PFKFB4对骨肉瘤细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及其机制探讨.pdf
《PFKFB4对骨肉瘤细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及其机制探讨.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《PFKFB4对骨肉瘤细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及其机制探讨.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、(Chin J Lab Diag2023,27:0716)comacellsEffectof716Chin J Lab Diagn,June,2023,Vol 27,No.6文章编号:10 0 7 42 8 7(2 0 2 3)0 6 0 7 16 0 5PFKFB4对骨肉瘤细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及其机制探讨艾登超,董竹林(天津市泰达医院骨科,天津30 0 457)摘要:目的为探究磷酸果糖激酶2/果糖-2,6-二磷酸酶4(phosphofructokinase2/fructose-2,6-b i s p h o s p h a t a s e 4,PFKFB4)对骨肉瘤细胞增殖和迁移侵袭
2、能力的影响,并对其影响机制进行研究。方法使用QPCR法在正常成骨细胞系和骨肉瘤细胞系中检测PFKFB4的mRNA表达水平,在骨肉瘤细胞系MG63和HOS中分别使用小干扰RNA法和慢病毒转染法敲低或过表达PFKFB4,W e s t e r n Blo t 方法验证PFKFB3蛋白表达水平及相应信号通路变化,CCK8实验检测各组中骨肉瘤细胞增殖能力,transwell实验评估细胞迁移及侵袭,海马实验评估细胞糖酵解能力,ADP/ATP检测试剂盒评估细胞内ATP供应水平。结果骨肉瘤细胞系中PFKFB4的mRNA表达水平显著高于正常成骨细胞系。在PFKFB4敲低组中,骨肉瘤细胞系的PFKFB4蛋白表达
3、明显低于对照组。与对照组相比,PFKFB4敲低组细胞增殖、迁移及侵袭能力显著降低,细胞糖酵解及细胞ATP供应减弱,AKT通路活化受到显著抑制;而在PFKFB4过表达组中,骨肉瘤细胞系的PFKFB4蛋白表达显著升高。PFKFB4过表达细胞增殖、迁移及侵袭能力显著高于对照组,细胞糖酵解能力及细胞ATP供应水平增强,AKT通路活化水平增强。结论PFKFB4可通过增强骨肉瘤细胞糖酵解增强能量供应,从而激活AKT通路并推动肿瘤进展;PFKFB4有望成为治疗骨肉瘤的新靶点。关键词:PFKFB4;细胞增殖;糖酵解;AKT通路中图分类号:R739.96文献标识码:APFKFB4 on proliferatio
4、n,migration and invasion of osteosarAI Deng-chao,DONG Zhu-lin,(De-partment of Orthopedics,Tianjin TEDA Hospital,Tianjin 300457,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of phosphofructose kinase 2/fructose-2,6-bisphosphotase 4(PFKFB4)on the proliferation,migration and invasion of osteosarcom
5、a cellsand itsmechanism.Methods The mRNAexpression level of PFKFB4 was detected in normal osteoblast cell lines and osteosarcoma cell lines by using QPCR as-say,and PFKFB4 was knocked down or over-expressed in osteosarcoma cell lines MG63 and HOS by using small inter-fering RNA method and lentivirus
6、 transfection method,respectively.Western Blot method was used to verify the levelof PFKFB3 protein expression and the corresponding signal pathway changes,CCK8 experiment was used to detect theproliferation ability of osteosarcoma cells in each group,and transwell experiment was used to evaluate ce
7、ll migrationand invasion,Seahorse experiment was used to evaluate the glycolysis ability of cells,and ADP/ATP detection kit wasused to evaluate the intracellular ATP supply level.Results The expression level of PFKFB4 mRNA in osteosarcomacell line was significantly higher than that in normal osteobl
8、ast cell line.In the PFKFB4 knockdown group,the expres-sion of PFKFB4 protein in osteosarcoma cell lines was significantly lower than that in the control group.Compared withthe control group,the PFKFB4 knockdown group significantly reduced the cell proliferation,migration and invasion a-bility,cell
9、glycolysis and cell ATP supply,and the activation of AKT pathway was significantly inhibited;In thePFKFB4 overexpression group,the expression of PFKFB4 protein in osteosarcoma cell lines was significantly in-creased.The proliferation,migration and invasion ability of PFKFB4 overexpression group was
10、significantly higher thanthat of the control group,the cell glycolysis ability and ATP supply level were enhanced,and the activation level ofAKT pathway was enhanced.Conclusion PFKFB4 can increase energy supply by enhancing glycolysis of osteosarcomacells,thus activating AKT pathway and promoting tu
11、mor progression;PFKFB4 is expected to become a new target forthe treatment of osteosarcoma.Key words:PFKFB4;Cell proliferation;Glycolysis;AKT pathway*通讯作者骨肉瘤(Osteosarcoma,O S)是最常见且最具侵袭性的骨肿瘤,患者多为儿童、青少年和青年,早期第2 7 卷第6 期2023年6 月中国实验诊断学717及出现频繁复发和转移是其主要特点1。人群中OS的年发病率为每百万人中2-3人,15-19岁青少年发病率最高,为每百万人中8-11人。
12、OS常见于长骨,如股骨、胫骨和肱骨,而较少发生于颅骨、下颌和骨盆 2 。尽管手术可切除疾病的患者可能会存活很长时间,但复发和不可切除疾病患者的预后仍不令人满意。OS的总体预后在过去30 年中没有显著改善 3。因此,研究OS发生发展机制,开发新的治疗靶点成为当前研究的热点。代谢重编程是癌症进展的主要标志之一。即使在正常的氧合条件下,癌症细胞仍然选择通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸,这一现象被称为War-burg效应,该效应是代谢重编程的重要组成部分 4。细胞内果糖2,6-二磷酸(fructose2,6-b i-sphosphate,F2,6BP)水平对控制细胞糖酵解速率起到重要作用,它可增强6-磷
13、酸果糖-1-激酶(6-phosphofructo-1-kinase,PFK-1)与果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F6P)的结合,并克服ATP对PFK-1的抑制,促进果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate,F1,6 P2)的合成,推动糖酵解过程。F2,6BP的浓度由磷酸果糖激酶2/果糖-2,6-二磷酸酶(phosphofructokinase 2/fructose-2,6-b i-sphosphatase,PFKFB)控制 5已有报道表明,PFKFB家族在多种肿瘤中存在异常表达并在促进肿瘤进展中发挥重要作用。尽管PFKFB(PFKFB
14、1-4)的4种同工酶的核心催化域具有较高的序列同源性(8 5%),但它们的催化特性具有很大差异。因此,尽管对PFKFB4促进肿瘤进展的相关机制已在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤中得到充分揭示,PFKFB4在骨肉瘤中的作用及其具体机制仍呕待探索。因此,本研究拟在两种骨肉瘤细胞系中进分别敲低或过表达PFKFB4,并探讨其对细胞生物学行为的影响以及内在机制,为骨肉瘤药物靶点的鉴定提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料人成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Sa o s-2、U 2 O S和HOS均购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATC
15、C)并进行了STR鉴定,细胞传代在2 0 代以内;DMEM高糖培养基,1XPBS缓冲液购自美国Gibco公司,Seahorse Assay kit 购自 Agilent Tech-nologies公司。Cell Counting Kit-8(CCK8)购自日本同仁公司,RIPA蛋白裂解液,一抗二抗稀释液、BCA蛋白定量试剂盒,化学发光ECL试剂,等均购自武汉博士德公司,兔源GADPH抗体,兔源PFKFB4抗体,鼠源AKT抗体,鼠源p-AKT抗体,过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均购自美国Abcam公司;胎牛血清、10 0 青霉素-链霉素混合物购自美国Gibco公司;PFKFB4敲低小干扰RNA和过
16、表达病毒购自上海吉凯生物有限公司。1.2方法1.2.1细胞培养人成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Sa o s-2、U 2 O S和HOS培养基配制:10%胎牛血清+90%DMEM高糖培养基+1%青霉素-链霉素混合物,于37,5%CO,的细胞培养箱中培养。1.2.2丝细胞分组与转染将细胞分为对照组和实验组。使用上海吉凯生物科技有限公司设计并构建的PFKFB4敲低小干扰RNA和过表达病毒,根据上述供应商提供的说明书在骨肉瘤细胞系中敲低或过表达PFKFB4基因。构建成功后,Western印迹实验用于检测敲低或过表达效率。1.2.3CCK8细胞检测当细胞消化后计数,在96孔板中每孔接种
17、30 0 0 个细胞。将96 孔板放于培养箱中,分别在细胞贴壁后0 天、1天、2 天、3天和4天加人CCK8试剂,避光培养2 h后测定吸光度。1.2.4Transwell检测使用具有2 4孔聚碳酸酯膜(8 mm孔径;美国康宁)的Transwell细胞进行细胞迁移测定。将含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(50 0 l)加人下腔后,置Transwen小室。收集150 l不含血清的细胞悬浮液(110 细胞ml)铺人每个小室上层,并在37、5%CO,孵育2 4h。以4%多聚甲醛细胞固定液固定,并用0.1%结晶紫染色。对于细胞侵袭测定,在加人细胞悬浮液之前,用 Matrigel(BD Bios
18、ciences)涂覆 Transwell室。1.2.5Seahorse Assay按试剂盒说明书进行操作。在XFe24细胞培养板(10 2 342-10 0,AgilentTechnologies)中每孔接种2 0 0 0 0 个细胞,并在37 下孵育过夜。第二天,将培养基改为含有1mM谷氨酰胺的海马XFDMEM培养基,然后将细胞在37下在无COz培养箱中培养6 0 min,以平衡培养基pH和温度。在基线条件下监测细胞外酸化率(ECAR),并用10 mM葡萄糖、1M寡霉素、50mM 2-DG处理。1.2.6ADP/ATP比值使用购自Sigma-Aldrich的ADP/ATP试剂盒测量ADP/A
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- PFKFB4 骨肉 细胞 增殖 迁移 侵袭 能力 影响 及其 机制 探讨
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。