株过表达植株，转化效率为3.3%。关键词 白城小黑杨；组织培养；遗传转化；LBD39中图分类号：S792.11 文献标志码：A doi：10.7525/j.issn.1673-5102.2023.05.004Establishment and Application of Genetic Transformation System for Populus simoniiP.nigra BaichengHE Xu GAO Yuan ZHANG Qunye ZHOU Chenguang LI Wei LI Shuang*（State Key Laboratory of Forest Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040）Abstract Stems of Populus simoniiP.nigra Baicheng in vitro plants were selected as explants and MS medium was used to establish tissue culture system by adjusting the hormone concentrations of 6-BA，NAA，TDZ and IBA.Based on the tissue culture system，the optimal concentration of kanamycin and infection time were confirmed to establish Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system for P.simoniiP.nigra Baicheng.By using this system，the transgenic plants overexpressed a key tension wood formation regulator LBD39（Lateral Organ Boundaries Domain）were created successfully.The results showed that the tissue culture system consisted of three stages，including adventitious bud differentiation induction（MS+0.5 mg L-1 6-BA+0.1 mg L-1 NAA+0.001 mg L-1 TDZ，shoot differentiation rate=92.6%），stem induction（MS+0.2 mg L-1 6-BA+0.05 mg L-1 NAA，multiplication coefficient=6.5）and rooting induction（1/2 MS+0.4 mg L-1 IBA，rooting percentage=100%）.The optimal kanamycin concentration for genetic transformation was 30 mg L-1 and the optimal infection time was 20 min，and the transgenic plants were obtained successfully after 30 d of 基金项目：国家自然科学基金项目（32001331）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572020DR01）；黑龙江省头雁行动（林木遗传育种创新研究团队）第一作者简介：何旭（1998），男，硕士研究生，主要从事林木遗传育种方面的研究*通信作者：E-mail：收稿日期：2023-01-21Foundation item：National Natural Science Foundation of China（32001331）；Fundamental Research Funds for the Central Universities of China（2572020DR01）；Heilongjiang Touyan Innovation Team Program（Tree Genetics and Breeding Innovation Team）First author introduction：HE Xu（1998），male，postgraduate，mainly engaged in forest genetics and breeding.*Corresponding author：E-mail：Received date：2023-01-2143 卷植物研究adventitious bud differentiation induction，15-30 d of stem induction and 25 d of rooting induction with 2%transformation efficiency respectively.By using this system，five overexpressed plants of LBD39 were obtained，and the transformation efficiency was 3.3%.Key words Populus simoniiP.nigra Baicheng；tissue culture；genetic transformation；LBD39杨树因其营养繁殖能力强，生长速度快，被广泛应用于制浆造纸工业，是我国重要的生态经济林栽培树种1。杨树品种众多，小黑杨（Populus simoniiP.nigra）具有较强的耐贫瘠、耐胁迫等优良特性2。经过长时间的种植选育，不同地区又形成了各具特色并更适应当地环境条件的不同类型小黑杨。其中，白城小黑杨（P.simoniiP.nigra Baicheng）生长迅速，材性优良，对病虫害等生物胁迫以及寒害、干旱、盐碱等非生物胁迫具有极强的耐受性，在吉林、黑龙江等地区被广泛种植 3。随着现代基因工程技术的不断发展，组织培养和遗传转化已成为解析基因功能、克服木本植物育种困难、改良林木优良遗传性状的主要技术手段4-5。根据已有的以小黑杨叶片为材料的组织培养体系可将整个过程分为不定芽分化培养、丛生苗抽茎诱导、生根诱导3个阶段6。不定芽分化培养通常选择植物激素 6-BA（0.251.00 mg L-1）和NAA（0.020.10 mg L-1），丛生苗抽茎诱导通常选择6-BA（0.10.5 mg L-1）和NAA（0.020.10 mg L-1），生根诱导通常选择 IBA（0.10.4 mg L-1）和 NAA（0.100.25 mg L-1）。这些已有的针对植物激素种类及浓度2方面的经验是建立更高效的组织培养体系非常有用的参考依据。在遗传转化方面，小黑杨作为黑杨派的杂交杨树，遗传转化较为困难，转化效率一般为1%左右，且目前关于遗传转化报道主要是通过叶盘法进行7。然而，目前还鲜见针对白城小黑杨遗传转化体系的相关报道。本研究前期参考小黑杨已建立的组织培养体系对小黑杨、白城小黑杨和以长春小黑杨（P.simoniiP.nigra Changchun）为母本、新疆阿勒泰欧洲黑杨（P.nigra）为父本杂交而形成的白林三号小黑 杨（P.simoniiP.nigra Bailin-3）进 行 了 培养6，8。结果发现，小黑杨可以正常实现芽的分化和生根，且分化、生根效率较高；而白城小黑杨和白林三号小黑杨不能实现离体再生，并且这2种小黑杨在相同培养条件下的分化、抽茎、生根情况均不相同。由此推测，不同类型小黑杨需要不同组织培养条件实现其离体再生。此外，小黑杨遗传转化效率较低是一直以来难以克服的障碍，目前为止还没有适用于白城小黑杨的组织培养和遗传转化体系。这些技术限制严重制约着小黑杨高抗、优质林木新品种的创制7，9。因此，开发高效的、树种类型针对性强的组织培养及遗传转化体系，挖掘优良性状关键候选基因，是通过基因工程手段培育优质林木种质的关键途径。本研究将以白城小黑杨组培苗茎段为外植体，从激素种类及浓度方面进行不定芽分化、丛生苗抽茎、生根诱导的培养条件摸索，建立适用于白城小黑杨的组织培养体系。并在此基础上，建立适用于该树种的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化体系。已有的研究表明，毛果杨（P.trichocarpa）PtrLBD39转录因子是响应应拉木形成的关键因子10。本研究将利用建立的遗传转化体系创制该转录因子过量表达的白城小黑杨植株，验证遗传转化体系的可应用性的同时也为基因功能及作用机制的解析提供重要的遗传材料。1 材料与方法1.1试验材料试验材料试验材料为白城小黑杨组培苗，为东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室赵曦阳教授惠赠。组培条件为：温度2325，光强约40 mol m-2 s-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗。1.2白城小黑杨组织培养各阶段培养基筛选白城小黑杨组织培养各阶段培养基筛选1.2.1分化培养基筛选分化培养基筛选以白城小黑杨组培苗的第23节茎段作为外植体，剪取长度0.51.0 cm，以MS作为基本培养基（MS+30 g L-1蔗糖+7 g L-1琼脂，pH=5.8），挑选不同植物生长调节剂（PGRs）：6-BA、NAA和 TDZ诱导白城小黑杨不定芽的增殖分化，生长素NAA质量浓度保持不变（0.1 mg L-1），设置不同质量浓度细胞分裂素 6-BA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg L-1）并在 0.5 mg L-1 6-BA 基础上添加 0.001 mg L-1 TDZ共6个试验处理，每个处理3个培养皿，每个培养皿接种9个茎段外植体，每个处理重复3次，接种30 d后统计外植体不定芽的分化率。668何旭等：白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用5 期分化率=诱导出明显不定芽的外植体数量接种时全部外植体数量100%（1）1.2.2抽茎培养基筛选抽茎培养基筛选将诱导出的长约1.0 cm不定芽接种到含细胞分裂素6-BA（0.1、0.2 mg L-1）和生长素NAA（0.10、0.05 mg L-1）共 4 个处理的 MS 基本培养基（MS+25 g L-1蔗糖+7.15 g L-1琼脂，pH=5.8）中进行茎的诱导。每个处理接种10瓶，每瓶接种3个不定芽，每个处理重复3次，接种30 d后统计不定芽抽茎的增值系数。抽茎增值系数=不定芽抽茎的条数接种时全部外植体数量（2）1.2.3生根培养基的筛选生根培养基的筛选剪取1.5 cm抽茎丛生苗的顶芽接种到含有不同浓度生长素 IBA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg L-1）及NAA（0、0.02 mg L-1）的 1/2 MS 培养基（1/2 MS+20 g L-1蔗糖+5.5 g L-1琼脂，pH=5.8）中诱导生根，共8个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接种2株，每个处理重复 3 次，接种 25 d 后统计丛生苗的生根率。生根率=生根苗植株数量接种时全部幼苗植株数量 100%（3）1.3白城小黑杨遗传转化体系建立白城小黑杨遗传转化体系建立1.3.1卡那霉素浓度筛选卡那霉素浓度筛选为了确定农杆菌介导的遗传转化过程中卡那霉素的适宜浓度，在含有不同浓度梯度（0、10、20、30、40 mg L-1）卡那霉素的最佳分化培养基中对白城小黑杨组培苗的茎段外植体进行卡那霉素敏感性的测定，共6个处理，每个处理接种3个培养皿，每个培养皿接种6个外植体，每个处理重复3次。接种4周后观察每个处理中不定芽的情况。1.3.2侵染时间筛选侵染时间筛选将农杆菌菌液侵染过程时间设置为 10、20、30 min 3个处理，每个处理侵染50个茎段外植体，每个处理重复 3次，统计选择培养产生抗性芽的数量。1.3.3农杆菌介导的白城小黑杨遗传转化体系农杆菌介导的白城小黑杨遗传转化体系优化优化参考农杆菌介导的毛果杨遗传转化方案11，对白城小黑杨遗传转化体系进行摸索。选择生长25 d左右健壮的白城小黑杨组培苗的第23节茎段作为外植体进行后续遗传转化。利用EHA105农杆菌感受态细胞、含有-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）报告基因的 pBI121 植物表达载体质粒（pBI121-35S：GUS）、pBI121-35S：PtrLBD39载体进行后续遗传转化体系建立。农杆菌菌液制备：12：00对含有转化载体的农杆菌菌液进行划线培养；2 d后17：00挑取农杆菌菌落单克隆接种于含有20 mg L-1利福平和20 mg L-1卡那霉素的 20 mL YEP 液体培养基（5 g L-1氯化钠、16 g L-1胰蛋白胨和 10 g L-1酵母提取物），28、180 r min-1条件下培养约13 h至OD6000.901.10；将农杆菌菌液吸取1.5 mL转移至含有20 mg L-1利福平和20 mg L-1卡那霉素的50 mL YEP液体培养基再次培养至OD6000.60；4、2 200 r min-1离心 10 min 进行菌体收集；将农杆菌菌体用 30 mL悬浮液（1/2 MS+20 g L-1蔗糖+80 mol L-1 AS，pH=5.2）悬浮稀释OD6000.400.45。侵染、共培养、脱菌及选择培养：将切好的1 cm左右外植体茎段放进农杆菌悬浮液进行侵染，随后将其接种于共培养培养基中（含有80 mol L-1 AS的最佳分化培养基，pH=5.2）在黑暗条件下共培养 48 h；共培养结束后用含有 250 mg L-1的头孢霉素的 100 mL 无菌水清洗茎段外植体 5 min，再用100 mL无菌水清洗2次，每次3 min，最后将用滤纸干燥后的茎段外植体接种于选择培养基中（含有 30 mg L-1卡那霉素和 250 mg L-1头孢霉素的最佳分化培养基，pH=5.8）进行抗性芽的筛选。抽茎及生根筛选：选择培养基培养大约30 d后，将长有抗性芽的茎段外植体接种到抗性抽茎培养基中（含有 20 mg L-1卡那霉素和 125 mg L-1头孢霉素的最佳抽茎培养基，pH=5.8）诱导抽茎；在抗性抽茎培养基筛选1530 d后，将抽出明显茎干的抗性芽接种到抗性生根培养基中（含有10 mg L-1卡那霉素和100 mg L-1头孢霉素的最佳生根培养基，pH=5.8）；大约10 d后能够看到植株生根的情况，待生根半个月后进行转基因植株的鉴定。1.3.4转基因植株的鉴定转基因植株的鉴定GUS染色：分别对转化的pBI121-35S：GUS抗性生根植株以及白城小黑杨WT野生型用GUS染液进行染色及观察，并计算转化效率。转化效率=获得完整转基因植株数量遗传转化全部外植体数量100%（4）66943 卷植物研究DNA水平鉴定：剪取遗传转化的pBI121-35S：GUS 及 pBI121-35S：PtrLBD39 白城小黑杨抗性生根苗的第3片叶子提取基因组DNA，进行PCR扩增鉴定（表1）。1.4数据处理数据处理数据分析采用SPSS 17.0中的Duncan多重检验对白城小黑杨不定芽再生率、抽茎增殖系数、生根率、阳性芽产生率进行差异显著性分析，P0.05在统计学上具有显著差异。2 结果与分析2.1白城小黑杨离体再生体系优化白城小黑杨离体再生体系优化2.1.1白城小黑杨不定芽的诱导白城小黑杨不定芽的诱导以白城小黑杨茎段为外植体，MS作为基本培养基（MS+30 g L-1蔗糖+7 g L-1琼脂，pH=5.8），选择3种植物生长调节剂（6-BA、TDZ、NAA）分析不同生长调节剂下白城小黑杨茎段分化培养30 d后不定芽的再生情况（表 2）。结果表明，当生长素NAA质量浓度不变时，持续增加细胞分裂素6-BA的质量浓度，白城小黑杨不定芽的分化程度随着6-BA质量浓度的增加而提高（见图1AE）。TDZ已被证明在较低的质量浓度下能够促进不定芽再生，并且芽再生的效率比其他细胞分裂素更高，但过量使用TDZ则会对植物产生毒害作用12。当保持 0.5 mg L-1 6-BA和 0.1 mg L-1 NAA 质量浓度不变时，添加0.001 mg L-1的TDZ，与处理5相比，加入TDZ后不定芽的分化率从86.4%增加到92.6%，并且处理6的不定芽更茂密（见图1F），因此白城小黑杨不定芽诱导的最佳分化培养基为：MS+0.5 mg L-1 6-BA+0.1 mg L-1 NAA+0.001 mg L-1 TDZ。2.1.2白城小黑杨丛生苗抽茎的诱导白城小黑杨丛生苗抽茎的诱导外植体经过分化诱导获得的不定芽多数没有明显的茎，需要诱导出明显的茎方可进行后续培养。有研究表明，TDZ对于植物不定芽茎的伸长生长有一定的抑制作用13。因此，在白城小黑杨丛生芽抽茎诱导阶段本研究仅考虑了 6-BA 和NAA。将生长健壮的不定芽接种至含有不同浓度外源激素的抽茎诱导培养基中，培养30 d后统计其增殖系数。结果表明：细胞分裂素6-BA质量浓度保持不变时，配合较低质量浓度的生长素NAA能够提高外植体的抽茎增殖系数；而当生长素NAA质量浓度保持不变时，适量提高细胞分裂素6-BA的质量浓度也可以提高丛生不定芽的抽茎增殖系数（表3）。处理3的平均抽茎系数可以达到6.5，显著高于其他处理，抽茎程度及长势均优于其他处理（见图2）。因此白城小黑杨抽茎培养基为：MS+0.2 mg L-1 6-BA+0.05 mg L-1 NAA。2.1.3白城小黑杨丛生苗的生根诱导白城小黑杨丛生苗的生根诱导将已经抽茎且生长健壮的丛生苗的顶芽接种到含有不同质量浓度生长素IBA和NAA的生根培养基中，生根培养25 d后统计各个处理的生根率。结果表明：不同外源激素处理下白城小黑杨幼苗均可以生根，生根率为72.5%100.0%。当生长素NAA质量浓度保持不变时，生根率随着IBA质量浓度的增加而增加；与同时使用IBA和NAA 2种激素处理相比，仅使用IBA处理的生根率均高于同时使用这 2 种生长素的生根率，处理 8 使用 0.4 mg L-1的IBA处理，生根率可以达到100%（见表4），并且该处理的根长和根的数量也要优于其表1引物序列Table 1Primer sequences引物名称Primer name35SP1-FNost2-RPtrLBD39-R序列（53）Sequences（53）CCCACTATCCTTCGCAAGACCGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCACTAGGTCGACGCATGACCACAAAGACTC用途Application转基因植株鉴定Identification of transgenic plantsPtrLBD39转基因鉴定Identification of PtrLBD39 transgenic plants表2植物生长调节剂对白城小黑杨茎段不定芽再生率的影响Table 2Effects of plant growth regulators（PGRs）on adventitious bud regeneration frequency from the stem of P.simoniiP.nigra Baicheng处理Treatment123456植物生长调节剂Plant growth regulators/（mgL1）6-BA0.10.20.30.40.50.5NAA0.10.10.10.10.10.1TDZ0.001不定芽分化率Adventitious bud differentiation rate/%63.02.14 e71.61.64 d79.02.67 c82.72.47 bc86.41.23 ab92.62.11 a注：数值代表3次重复的平均值标准误差。根据Duncan多重检验，一列中的不同字母表示显著差异（P0.05）；下同Note：Values represented meansstandard error of three replicates.Different letters within a column indicated significant differences according to the Duncan s multiple range test（P0.05）；The same as below670何旭等：白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用5 期图2不同激素处理下白城小黑杨丛生苗的抽茎诱导Fig.2Stem induction of clustered plantlets of P.simoniiP.nigra Baicheng under different hormone treatments图1不同激素处理下白城小黑杨茎段不定芽的再生Fig.1Adventitious bud regeneration from stem of P.simoniiP.nigra Baicheng under different hormone treatments67143 卷植物研究他处理（见图3）。因此白城小黑杨最佳生根培养基为：1/2 MS+0.4 mg L-1 IBA。综上所述，本研究以白城小黑杨组培苗茎段为外植体，成功建立了有效的组织培养体系。包括 不 定 芽 的 诱 导（30 d，MS+0.5 mg L-1 6-BA+0.1 mg L-1 NAA+0.001 mg L-1 TDZ）、不定芽抽茎诱导（1530 d，MS+0.2 mg L-1 6-BA+0.05 mg L-1 NAA）、生根诱导（25 d，1/2 MS+0.4 mg L-1 IBA）3个过程（见图4）。2.2白城小黑杨遗传转化体系建立白城小黑杨遗传转化体系建立2.2.1卡那霉素及侵染时间筛选卡那霉素及侵染时间筛选为了确定白城小黑杨用于遗传转化的卡那霉素最适质量浓度，将白城小黑杨茎段外植体接 种到含有不同质量浓度卡那霉素的最佳分化培 养基中培养 30 d。结果表明：白城小黑杨茎段 外植体对卡那霉素较为敏感，随着卡那霉素质量浓度的增加，茎段外植体的分化程度随之降低，当卡那霉素质量浓度为30 mg L-1时能够完全抑制其不定芽的生长，因此白城小黑杨茎段外植体用于遗传转化的卡那霉素临界质量浓度为30 mg L-1（见图5）。基于以上培养条件的优化，利用根癌农杆菌菌株选择琥珀碱型C58背景的EHA105农杆菌菌株通过遗传转化pBI121-35S：GUS对白城小黑杨遗传转化体系进行建立，该载体由35S组成型启动子介导过量表达-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）。由于农杆菌侵染时间是植物遗传转化过程中非常重要的因素之一，侵染时间太短会导致农杆菌无法将 T-DNA插入到植物的基因组中，侵染时间过长则会引起农杆菌的毒害作用影响植株分化效率。经过对比不同侵染时间对分化效率的影响发现，当农杆菌侵染时间为10、30 min时，GUS染色鉴定出的阳性芽产生率较低，分别为8.0%和6.7%，而当表4植物生长调节剂对白城小黑杨生根率的影响Table 4Effects of plant growth regulators（PGRs）on rooting rate of P.simoniiP.nigra Baicheng处理Treatment12345678植物生长调节剂Plant growth regulators/（mgL1）IBA0.10.10.20.20.30.30.40.4NAA0.020.020.020.02生根率Rooting percentage/%72.51.44 f78.30.83 e79.22.20 de82.52.89 de84.22.20 cd88.31.67 bc92.51.44 b100.00.00 a表3植物生长调节剂对白城小黑杨抽茎增殖系数的影响Table 3Effects of plant growth regulators（PGRs）on stem proliferation coefficient of P.simoniiP.nigra Baicheng处理Treatment1234植物生长调节剂Plant growth regulators/（mgL1）6-BA0.10.10.20.2NAA0.050.100.050.10抽茎增殖系数Stem proliferation coefficient4.00.08 b2.80.12 d6.50.10 a3.10.10 c图3不同激素处理下白城小黑杨丛生苗的生根诱导Fig.3Rooting induction of clustered plantlets of P.simonii P.nigra cv.Baicheng under different hormone treatmentsA.1.0.1 mg L1 IBA；1+.0.1 mg L1 IBA+0.02 mg L1 NAA；2.0.2 mg L1 IBA；2+.0.2 mg L1 IBA+0.02 mg L1 NAA；B.3.0.3 mg L1 IBA；3+.0.3 mg L1 IBA+0.02 mg L1 NAA；4.0.4 mg L1 IBA；4+.0.4 mg L1 IBA+0.02 mg L1 NAA672何旭等：白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用5 期农杆菌侵染20 min时，阳性芽产生率为13.3%，显著高于其他2个处理（见表5）。因此，白城小黑杨遗传转化最适农杆菌侵染时间为20 min。2.2.2pBI121-35S：GUS遗传转化及鉴定遗传转化及鉴定白城小黑杨遗传转化流程如图6所示，农杆菌菌液侵染后共培养2 d，头孢水脱菌后将外植体接种到选择培养基中直接诱导抗性芽，大约30 d后可以看到茎段外植体两端伤口处分化出抗性芽，剪取抗性芽至抗性抽茎培养基中抽茎诱导1530 d后，将已经抽茎的抗性丛生苗接种至抗性生根培图4白城小黑杨茎段外植体的组织培养过程A.不定芽诱导4周；B.抽茎诱导30 d；CD.生根诱导25 dFig.4Tissue culture processes of P.simoniiP.nigra Baicheng stemA.Adventitious bud induction for four weeks；B.Stem induction for 30 d；C-D.Rooting induction for 25 d图5不同质量浓度卡那霉素下茎段分化情况Fig.5Differentiation of stem explants under different concentrations of kanamycin67343 卷植物研究养基中，抗性苗生根诱导10 d可以观察到生根情况，诱导25 d后对抗性植株进行GUS染色及PCR鉴定（图7）。2.2.3应拉木形成关键调控因子转基因植株应拉木形成关键调控因子转基因植株创制创制为了验证本研究建立的遗传转化系统的可靠性，在白城小黑杨中成功过量表达了调控应拉木形成的关键调控因子PtrLBD39基因。通过农杆菌侵染、抗性芽诱导、抗性丛生苗抽茎诱导及抗性生图7GUS染色及PCR鉴定结果A.阳性植株GUS染色；B.野生型植株GUS染色；C.转基因植株PCR鉴定（M.DNA marker DL5000；1.pBI121-35S：GUS质粒为模板的阳性对照；24.抗性植株叶片基因组DNA为模板；5.野生型白城小黑杨叶片DNA为模板的阴性对照；6.ddH2O为模板的阴性对照）Fig.7GUS staining and PCR identificationA.Gus staining of positive plant；B.Gus staining of wild-type plant；C.PCR identification of transgenic plants（M.DNA marker DL5000；1.Positive control with pBI121-35S：GUS plasmid as PCR template；2-4.DNA of kanamycin-resistance plant leaf as PCR template；5.Negative control with leaf DNA of wild-type plant as PCR template；6.Negative control with ddH2O as PCR template）表5侵染时间对阳性芽产生率的影响Table 5Effects of infection time on transgenic buds generation rates处理Treatment123侵染时间Infection time/min102030阳性芽产生率Transgenic buds generation rates/%8.01.15 b13.31.33 a6.70.67 b图6白城小黑杨遗传转化流程A.共培养阶段；B.选择培养阶段；C.抗性芽诱导；D.抗性丛生苗抽茎诱导；E.抗性生根诱导；F.阳性转基因植株Fig.6Transformation process of P.simonii P.nigra BaichengA.Co-cultivation；B.Selective cultivation；C.Kanamycin-resistance bud induction；D.Stem induction of kanamycin-resistance clustered plantlets；E.Rooting induction of kanamycin-resistance plants；F.Positive transgenic plants674何旭等：白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用5 期根筛选过程后（图8AF），分别提取待检测抗性植株和野生型叶片的基因组DNA，使用载体特异引物35SP1-F和PtrLBD39-R引物进行PCR扩增，基因组鉴定结果如图8G所示，抗性植株（第26泳道）和阳性质粒对照（第1泳道）的目的条带一致，而设置的 2组阴性对照（第7和第8泳道）则没有观察到任何条带，最终获得了5株转基因植株，这表明PtrLBD39重组质粒已经整合到白城小黑杨的基因组中。综上所述，本研究以白城小黑杨组培苗茎段为外植体，成功建立了白城小黑杨遗传转化体系，整个转化周期为5585 d。具体流程如图9所示，第1天12：00对含有目的基因载体的农杆菌菌液划线培养2 d，第3天17：00挑取单克隆接种至含有20 mg L-1利福平和卡那霉素的20 mL YEP液体培养基中，28、180 r min-1条件下培养约13 h至小摇菌液 OD6000.901.10；吸取 1.5 mL 小摇菌液至含有20 mg L-1利福平和卡那霉素的50 mL YEP液体培养基中，28、200 r min-1条件下培养67 h至大摇菌液OD6000.60；将大摇菌液转移至50 mL离心管中，4、2 200 r min-1离心10 min进行菌体收集；配置 30 mL 悬浮液悬浮稀释菌体 OD6000.400.45；选择生长健壮的白城小黑杨组培苗的第 23节茎段作为外植体进行后续遗传转化，切取长度约 1 cm 的茎段外植体置于共培养培养基中，所有茎段切好后将外植体全部转移至制备好的农杆菌菌液中侵染20 min，漏勺过滤菌液后用镊子转移外植体到共培养培养基中，黑暗条件下共培养48 h；共培养结束后用含有250 mg L-1头孢霉素的 100 mL 无菌水对外植体脱菌 5 min，再用100 mL无菌水清洗 2次，每次 3 min，随后将漏勺过滤后的茎段外植体接种于选择培养基中诱导抗性芽约30 d；将分化的抗性芽接种至抗性抽茎培养基中抽茎诱导1530 d，剪取抽茎的抗性丛生苗接种至抗性生根培养基中，抗性生根诱导10 d左右即可观察到生根情况，抗性生根诱导25 d后对抗性植株进行转基因植株的鉴定，最终获得阳性转基因植株。3 讨论3.1不同类型小黑杨的组织培养体系有所差异不同类型小黑杨的组织培养体系有所差异小黑杨为小叶杨（P.simonii）和欧洲黑杨（P.nigra）的杂交杨，因其适应性强、生长周期短等特点被视为良种选育的优质树种。经过长期的选育驯化，各地又形成了不同类型小黑杨，如白城小黑杨、白林三号小黑杨、昭盟小黑杨（P.simonira Chon-Lin“Zhao”）、小黑杨花粉植株等3，8，14-15。植图8白城小黑杨遗传转化PtrLBD39及其PCR鉴定A.共培养阶段；B.选择培养阶段；C.抗性芽诱导；D.抗性丛生苗诱导；E.抗性生根诱导；F.阳性转基因植株；G.转基因植株PCR鉴定（M.DNA marker DL1000；1.pBI121-35S：PtrLBD39质粒为模板的阳性对照；26.抗性植株叶片基因组DNA为模板的样品；7.野生型白城小黑杨叶片DNA为模板的阴性对照；8.ddH2O为模板的阴性对照）Fig.8Transformation and PCR identification of PtrLBD39 in P.simoniiP.nigra BaichengA.Co-cultivate stage；B.Selective stage；C.Kanamycin-resistant bud induction；D.Kanamycin-resistant clustered plantlets induction；E.Kanamycin-resistant rooting induction；F.Positive transgenic plants；G.Identification of transgenic plants（M.DNA marker DL1000；1.Positive control with pBI121-35S：PtrLBD39 plasmid as PCR template；2-6.Samples with leaf genome DNA of kanamycin-resistant plantlets as PCR template；7.Control with leaf DNA of wild-typ