RIP3对A型塞内卡病毒复制影响的机制研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212014RIP3 对 A 型塞内卡病毒复制影响的机制研究马潇雨，郭紫晶，张瑞，王梦瑶，谭小雨，游青，李彦敏*，张志东*(西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041)摘要：为探究细胞程序性坏死的关键蛋白受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)对A型塞内卡病毒(SVA)复制的影响及其潜在的作用机制，本研究采用SVA(MOI 1)感染PK-15细胞(PK-15+SVA)，PK-15细胞作为对照组(Mock)，采用western blot检 测RIP3、磷 酸化 的RIP3(P-RIP3)、混合 谱系 激 酶结 构域 样蛋白(MLKL)与 磷酸 化MLKL(P-MLKL)蛋白表达。结果显示，SVA感染促进PK-15细胞中P-RIP3和P-MLKL蛋白表达量显著增多(0.05)，表明SVA可激活程序性坏死相关蛋白RIP3和MLKL。利用RIP3特异性抑制剂GSK843处理PK-15细胞(PK-15+SVA+GSK843)，在SVA(MOI 1)感染12 h、24 h和48 h后，利用western blot和qPCR检测SVA非结构蛋白3D的表达水平和SVA mRNA(24 h)的转录水平。结果显示，与Mock组相比，感染细胞中SVA 3D蛋白和SVA mRNA转录水平均显著增加(0.05)。利用western blot检测细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达；采用SVA感染敲低自噬蛋白5(ATG5)的PK-15细胞(ATG5 KD)，利用western blot检测其中SVA 3D蛋白的表达；利用qPCR检测各组细胞中IL-6、IL-1茁、TNF-琢和IFN-茁 mRNA转录水平。结果显示，与Mock组相比，PK-15+SVA细胞中LC3-I的变化不明显，LC3-II蛋白表达水平明显下调；与PK-15+SVA组相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中LC3-I变化不明显，LC3-II蛋白表达水平则明显增加。与SVA感染的PK-15细胞相比，SVA感染ATG5 KD中3D蛋白表达水平明显下降。qPCR结果显示，与未感染SVA的对照组相比，PK-15+SVA中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著上调(0.05、0.001、0.0001)，与PK-15+SVA组相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著下调(0.05、0.001、0.0001)。本研究上述结果首次表明RIP3可调控细胞自噬，影响SVA的复制，并参与调控细胞自噬的发生与炎性细胞因子的转录，该结果为进一步阐明SVA的致病机制及其感染的防治提供重要的科学依据。关键词：A型塞内卡病毒；受体相互作用蛋白激酶-3；病毒复制；自噬；程序性坏死中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0604-07Preliminary study on effect of RIP3 on replication ofserenecavirus A and its mechanismMA Xiao-yu,GUO Zi-jing,ZHANG Rui,WANG Meng-yao,TAN Xiao-yu,YOU Qing,LI Yan-min*,ZHANG Zhi-dong*(College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China)Abstract:To investigate the effect and the potential mechanism of protein kinase-3(RIP3),a key protein interacting withreceptors of programmed cell necrosis,on the replication of Serenavirus A(SVA)in this study.RIP3,phosphorylated RIP3收稿日期：2022-12-13基金项目：西南民族大学优秀学生培养工程项目(2021NYYXS127)；四川省自然科学基金项目(2022NSFSC0073)作者简介：马潇雨(1998-)，女，回族，山东济南人，硕士研究生，主要从事动物疫病感染与免疫的研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author(P-RIP3),mixed lineage kinase domain-like protein(MLKL)and phosphorylated MLKL(P-MLKL)protein expression weredetected by western blot in SVA infected PK-15 cells(PK-15+SVA,MOI 1)and PK-15 cells(mock).Results showed that SVAinfection induced significant increase in P-RIP3 and P-MLKL protein expression in PK-15 cells(0.05),indicating that SVAactivates programmed necrosis.We then tested the expression level and the mRNA copies of SVA nonstructural protein 3D inSVA infected PK-15 cells(MOI 1)treated with GSK843(PK-15+SVA+GSK843),a RIP3-specific inhibitor,by western blot andqPCR after 12 hours,24 hours,and 48 hours post-infection.The results showed that SVA 3D protein expression and SVA mRNAcopies significantly increased in infected cells compared to that of the mock group(0.05).To test the effect of autophagy onSVA replication,the expression of autophagy-related protein microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3),and the mRNAtranscript levels of IL-6,IL-1茁,TNF-琢 and IFN-茁 were detected in SVA infected,autophagy protein 5 knock-down PK-15 cells(ATG5 KD).Results showed that the expression of LC3-II instead of LC3-I,was significantly down-regulated in SVA infectedPK-15 cells.When treated with GSK843,the expression of LC3-II instead of LC3-I significantly increased in SVA infected PK-15cells compared to that mock treated infected cells.SVA 3D protein expression levels markedly decreased in SVA infected ATG5KD cells compared to SVA infected PK-15 cells.qPCR results showed that mRNA transcript levels of four cytokines weresignificantly up-regulated in SVA infected PK-15 cells compared to that of the mock infection cells(0.05,0.001,0.0001),when in presence of GSK843,and mRNA transcription levels of four cytokines were significantly down-regulated in SVA infectedPK-15 cells(0.05,0.001,0.0001).Our results showed for the first time that RIP3 could regulate autophagy,thus affectingthe replication of SVA and participating in the regulation of the occurrence of autophagy and the expression of inflammatoryfactors.These results provided an important scientific basis for further elucidating the pathogenic mechanism of SVA and itsprevention and treatment.Key words:Seneca virus A;receptor-interacting protein kinase-3;viral replication;autophagy;programmed necrosisA型塞内卡病毒(Seneca virus A，SVA)是小核糖核酸病毒科()塞内卡病毒属的唯一成员1-2，于2007年首次在美国猪中分离到后，多个国家相继出现该病毒，该病毒感染后引起发病猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、创面溃烂，导致跛足甚至死亡，严重危害养猪业的健康发展3。SVA是单股正链RNA病毒，无囊膜，呈典型的二十面体对称结构，基因组全长约7.3 kb，含一个开放阅读框(Openreading frame，ORF)，编码4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和 8 种 非 结 构 蛋 白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)4。研究发现，SVA具有逃逸宿主固有免疫应答促进其自身复制的能力5。SVA 3A蛋 白 通 过 抑 制 视 黄 酸(维 甲 酸)诱 导 基 因 蛋 白-I(Retinoic acid inducible gene-I，RIG-I)的表达从而抑制IFN干扰宿主细胞固有免疫应答6。SVA 3C蛋白参与诱导的细胞凋亡促进SVA复制7-8。SVA的3D相对保守，常被用来建立SVA的检测方法9。此外，SVA感染诱导E2泛素结合酶UBE2L6的表达促进SVA的复制10。有研究通过高通量测序发现宿主细胞中的LncRNA也参与SVA感染宿主的过程11。但作为一种新发病病原，SVA的致病机制尚未阐明。受体相互作用蛋白激酶3(Receptor-interactingprotein kinase 3，RIP3)是RIP家族中的主要成员之一12，与RIP1形成坏死小体，激活混合系激酶区域样 蛋 白(Mixed-lineage kinasedomain-likeprotein,MLKL)，诱发细胞程序性坏死。RIP3不仅是细胞程序性坏死过程中的关键调控分子13，也是促进炎性反应过程中不可或缺的分子14，在炎症和抗病毒应答中发挥重要作用。有研究报道RIP3的激活可以抑制自噬进而促进柯萨奇病毒B3的复制15，而柯萨奇病毒A组 6型(CA6)的非结构蛋白3D可直接靶向RIP3诱导细胞程序性坏死而促进病毒自身增殖16。但RIP3是否参与调控SVA复制尚未见报道。本研究以SVA感染PK-15细胞为模型，利用特异性抑制剂GSK843抑制PK-15细胞的RIP3活性，检测RIP3对SVA复制的影响，并初步探究其分子作用机制，为进一步阐明SVA的致病机制及其感染的防制提供重要的科学依据。1材料与方法1.1主要实验材料PK-15、敲低ATG5(自噬蛋白5)马潇雨，等.RIP3 对 A 型塞内卡病毒复制影响的机制研究第 6 期605的PK-15细胞(ATG5 KD)及SVA株均由本实验室保存。RIP3抑制剂GSK843购自MCE公司；GeneJETRNA 纯化试剂盒购自Thermo Fisher公司；反转录试剂盒购自TOYOBO公司；RIPA细胞裂解液购自Bey-otime公司；2伊蛋白上样缓冲液购自SIGMA公司；兔源MLKL多克隆抗体(PAb)和鼠源茁-tubulin单克隆抗体(MAb)购自Proteintech公司；兔源磷酸化MLKL(P-MLKL)PAb和兔源磷酸化RIP3(P-RIP3)MAb购自Abcam公司；兔源LC3B PAb购自Cell Signaling Tech-nology公司；ECL显色 液、兔源RIP3 PAb及兔源GAPDH PAb均购自Affinity；羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP购自Invitrogen公司；鼠源抗SVA 3D PAb由本实验室保存。1.2引物设计与合成根据 GenBank 中猪源TNF-琢基 因(JF831365.1)、IFN-茁 基 因(NM_001003923.1)、IL-6基因(JQ839263.1)和IL-1茁基因(XM_021085847.1)序列，利用Primer 5.0设计荧光定量PCR(qPCR)检测引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。同时，参照文献17合成GAPDH引物，实验设GAPDH基因作为对照基因。1.3SVA感染细胞中RIP3、磷酸化RIP3(P-RIP3)、MLKL与磷酸化MLKL(P-MLKL)蛋白表达的westernblot检测本实验分别设立两个实验组和一个对照组。实验组1(PK-15+SVA)为采用SVA(MOI 1)感染的PK-15细胞。实验组2(PK-15+SVA+GSK843)为SVA(MOI 1)感染的GSK843处理的PK-15细胞，具体操作为：用特异性抑制RIP3活性的抑制剂GSK843(20 滋mol/L)预处理PK-15细胞 30 min后(前期预实验已证明该浓度GSK843不影响细胞活性)，加入SVA(MOI 1)和相同浓度的GSK843孵育 1 h后，在含等浓度的GSK843的2%FBS的DMEM培养液中37，5%CO2培养24 h后收集细胞。实验同时设未感染SVA的PK-15细胞为对照组(Mock)。利用RIPA裂解液裂解各组 细 胞，分 别 以 兔 抗 RIP3 PAb(1 颐1 000)、兔 抗P-RIP3 MAb(1颐1 000)、兔抗MLKL PAb(1颐1 000)、兔抗P-MLKL PAb(1颐1 000)和GAPDH PAb(1颐3 000)为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1颐7 500)为二抗，经west-ern blot检测RIP3、P-RIP3、MLKL与P-MLKL蛋白的表达情况。1.4抑制RIP3磷酸化对SVA复制影响的检测在SVA感染后12 h、24 h和48 h时收集1.3中各组细胞，利用RIPA裂解液裂解各组细胞，分别以兔抗P-RIP3MAb(1颐1 000)，鼠抗3D PAb(1颐1 000)和鼠抗茁-tublinMAb(1颐20 000)为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1颐7 500)羊抗鼠IgG-HRP(1颐7 500)为二抗，经western blot检测各组细胞中SVA 3D蛋白的表达。根据上述检测结果，选择最佳时间点的PK-15+SVA组和PK-15+SVA+GSK843组的细胞，利用GeneJET RNA 纯化试剂盒提取总RNA，经分光光度仪核酸定量后反转录为cDNA，以此为模板，采用文献17中SYBR GreenqPCR方法检测各组SVA 3D蛋白基因mRNA转录水平。1.5抑制RIP3磷酸化对细胞自噬影响的westernblot检测收集1.4中培养至感染后24 h时的PK-15+SVA组和PK-15+SVA+GSK843组细胞，利用RIPA裂解液裂解细胞后提取总蛋白，分别以兔抗 LC3 PAb(1颐1 000)和兔抗 GAPDH PAb(1颐3 000)为一抗，羊抗兔 IgG-HRP(1颐7 500)为 二 抗，经 western blot 检 测PK-15+SVA与PK-15+SVA+GSK843组细胞中LC3蛋白的表达情况，分析RIP3 磷酸化对细胞自噬影响。1.6敲低ATG5对SVA复制影响的western blot检测以SVA(MOI 1)分别感染PK-15细胞(WT)和ATG5KD细胞，37、5%CO2培养24 h后收集各组细胞，利用RIPA裂解液裂解各组细胞，分别以鼠抗3D PAb(1颐1 000)和兔抗 GAPDH PAb(1颐3 000)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1颐7 500)和羊抗兔IgG-HRP(1颐7 500)为二抗，经western blot检测敲低ATG5后对SVA 3D蛋白表达的影响，分析ATG5对SVA复制的影响。1.7抑制RIP3磷酸化对SVA感染细胞中炎症因子mRNA转录水平影响的qPCR检测收集1.4中感染SVA 24 h后的各组细胞，利用GeneJET RNA 纯化试剂盒提取总RNA，经分光光度仪核酸定量后反转录为cDNA，分别采用表1中IL-6、IL-1茁、TNF-琢、IFN-茁和GAPDH的引物，经qPCR检测Mock、PK-15+SVA和PK-15+SVA+GSK843组细胞中IL-6、IL-1茁、TNF-琢和IFN-茁 mRNA的转录水平。qPCR反应程序为：95 15 s，59 15 s，72 1 min，40个循环。按照公表 1引物序列Name of geneTNF-琢IFN-茁IL-6IL-1茁Primer(5-3)F:GCACTGAGAGCATGATCCGAGACR:CGACCAGGAGGAAGGAGAAGAGGF:CCTCCAAATCGCTCTCCTGATGTGR:CTTCTGACATGCCAAATTGCTGCTCF:GTCGAGGCTGTGCAGATTAGTACCR:GGGTGGTGGCTTTGTCTGGATTCF:AAGAGGGACATGGAGAAGCGATTTGR:TTGTTCTGCTTGAGAGGTGCTGATG中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年606式Ct=(Ct实验组-Ct内参)-(Ct对照组-Ct内参)计算2-Ct，及各炎症相关因子mRNA的相对转录水平，分析各组间差异。1.8数据的统计与分析采用Image J和GraphPadPrism8.4.3软件作图和分析各组实验数据；采用独立样本 检验进行显著性分析，*：0.05表示数据间差异显著，*：0.01、*：0.001、*：0.0001表示数据间差异极显著。2结果2.1SVA感染对细胞中RIP3和MLKL蛋白表达及其磷酸化的影响通过western blot检测感染SVA(MOI 1)24 h后Mock，PK-15+SVA和PK-15+SVA+GSK843组细胞中RIP3、P-RIP3、MLKL和P-MLKL蛋白的表达。结果显示，与Mock组相比，PK-15+SVA组细胞中RIP3和MLKL总蛋白量不变，但P-RIP3和P-MLKL蛋白的表达量显著增加(0.05)(图1A、图1B)；与PK-15+SVA组相比，PK-15+SVA+GSK843组细胞中利用RIP3的特异性活性抑制剂GSK843能使SVA感染诱 导的P-RIP3和P-MLKL蛋白的 表达量 显 著 下 调(0.01、0.05)(图1A、图1C)，而对RIP3和MLKL总 蛋 白 无 影 响。结 果 表 明 SVA感 染 激 活 RIP3 和MLKL的磷酸化，从而激活程序性坏死相关蛋白RIP3和MLKL。2.2抑制RIP3磷酸化对SVA复制的影响将SVA分别感染PK-15细胞及GSK843处理的PK-15细胞，于12 h、24 h和48 h取蛋白样，利用western blot检测SVA 3D蛋白的表达水平，于24 h取样采用qPCR检测SVA mRNA的转录水平。Western blot结果显示，与PK-15+SVA相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中非结构蛋白3D蛋白表达水平明显增高，其中感染后24 h(24 hpi)和48 hpi差异最为明显(图2A图2C)，因此选择24 hpi进行后续试验。qPCR结果显示，与PK-15+SVA相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中的SVAmRNA转录水平上调了约1.3倍(=3，0.05)(图2D)。上述结果表明RIP3能够抑制SVA在细胞中复制。2.3抑制RIP3磷酸化对细胞自噬的影响结果有研究报道RIP3可通过细胞自噬影响病毒的复制15，为分析RIP3是否通过细胞自噬影响SVA复制，采用western blot检测SVA分别感染PK-15细胞和GSK843处理过的PK-15细胞24 h后细胞自噬相关蛋白LC3的表达水平。结果显示，相较于对照组，PK-15+SVA的细胞中LC3-I变化不明显，LC3-II蛋白表达水平下调；而与PK-15+SVA组相比，在PK-15+SVA+GSK843的细胞中，LC3-I变化不明显，LC3-II蛋白表达水平则明显升高(图3)。表明RIP3可通过抑制细胞自噬而抑制SVA的复制。2.4抑制细胞自噬对SVA复制影响的结果进一步将SVA分别感染PK-15细胞和细胞自噬相关基因ATG5敲低的PK-15细胞(ATG5 KD)24 h后，利用western blot检测各组细胞中SVA 3D蛋白表达水平，结果显示，与SVA感染的PK-15细胞相比，SVA感染ATG5 KD细胞中3D蛋白表达水平明显下降(图4)。上述结果进一步表明，RIP3可通过抑制细胞自噬而抑制SVA的复制。2.5抑制RIP3磷酸化对SVA感染的细胞中IL-6、IL-1茁、TNF-琢 和 IFN-茁 mRNA 转 录 水 平 的 影 响RIP3被激活常常伴随炎性反应的发生，从而在抗病毒免疫反应中发挥重要的作用。本研究利用qPCR检测SVA感染24 h后各组细胞中炎症相关因子mRNAGSK843SVAP-RIP3MLKL70ku54ku37ku24hpiA54kuP-MLKLRIP3GAPDH2.01.51.00.50.02.52.01.51.00.50.0BC*:0.05,*:0.01,*:0.001,*:0.0001,the same as below.A：Western blot 检测RIP3、P-RIP3、MLKL与P-MLKL蛋白的表达；B：RIP3和P-RIP3蛋白的灰度值分析；C：MLKL和P-MLKL蛋白的灰度值分析A:Expression of RIP3,P-RIP3,MLKL and MLKL protein by westernblot;B:Gray value analysis of RIP3 and P-RIP3 protein;C:Gray value analysis of MLKL and P-MLKL protein图1各组细胞中RIP3、P-RIP3、MLKL与P-MLKL蛋白表达的western blot 检测结果马潇雨，等.RIP3 对 A 型塞内卡病毒复制影响的机制研究第 6 期607图4敲低ATG5蛋白的表达对SVA复制影响的western blot检测结果GSK843SVAGAPDH37ku3D55ku图3抑制RIP3磷酸化对LC3蛋白表达影响的western blot检测结果GSK843SVA14ku24hpiGAPDH16ku37kuLC3-ILC3-IIAC：Western blot 检测12 hpi、24 hpi、48 hpi SVA 3D和P-RIP3蛋白的表达；D：qPCR检测24 hpi SVA mRNA的转录水平A-C:The expression of SVA 3D and P-RIP3 protein at 12,24,and 48hpi was detected by western blot;D:SVA mRNA transcript level wasdetected by qPCR图2抑制RIP3磷酸化对SVA复制影响的western blot检测结果DCGSK843SVAP-RIP33D茁-tublin70ku55ku55ku1.51.00.50.070ku55ku55kuGSK843SVAP-RIP33D茁-tublinGSK843SVAP-RIP33D茁-tublin70ku55ku55ku12hpi24hpi24hpi48hpiBA的转录水平。结果显示，与Mock相比，PK-15+SVA细胞中TNF-琢，IL-6、IFN-茁 mRNA的转录水平均极显著上调，依次上调约为13.8倍、13.4倍、14.4倍(=3，0.001或 0.0001)；IL-1茁 mRNA的转录水平显著上调约2.6倍(=3，0.05)。与PK-15+SVA相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中TNF-琢的mRNA转录水 平 均 极 显 著 下 调 了 约 98.3%、95.82%、97.7%(=3，0.001或 0.0001)，IL-1茁 mRNA转录水平显著下调了约69.7%(=3，0.05)(图5)。上述结果表明，RIP3正调控SVA感染诱导的IL-6、IL-1茁、TNF-琢和IFN-茁 mRNA转录水平。3讨论RIP3是一种具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白，是RIP家族中的成员，是诱导细胞凋亡的蛋白激酶之一，也是程序性坏死通路的必需激酶。研究证明RIP3在Caspase被抑制的情况下通过与RIP1结合形成坏死复合体，介导细胞程序性坏死，并伴随着炎症反应18。有研究报道CA6的非结构蛋白3D可直接靶向RIP3诱导程序性坏死而促进病毒自身增殖，图5抑制RIP3磷酸化对细胞因子mRNA转录水平影响的qPCR检测结果15105020151050AB43210151050CD中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年60824hpi123456789抑制该程序性坏死则可抑制CA6的复制，值得关注的是RIP3的下游分子MLKL的磷酸化不受CA6的影响16。本实验利用western blot 检测SVA感染PK-15细胞中RIP3、P-RIP3、MLKL与P-MLKL的蛋白表达，也发现SVA可以激活RIP3和MLKL的磷酸化，从而激活程序性坏死相关蛋白RIP3和MLKL。已证明RIP3与抗DNA病毒感染时的细胞死亡信号传导有关，研究表明RIP3通过抑制自噬对小RNA病毒柯萨奇病毒B3(CVB)的复制有促进的作用15。但本研究结果显示通过GSK843抑制PK-15细胞RIP3活性后反而促进了自噬的发生，且对SVA的复制有促进作用，推测可能是RIP3在不同病毒感染过程中发挥的作用不同。为了进一步验证这一结果，本研究将SVA感染ATG5 KD细胞发现，抑制自噬抑制了SVA的复制，这表明RIP3对SVA的复制的影响可能是通过调节细胞自噬完成的。研究发现RIP3不仅可以诱导坏死依赖性炎症，还在坏死非依赖性炎症方面发挥着重要的作用14。而促炎反应在抗病毒免疫反应中发挥重要的作用，促炎性因子TNF-琢可以激活RIP319，且RIP3参与促进Caspase-1的活化，进而促进IL-1茁的合成，而激活Caspase-1和GSDMD并释放成熟的IL-1茁是细胞焦亡的经典途径20。近期有研究表明SVA感染细胞能够促进IL-6的转录，而干扰IL-6基因表达后则抑制SVA的增殖21。已知RIP3可以与IFN调节因子结合，从而经IFN-茁诱导坏死22。IFN-1还能参与抗SVA免疫应答并发挥重要作用23，SVA还可以通过抑制IFN促进自身复制24-26，同时IFN-茁与促炎因子IL-1茁对IL-6也有正调节作用。本研究检测了IL-6、IL-1茁、TNF-琢和IFN-茁 mRNA的转录水平，发现SVA感染PK-15细胞可以上调这些细胞因子mRNA的转录水平，而抑制RIP3活性使得这些因子mRNA的转录水平下调。这表明RIP3可能不是通过调节IL-6影响SVA的复制。结合本研究上述各试验结果，推测细胞的炎性反应可能是RIP3通过程序性坏死或细胞焦亡引起的。程序性坏死和细胞焦亡是细胞程序性死亡途径的代表，均可通过破坏细胞膜造成细胞死亡并引起炎性反应27。在机制上，程序性坏死是RIP3依赖性细胞死亡，下游执行蛋白为MLKL，而细胞焦亡是由Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介导的细胞死亡，执行蛋白为消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)，可以促进IL-1茁的成熟与释放28。由于RIP3是程序性坏死的关键蛋白，徐玉林等人发现RIP3可参与促进Caspase-1的活化，进而促进IL-1茁的合成20。本研究中SVA感染PK-15细胞可激活RIP3，从而引起IL-1茁 mRNA转录水平的上调，因此，RIP3不仅介导细胞坏死，还可能调控细胞焦亡。本研究首次证实了宿主蛋白RIP3可以抑制SVA在PK-15细胞中的复制，推测RIP3通过自噬或调控除IL-6以外的细胞因子发挥抗病毒作用，这为进一步研究 RIP3影响SVA复制的相关分子机制提供了参考，丰富了RIP3的抗病毒作用，为研制抗SVA药物提供了实验基础。参考文献：ZHANG JIAN-QIANG,PI觡EYRO P,CHEN QI,et al.Full-lengthgenome sequences of Senecavirus A from recent idiopathic vesic-ular disease outbreaks in US swine J.Genome Announc,2015,3(6):e01270-15.SEGALES J,BARCELLOS D,ALFIERI A,et al.SenecavirusA:an emerging pathogen causing vesicular disease and mortalityin pigs?J.Vet Pathol,2017,54(1):11-21.GIMENEZ-LIROLA L G,RADEMACHER C,LINHARES D,etal.Serological and molecular detection of Senecavirus A associ-ated with an outbreak of swine idiopathic vesicular disease andneonatal mortality J.J Clin Microbiol,2016,54(8):2082-2089.BURKE M J.Oncolytic seneca valley virus:past perspectivesand future directions J.Oncolytic Virother,2016,5:81-89.WANG MIN-MIN,CHEN LU-LU,PAN SHUO-NAN,et al.Molecular evolution and characterization of novel Seneca valleyvirus(SVV)strains in South China J.Infect Genet Evol,2019,69:1-7.YANG WEN-PING,LI DAN,RU YI,et al.Foot-and-mouth dis-ease virus 3A protein causes 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