S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达.pdf
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1、2023,27(19):7-11.实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeS100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达余海涛,陈正徐,谢扬虎,张飞?(1.安徽医科大学附属合肥医院检验科,安徽合肥,2 30 0 41;2.上海交通大学附属新华医院普外科,上海,2 0 0 0 9 2)摘要:目的克隆S100A4cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法Trizol 法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合
2、酶链反应GenBank获得 S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为32 7 bp的产物。构建pMD18-Tsimple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHI/Hind 双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKNI细胞中 S100A4mRNA表达水平。结果PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank 公布的无突变序列一致,Hind/B
3、a m H I 双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcDNA3.1空载体和正常未转染的MKN1细胞作为对照。结果表明,转染pcDNA3.1-S100A4表达载体48 h后,S100A4mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P 0.0 1)。结论构建完成pcDNA3.1-S100A4真核表达载体,S100A4基因在胃癌细胞MKN1中成功表达。关键词:真核载体;胃癌;基因转染;S100A4基因中图分类号:R735.2;R39 4.2 文献标志码:A文章编号:16 7 2-2 3532 0 2 3)
4、)19-0 0 7-0 5DOI:10.7 6 19/j c mp.2 0 2 319 0 3Construction of S100A4 gene vector and its expressionin human gastric cancer cellsYU Haitao,CHEN Zhengxu,XIE Yanghu,ZHANG Fei?(1.Department of Laboratory,Hefei Hospital Affliated to Anhui Medical University,Hefei,Anhui,230041;2.Department of General Sur
5、gery,Xinhua Hospital Afiliatedto Shanghai Jiaotong University,Shanghai,200092)Abstract:Objective To clone S100A4 cDNA and construct pcDNA3.1-S100A4 recombinantexpression vector,transfect gastric cancer cell line MKN1,and observe the expression of S100A4 ingastric cancer cells.Methods Total RNA of hu
6、man gastric epithelial cells GES-1 was extracted byTrizol method,and cDNA containing S100A4 gene was obtained by reverse transcription reaction.Thesequence of SI00A4 gene was obtained from GenBank by polymerase chain reaction(PCR),andprimers were designed to amplify the product with a molecular weig
7、ht of 327 bp.The pMD18-T sim-ple-S100A4 recombinant plasmid was constructed to transform JM109 bacteria.After the bacterial so-lution was sequenced successfully,the plasmid was extracted for double enzyme digestion by BamH IHind II,and the enzyme digestion products were recovered and purified,and th
8、e expression vectorpcDNA3.1 was connected to construct PCDNA3.1-S100A4 eukaryotic expression vector.The purifiedexpression vector was transfected into gastric cancer cell line MKN1 by liposome mediated transfectionmethod.The expression level of S100A4 mRNA in transfected MKN1 cells was detected by r
9、eversetranscription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results The sequencing results of the clonedvector linked with PCR products were consistent with the mutation-free sequence published by Gen-Bank,and the eukaryotic expression vector pcDNA3.1-S100A4 could be successfully constructed by收稿日期:2 0 2
10、3-0 6-13基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(8 18 0 2 357)通信作者:陈正徐,E-mail:40 137 7 6 48 q q.c o m修回日期:2 0 2 3-0 7-2 78double enzyme digestion of Hind II/BamH I;pcDNA3.1-S100A4 expression vector was transfectedinto gastric cancer cell line MKN1,and transfected empty pcDNA3.1 vector and normal untransfect-ed MKN1 ce
11、lls were used as controls.The results showed that the expression level of S100A4 mRNAwas increased 48 h after transfection with pcDNA3.1-S100A4 expression vector(P 0.01).Con-clusion The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-S100A4 is constructed,and S100A4 gene issuccessfully expressed in gastric ca
12、ncer cell MKN1.Key words:eukaryotic vector;gastric cancer;gene transfection;S100A4 gene胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。胃癌的主要治疗方法是手术和辅助化疗,但传统化疗副作用大,需要开发新的辅助治疗方法。研究胃癌发生发展的分子生物学机制,寻找新的靶点,将有助于开发更有效的诊断和治疗方法。近年来,S100蛋白家族越来越受到人们的关注,多个S100成员在肿瘤中表达异常,并与肿瘤的浸润和转移密切相关。文献1I报道,S100A2、S10 0 A 4、S100A6 和 S100A14 与各种恶性肿瘤的发病和进展有关。
13、S100A4蛋白是S100蛋白家族的成员,分子量约为 11 kDa,由10 1 个氨基酸组成。S100A4在许多人类肿瘤中都有表达,其表达与胃癌的侵袭和淋巴结转移密切相关,但S100A4基因在胃癌中的作用机制尚不清楚。本研究拟通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与基因重组技术构建重组真核表达载体pcDNA3.1-S100A4,然后转染胃癌细胞系 MKN1,本研究为进一步探讨S100A4对胃癌细胞生物学功能的影响及其在胃癌发病中的作用奠定了实验基础。1材料与方法1.1实验材料人胃黏膜上皮细胞系CES-1、人胃癌细胞系MKN1(安徽医科大学病理学研究室购买)、克隆载体pMD18-TsimpleV
14、ector、限制性核酸内切酶、大肠杆菌JM109感受态细胞和胶回收纯化试剂盒(均为Takara公司)、真核表达载体pcDNA3.1(+)、Li p o f e c t a mi n e r M 2 0 0 0 脂质体、TRIZOLReagent(均为Invitrogen公司)、反转录试剂盒(Pr o me g a 公司)、PCRKit(T IA NG EN公司)、质粒提取试剂盒(QIAgen公司)、RPMI1640培养基、胎牛血清(GIBCO 公司)。1.2实验方法1.2.1细胞培养:在37、5%CO2饱和湿度下,在RPMI1640培养基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、10 0 g/
15、mL链霉素)中培养实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeCES-1 和MKN1 细胞,0.2 5%胰蛋白酶(用生理盐水配制)消化传代。1.2.2总RNA的提取:提取GES-1细胞(细胞数约2 10 个)总RNA。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2 次,加入1 mL TRIZOL试剂;室温静置5min,加样枪吹打混匀,取1.5mLEppendorf管收集;加入0.2 mL氯仿,涡旋振荡15s,室温静置2 3min;4,12 0 0 0 转/min离心15min,将上清液转入另一支新试管;加入0.5mL异丙醇,混匀,室温静置10 min;4,
16、12000转/min离心10 min,弃上清;加1mL75%乙醇(DEPC水配制),涡旋冲洗1次;4,7 50 0 转/min离心5min,弃上清;风干15min,将沉淀物溶于0.0 1%DEPC-H,0中,取少量进行含量和纯度检测,剩余部分保存于-70冰箱中。1.2.3cDNA的合成:采用Promega逆转录试剂盒,将总RNA逆转录到cDNA第一链上。总反应体积为2 0 L,反应体系见表1。表1cDNA合成反应体系试剂Total RNAMgCl,(25 mmol/L)Reverse transcription 10 bufferdNTP Mixture(10 mmol)Rnase Inhib
17、itor(40 U/L)AMV Reverse Transcriptase(20 U/L)Oligo(dTis)Primer(0.5 mg/mL)Nuclease-free Bacteria-free waterTotalRNA:总RNA;M g Cl z:氯化镁;Reversetranscription:逆转录;dNTPMixture:核苷混合物;Rnase Inhibitor:核糖核酸抑制剂;AMV Reverse Transcriptase:AMV逆转录酶;Oligo(d T/s)Pr i me r:O l i g o(d T i s)引物;Nuclease-freeBacteria-f
18、reewater:无核酸酶。无菌水反转录反应条件:42 6 0 mi n -9 9 5 mi n 4 5 mi n。1.2.4PCR扩增:参照GenBank人S100A4基因cDNA序列(基因登录号:NM_011311),使用第2 7 卷剂量2.0g4.0L2.0uL2.0uL1.0 L1.0 L1.0 LUp to 20.0 L第19 期实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice9Primer3.0软件设计引物,以转逆录合成的cDNA作为模板进行PCR扩增,扩增片段长度32 7 bp。所用的引物序列如下:5-CCCAAGCTTGTCATG
19、GCGTGCCCT-3;5-CGCGGATCCTCATTTCTTCCTGGGCT-3。PCR反应体系见表2。表2 PCR扩增反应体系试剂CDNA10 Reaction Buffer(MgCl,15 mmol/L)dNTP(2.5 mmol/L)Forward Primer(20 mol/L)Reverse Primer(20 mol/L)Taq DNA polymerase(5 U/L)Bacteria-freewatercDNA:互补 DNA;10 Reaction Buffer(MgCl,15 mmol/L):10反应缓冲液(氯化镁15mmol/L);d NT P:核苷;ForwardPr
20、imer:正向引物剂;ReversePrimer:反向引物;Taq DNA polymerase:Taq DNA聚合酶;Bacteria-free water:无菌水。PCR反应条件:30个循环955m in 9 530 s 58 30 s 7 2 10 m in7230 sPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳证实,用凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。1.2.5pMD18-Tsimple-S100A4构建:载体连接,反应体系(混匀,16 过夜,用于转化)见表3。表3PCR扩增反应体系试剂Ligation Solution IpMD18-T simple载体纯化DNA片段总反应体积Ligation
21、 Solution I:酶溶液 I。转化:将6 L连接产物加入6 0 L的JM109感受态大肠杆菌中,轻轻混匀,置于冰上30min。42 热休克55s,立即置于冰上,加人940LLB培养基,37 150 转/min孵育1h,取200L涂布于LB琼脂平板(含50 g/mL氨苄青霉素纸片,X-Gal,IPT G)上,37 培养过夜,筛选蓝白阳性克隆。富集测序:挑取数个白色单菌落,接种于5mL LB培养基中,37 孵育12 16 h。以2 L菌液为模板进行PCR 扩增,筛选出阳性克隆,送1mL菌液至金域检验公司测序。质粒提取:取2 mL菌悬液转移至Eppendorf管中,10 0 0 0 转/min
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