p38MAPK在周期性压应力下对颌骨成骨细胞分化的作用.pdf
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1、193Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 p38MAPK 在周期性压应力下对颌骨成骨细胞分化的作用*杜启翠,苏林旺,杭晨,郭娜 摘要 目的探讨 p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38 MAPK)在周期性压应力作用下对无牙颌种植覆盖义齿牙槽嵴成骨细胞分化中的作用机制,为无牙颌骨组织的改建和种植覆盖义齿修复提供理论依据。方法 构建无牙颌牙槽嵴成骨细胞力学刺激模型,采用简单随机抽样法将力学刺激模型分为对照组(15%压
2、应力)和阻断组(15%压应力+阻断剂)。加载参数设定为细胞拉伸形变率15%,加力时间均为6 h、12 h、24 h。CCK-8 检测牙槽骨成骨细胞增殖活性;Western-blotting 检测 p38 MAPK 差异性表达,qPCR 检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和破骨细胞分化因子(Receptor activator of nuclear factor-B ligand,RANKL)的差异性表达变化。结果 15%压应力使得牙槽嵴成骨细胞增殖活性增加,加力 12 h 细胞增殖活性最高;对照组加力 12 h 后,P-p38MAPK 蛋白、ALP mRNA、R
3、ANKL mRNA 的分别表达量均明显过于 6 h(P 0.05);加力24 h P-p38MAPK 蛋白表达量均比 6 h、12 h 显著升高(P 0.05);加力 24 h ALP mRNA、RANKL mRNA 的表达量比 6 h 显著升高(P 0.05),比 12 h 有一定程度升高(P 0.05)。阻断组加力 6 h、12 h、24 h P-p38MAPK蛋白、ALP mRNA、RANKL mRNA 的表达量分别均明显低于对照组相应的时间点(P 0.05)。结论 p38 MAPK 信号转导通路参与了周期性压应力下无牙颌种植覆盖义齿牙槽嵴成骨细胞分化的过程,参与无牙颌种植覆盖义齿修复骨
4、组织改建过程。关键词 p38MAPK;无牙颌;种植覆盖义齿;周期性压应力;细胞分化 中国图书分类号 R783.4 文献标识码 ADOI:10.19749/.cjgd.1672-2973.2023.04.001Effect of p38MAPK on the differentiation of mandibular osteoblasts under periodic compressive stressDU Qi-cui,SU Lin-wang,HANG Chen,GUO Na(Department of Stomatology,Liaocheng People s Hospital,Sha
5、ndong Liaocheng 252000,China)AbstractObjective To investigate the mechanism of p38 MAPK in the on differentiation of alveolar ridge osteoblasts of edentulous mandibular implant overdenture under periodic compressive stress,to provides a theoretical basis for the reconstruction of edentulous bone tis
6、sue and the restoration of implant overdenture.Methods:The mechanical stimulation model of edentulous mandibular alveolar osteoblast was constructed,and the mechanical stimulation model was divided into control group(15%compressive stress)and blocking group(15%compressive stress+blocking agent)by si
7、mple random sampling method.The loading parameters were set as 15%of the cell tensile deformation rate,and the loading time was 6h,12h,24h.The proliferation activity of alveolar osteoblasts was detected by CCK-8.The differential expression of ALP and receptor activator of nuclear factor-B(RANKL)were
8、 observed by qPCR.Results The proliferation activity of alveolar ridge osteoblasts increased with 15%compressive stress,and the proliferation activity was the highest at 12h.In the control group,the expression of P-p38MAPK protein,ALP mRNA and RANKL mRNA at 12h were significantly higher than those a
9、t 6h(P 0.05);.tThe expressions of P-p38MAPK at 24h were significantly higher than those at 6h and 12h(P 0.05).The expression of ALP and RANKL mRNA at 24h were significantly higher than that at 6h(P 0.05)and no significant difference at 12h(P 0.05).In the blocking group,the expressions of P-p38MAPK p
10、rotein,ALP mRNA and RANKL mRNA are significantly lower than those in the control group(P 0.05).Conclusion p38 MAPK signal transduction pathway is was involved in the process of alveolar crest osteoblast differentiation and bone tissue remodeling of edentulous mandibular implant covered denture under
11、 periodic compressive stress.Key words p38 MAPK;Edentulous jaw;Implant-supported overdenture;Cyclic compressive stress;Cell differentiation 基金项目 山东省医药卫生科技发展计划项目(2018WS426)作者单位 252000,聊城市人民医院(杜启翠,苏林旺,杭晨,郭娜)通信作者 苏林旺,E-mail:论著194 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.
12、4 无牙颌患者尤其是牙槽骨条件较差者,严重影响全口义齿的稳定性及固位力,降低无牙颌患者的口颌功能1。相比于传统全口义齿,无牙颌种植覆盖义齿可以提供更好的固位力和稳定性,提升患者舒适度和满意度2。机械力的刺激是维持骨组织细胞活性的重要调节因子,能够影响成骨细胞的增值、分化和凋亡等活动,进而促使骨形成或者是骨吸收3,为种植覆盖义齿修复提供骨组织改建。丝 裂 原 蛋 白 活 化 激 酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)广泛存在于细胞中,参与骨组织相关细胞的细胞内活动,是重要的力学信号传导通路。p38MAPK 信号通路作为 MAPK 重要的家族成员之一,能够
13、将细胞外刺激信号转入细胞核内或者细胞其他部位,为应激条件下的细胞分化、增值以及凋亡等做出相应的应答机制4。p38-MAPK/c-Fos 是机体调控破骨细胞分化、增值及炎症反应的重要通路,降低 P-p38 MAPK 水平,下调 c-Fos 表达,抑制炎症反应,并可抑制破骨细胞分化5。RANKL-RANK-TRAF6 轴可以激活p38MAPK,促进了破骨细胞前体的增殖分化6。目前,国内外关于细胞生物力学的研究越来越多,在众多力学加载装置中,Flexcell 加载系统是目前国际公认的有效、准确的细胞生物力学加载装置7。既然相应的机械刺激可以影响成骨细胞的表达活性,那么成骨细胞是如何将机械刺激信号转化
14、为生化信号并产生相应作用的呢?目前有关动态压力及成骨分化方面的研究较少,其具体的细胞内信号系统的作用机制尚不清楚。因此,本研究采用国外 Flexcell 加载装置系统,观察周期性压应力下无牙颌牙槽嵴成骨细胞的分化表达以及探讨 p38 MAPK 信号通路细胞分化中的作用,为无牙颌种植覆盖义齿修复提供一定的骨组织改建基础。1 材料与方法1.1 实验细胞 选取 60 65 岁老年人因修复需要拔除的磨牙窝的牙槽骨(磨牙无牙周病无龋坏),本研究已通过聊城市人民医院伦理委员会审批(批准号:2020011),患者知情并签订同意书。1.2 主要试剂与仪器 达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco 7S mo
15、dified Eagle 7S medium,DMEM)、胎牛血清、含乙二胺四乙酸的胰酶(Hyclone,美国);BioFlex 弹性基底膜 6 孔培养 板(Bioflex,Flexcell,美 国);Flexcell FX-5000T 应力培养系统(Flexcell 公司,美国);RT-PCR试剂盒和Trizol提取试剂盒(Takara,日本);CCK-8 检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);蛋白质印迹法制胶试剂盒(碧云天生物技术研究所);波形蛋白免疫荧光一抗、二抗(奥博森,武汉);显影定影试剂盒(Milipore,美国);二甲基亚砜(Sigma,美国);超净工作台(SPEGAIR,美国)
16、;倒置相差显微镜(OLYMPUS,日本);离心机(Eppendorff,德国);p38 MAPK 特异性阻断剂 SB203580(Sigma,美国)。1.3 试验方法1.3.1 细胞的培养 组织块贴壁法:在严格控制无菌条件下拔除磨牙,从磨牙上取牙槽骨组织,用Hanks 液反复冲洗,再用咬骨钳夹碎,吸管反复冲洗骨片,收集冲洗的细胞悬液 1000r/min(200g)离心 5 min,弃上清。获得的细胞加入含体积分数10%的胎牛血清、1%双抗的 DMEM 培养基的培养瓶中。置于 37、体积分数 5%CO2饱和湿度培养瓶中培养。采用差速贴壁法纯化原代细胞,将 3 代内消化传代的细胞悬液接种于培养皿中
17、。将培养皿十字摇晃,使细胞均匀分布,然后静止不动,8-10 min 后。将上清液转移到另一个培养皿中,再次摇匀,静置 8-10 min,将上清液转移至新的培养皿中,如此连续转移 3 次,将纯化后的牙槽骨细胞放进细胞培养箱中常规培养,待 3-5 代可用于后续实验。1.3.2 力学刺激模型的建立 实验采用负压仪(FX-5000,Flexcell,美国)对柔性细胞培养皿(Bioflex,Flexcell,美国)基底细胞施加周期性的压应力(-19.955kPa,10 次/min),该系统采用的负压交换原理,由于柔性培养孔的物理特性细胞可受到来自各个方向的应力刺激,通过计算机精准控制空气压力的大小来控制
18、细胞的受力情况的一种先进的细胞力学干预加载系统8。收集细胞悬液,调整细胞密度位 3108个/L,1 2 d后换液。将牙槽骨细胞移入柔性培养皿中,待细胞融合达 80%90%时,将培养液换为无血清或者是低血清的 DMEM 高糖培养液,细胞继续培养24 h 达到周期同步化后对细胞施加 6 h、12 h、24 h 15%细胞形变压应力,频率为 0.1Hz(每个循环5 s 压力和 5 s 放松)。1.3.3 实验分组 简单随机抽样将细胞分为对照组(施加周期性压应力)和阻断组(SB203580+周期性压应力),实验的样本量均大于 3。阻断组195Chin J Geriatr Dent,July,2023,
19、VOI.21.NO.4 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7 月第 21 卷第 4 期 在加力前 1 h 加入 20mmol/Lp38 MAPK 特异性阻断剂 SB203580。1.3.4 CCK-8 检测各加力时间牙槽骨细胞增殖活性 用含体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养细胞至足量后,以 1108个 L 的细胞悬液,按 100 L/孔液体量接种于 96 孔培养板中,37、5%CO2饱和湿度条件下,培养 24 h 细胞贴壁后按 1.3.2 分组处理,每组设 3 个复孔。具体操作步骤:向每孔中加入 10 l CCK-8 试剂,将96 孔板置于培养箱中孵育 2 h 后用酶联免疫标
20、记仪设定波长为 450 nm,检测各孔的 OD 值,取平均值,绘制细胞生长曲线。1.3.5 Western blot 法检测 P-p38MAPK 蛋白表达水平 收集各实验组细胞,采用细胞裂解液冰上裂解 30-40 min 提取 P-p38MAPK(蛋白分子量43kDa),离心去除细胞碎片。BCA 法测定蛋白浓度一致以后,100 水浴 5 min,室温放凉后-20保 存。分 别 取 40 g 蛋 白,经 SDSPAGE 电泳将凝胶中的蛋白电转移至 PVDF 膜上。加入Tween-20 PBS(PBST)配制含 5%脱脂奶粉的封闭溶液,PVDF 膜密封 2 h。将第一抗体按 1:1000 的比例稀
21、释使用,PVDF膜在振动台上4孵育过夜。次日取出并 PBST 清洗 3 次。将第二抗体按 1:5000比例稀释使用,室温下摇床孵育 2 h,最后用化学发光法显色,在 BioRad 蛋白成像仪成像,采用Quantity One 4.62 软件分析凝胶图像条带。实验重复 3 次。1.3.6 qPCR 检测 RANKL mRNA 和 ALP mRNA Trizol 法提取各组牙槽骨细胞的总 RNA,利用反转录试剂盒合成模板 cDNA,保存于-4。利用 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒,按照说明书进 行 RT-PCR 检 测。RANKL(84bp),上 游 引 物:5-AAAATCCCAA
22、GTTCGCA-3,下 游 引 物:5-GGACACCTGGACGCTA-3;ALP(137bp)上 游引 物:5-GACCTCCTCGGAAGACACTC-3,下 游引 物:5-TGAAGGGCTTCTTGTCTGTG-3。反 应体系 25l:SYBR Premix Ex Taq 工作液 12.5 l,cDNA 模板 2 l,目的基因的上、下游引物各 1 l。PCR 扩增条件:95预变性 10 min;94,30 S;50,30 S;72,2 min,4维持,共进行 35个循环。以 GAPDH 为内参。1.4 统计学分析 采用 SPSS 26.0 软件(IBM,美国)对所得计量资料进行统计学
23、分析,以“均数 标准差”表示,使用单因素方差分析比较每组各指标不同时间点的差异,不符合正态分布或方差不齐的数据采用 Kruskal-Wallis 检验;使用两独立样本的 LSD-t 检验比较各指标相同时间点的两组差异,检验水准为双侧=0.05。2 结 果2.1 细胞及不同时间压应力刺激牙槽骨成骨细胞增殖活性变化 原代培养的细胞(图 1)压应力刺激牙槽骨成骨细胞 6 h、12 h、24 h 后牙槽骨增殖活性变化(图 2)。不同时间压应力对牙槽骨成骨细胞增殖活性存在一定的促进作用,加力 12 h 对牙槽骨成骨细胞活性表现出明显的促进作用(P 0.05)。图 1 显微镜下观察牙槽骨细胞(400)图
24、2 机械压应力对牙槽骨成骨细胞增殖活性的影响2.2 两组细胞 P-p38MAPK 蛋白水平变化。Western blot显示,同等应力大小不同加力时间下,三组细胞(6 h、12 h、24 h)的 P-p38MAPK 蛋白表达增加,12 h与6 h均存在统计学意义(P0.05),而加力24 h P-p8MAPK蛋白表达也有一定的增加,但是 24 h 与 12 h 之间无明显统计学意义(P 0.05)。不同压力大小相同加力时间(6 h、12 h、24 h)下阻断组 P-p38MAPK 蛋白的表达均显著弱于相应对照组(P 0.05),(表 l,图 3)。196 中华老年口腔医学杂志 2023 年 7
25、 月第 21 卷第 4 期 Chin J Geriatr Dent,July,2023,VOI.21.NO.4 表 1 两组牙槽骨细胞 P-p38MAPK 表达的比较(xs)组别P-p38MAPK 蛋白表达F 值P 值6h12h24h对照组0.2560.0120.1990.017a0.3700.013ab85.6410.000阻断组0.1100.0110.1280.017a0.1870.011ab80.2110.000t 值2.0674.3724.491P 值0.0530.0060.004注:a 与同组 6h 相比差异有统计学意义(P 0.05);b 与同组 12h 相比差异无统计学意义(P
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