白头翁对照提取物的制备及其在药材质量控制中的应用.pdf

中国兽医杂志():白头翁对照提取物的制备及其在药材质量控制中的应用刘 乙 普乔丽 高 阳 於文博 关树光(长春中医药大学药学院 吉林 长春 长春中医药大学吉林省人参科学研究院 吉林 长春)摘要:为制备并标定白头翁对照提取物探讨白头翁对照提取物代替单体对照品在中药质量控制中应用的科学性和可行性本试验采用大孔吸附树脂法结合高速逆流色谱法制备白头翁对照提取物采用高效液相色谱法以白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 为指标对其进行含量标定分别以已知含量的对照提取物和 个单体对照品为对照通过高效液相色谱法测定 批白头翁药材中 个化学成分的含量对照提取物法和对照品法测得的结果采用 检验法进行比较 结果显示 种方法测定白头翁药材中白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的含量无显著性差异(.)结果表明白头翁对照提取物替代单体对照品用于白头翁药材质量控制的方法科学可行为白头翁药材的质量评价提供了新的思路和方法关键词:白头翁 对照提取物 质量控制 白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 中图分类号:文献标志码:文章编号:()():.().(.).:收稿日期:基金项目:吉林省中医药科技项目()作者简介:刘乙()女硕士生从事中药及复方药效物质基础和质量标准的研究:.通信作者:关树光:.白头翁()是毛茛科植物白头翁()的干燥根临床常用于痢疾、滴虫性阴道炎和腹泻等疾病的治疗也广泛应用于禽类和畜类等多种动物疾病的治疗对仔猪白痢病、奶牛临床型乳房炎、沙门菌或大肠杆菌引发的肠胃感染等均具有良好的治疗效果 作为兽用白头翁散(汤)的君药白头翁起到清热解毒、凉血止痢的作用 随着国内外对中药材的深入研究发现药材质量对制剂疗效起着关键作用 由于产地不同白头翁药材市场混乱质量控制标准问题亟待解决白头翁中富含皂苷类化合物不同皂苷的活性中 西 结 合 卷研究已有报道如果仅仅以白头翁皂苷 为指标性成分对白头翁药材质量进行评价所得结果过于单一不能充分体现药材多成分特点而采用白头翁对照提取物进行评价可提高检验效率、节省检测时间、降低检测成本同时也能够多方面地评价白头翁药材的质量 有研究报道由于产地影响药材质量良莠不齐并且存在真伪品混同使用的情况 白头翁在兽用白头翁散(汤)中的应用尚存在药效不理想、有效成分含量低等问题本试验制备并标定白头翁对照提取物并探索其在白头翁药材的质量控制中的应用为药材的高效利用、相关制剂药效的保证提供了理论依据 材料与方法 主要药品和试剂白头翁皂苷 (批号:)、白 头 翁 皂 苷(批 号:)、常 春 藤 皂 苷(批 号:)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司乙腈、甲醇(色谱纯)均购自美国 公司乙醇、正丁醇、乙酸乙酯(分析纯)等有机试剂均购自北京化工厂 型大孔吸附树脂购自南开大学天津化工厂 主要仪器岛津 高效液相色谱仪购自日本岛津有限公司 色谱柱()购自美国安捷伦科技公司 型十万分之一电子天平购自瑞士 公司 高速逆流色谱仪购自上海同田生物技术有限公司循环水真空泵购自巩义市予华仪器有限责任公司 型 旋转蒸发仪购自上海爱朗仪器有限公司 型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司 药材 实验室共收集到 批白头翁药材和饮片及 批白头翁对照药材来源信息见表 表 白头翁药材样品来源信息 编号购买地 批号药材产区编号购买地 批号药材产区北京同仁堂(长春市红旗街店)河北国新晋药有限公司辽宁北京同仁堂(长春市迅驰广场店)河北国新晋药有限公司辽宁北京同仁堂(长春市自由大路店)河北国新晋药有限公司辽宁北京同仁堂(长春市红旗街店)辽宁自采长春中医药大学七星百草园吉林省宏检大药房河北自采长春九台吉林省宏检大药房河北吉深药房(长春市净月府店)甘肃安徽利辛县人民医院河北吉深药房(长春市净月府店)河北国新晋药有限公司山西天津市达仁堂辽宁国新晋药有限公司河北亳州药材市场河南国新晋药有限公司辽宁自采吉林天津思邈堂津正大药房天津亳州药材市场河北北京同仁堂(陕西省西安市)内蒙亳州药材市场吉林河北安国康派有限公司河北杏苑大药房(长春市迅驰广场店)河北河北安国康派有限公司河北福草集大药房河南吉林省宏检大药房辽宁白头翁对照药材源叶生物科技有限公司吉林省宏检大药房甘肃白头翁对照药材中国食品药品检定研究院 期刘 乙等:白头翁对照提取物的制备及其在药材质量控制中的应用 色谱条件 采用 色谱柱()以乙腈、水为流动相进行梯度洗脱洗脱时间程序见表流速 /检测波长 柱温 进样体积 表 梯度洗脱时间程序 时间()乙腈()水()白头翁对照提取物的制备本实验室前期已对提取工艺进行优化白头翁对照提取物制备方法:()取白头翁药材加入 倍量的 乙醇溶液回流提取 次每次 过滤合并滤液减压干燥取 加 水制成/的样品溶液()取 型大孔吸附树脂进行柱色谱初步分离 样品溶液以 /流速上样吸附 以 /流速用水洗脱 床容积()除杂以/流速用 乙醇洗脱 除去色素以/流速用 乙醇洗脱 并收集该洗脱液回收冻干得粉末()将粉末采用高速逆流色谱法进行第 步分离纯化制备条件:两相溶剂是乙酸乙酯 正丁醇 水(/)转速/流动相流速/样品用 流动相溶解进样后收集流动相每 为 个流分取第 个流分冻干即得到白头翁对照提取物 收集符合中华人民共和国药典(年版)规定的白头翁药材 批来源信息见表 中第 号样品按照以上方法制得 批白头翁对照提取物()白头翁对照提取物的标定 混合对照品溶液制备精密称定白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 加甲醇制成浓度分别为 、和 /的混合对照品溶液 线性关系考察 取混合对照品溶液 依次稀释、和 倍得混合对照品溶液 精密吸取混合对照品溶液 各 注入液相色谱仪按照 项色谱条件进行分析以化合物浓度()为横坐标色谱峰峰面积()为纵坐标进行线性回归分析 精密度考察精密称取白头翁对照提取物()加甲醇制成 /溶液摇匀即得对照提取物溶液 重复进样 次按照 项色谱条件测定白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的峰面积 计算相对标准偏差()值 稳 定 性 试 验 取 白 头 翁 对 照 提 取 物()同 制备得对照提取物溶液分别于制备后、和 进样按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算 值 重复性试验分别精密称取白头翁对照提取物()份同 制备得对照提取物溶液分别进样按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算 值 加样回收试验分别精密称取白头翁对照提取物()份每份约 按 等量加入白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 对照品同 制备得白头翁对照提取物加样回收试验溶液分别进样按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算加样回收率和 值 白头翁对照提取物含量标定 取 批白头翁对照提取物每批 份同 制备得对照提取物溶液分别进样按照 项色谱条件分析计算各对照提取物中白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的含量 白头翁对照提取物稳定性考察取 批白头翁对照提取物(、)置于常温避光处保存分别于第、天抽样检测检测方法同 考察白头翁对照提取物的稳定性 白头翁对照提取物在药材质量控制中的应用 白头翁对照提取物溶液的制备精密称定已标定含量的白头翁对照提取物()置于 容量瓶中加甲醇溶解定容摇匀制得对照提取物溶液 取对照提取物溶液 依次稀释、和 倍得对照提取物溶液 线性关系考察精密吸取对照提取物溶液 各 注入液相色谱仪按照 项色谱条件分析以化合物浓度()为横坐标色谱峰峰面积()为纵坐标进行线性回归分析 精密度考察精密称取 白头翁药材粉末(批号:)过 号筛置具塞锥形瓶中加入 甲醇密塞称重超声提取 冷却至室温后再次称重加甲醇至重量与首次所称重量相同 滤膜滤过即为供试品溶液 重复进中 西 结 合 卷样 次按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算 值 稳定性试验取白头翁药材粉末(批号:)同 制备得供试品溶液分别于制备后、和 进样按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算 值 重复性试验取同一批白头翁药材粉末(批号:)份同 制备得供试品溶液分别进样按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算 值 加样回收试验精密称取已知含量的白头翁药材粉末(批号:过 号筛)按 等量加入白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 对照品同 制备得白头翁药材加样回收试验溶液分别进样按照 项色谱条件测定 个化合物的峰面积计算加样回收率和 值.白头翁药材含量测定取表 中药材粉末(过 号筛)按照.项方法制备供试品溶液按照.项色谱条件分别采用对照品法和对照提取物法按照.和.项标准曲线计算 批供试品溶液中白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的含量 采用配对 检验法比较 种方法测定结果是否存在差异.表示差异不显著 结果 白头翁对照提取物的制备 混合对照品溶液和对照提取物溶液色谱图 如图 所示对照提取物中包含 个化学成分、和 分别为白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 和铁破锣皂苷 由于制备量不足 未检出图 混合对照品溶液()和对照提取物溶液()色谱图 ()():白头翁皂苷 :白头翁皂苷 :常春藤皂苷 :铁破锣皂苷 :未知:线性关系考察以 个化合物浓度(/)为横坐标色谱峰峰面积()为纵坐标分别进行线性回归分析结果如表 所示白头翁皂苷 在 /、白头翁皂苷 在 /、常春藤皂苷 在 /范围内线性关系良好 精密度考察 次重复进样测得白头翁对照提取物中白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 的峰面积平均值分别为 、和 值分别为 、和 表明仪器精密度良好 稳定性试验 结果如表 所示白头翁对照提取物溶液中白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 的峰面积平均值分别为、和 值分别为 、和表明对照提取物溶液在 内稳定性良好 期刘 乙等:白头翁对照提取物的制备及其在药材质量控制中的应用表 个化合物的标准曲线方程和线性范围 化合物标准曲线方程 线性范围(/)决定系数白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 表 稳定性试验 化合物峰面积()峰面积平均值()相对标准偏差()白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 重复性试验 份白头翁对照提取物中白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 的峰面积平均值分别为、和 值分别为 、和 表明该方法重复性良好 加样回收试验 结果如表 所示白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的平均加样回收率分别为 、和 值分别为 、和 表明该方法回收率良好表 加样回收试验 化合物样品中含量()加入量()测得值()回收率()平均加样回收率()相对标准偏差()白头翁皂苷 白头翁皂苷 中 西 结 合 卷续表化合物样品中含量()加入量()测得值()回收率()平均加样回收率()相对标准偏差()常春藤皂苷 白头翁对照提取物含量标定结果如表 所示 批白头翁对照提取物中白头翁皂苷 含量均在 以上白头翁皂苷 含量均在 以上常春藤皂苷 含量均在以上 个化合物总含量大于 说明对照提取物的制备方法可行工艺稳定可靠可以使用不同产地、不同批次的白头翁药材制备白头翁对照提取物用于白头翁的质量控制 白头翁对照提取物稳定性考察采用 检验法分析 批白头翁对照提取物于常温避光保存、和 后其白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 含量结果如表 所示 批对照提取物中 个成分的含量均无较大变化表明在 内白头翁对照提取物中 个成分具有良好的稳定性表 批白头翁对照提取物含量标定()()编号白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 表 白头翁对照提取物稳定性考察 编号时间()白头翁皂苷()白头翁皂苷()常春藤皂苷()白头翁对照提取物在药材质量控制中的应用 线性关系考察以 个化合物浓度(/)为横坐标色谱峰峰面积()为纵坐标分别进行线性回归分析结果如表 所示白头翁皂苷 在 /、白头翁皂苷 在 /、常春藤皂苷 在 /范围内线性关系良好 期刘 乙等:白头翁对照提取物的制备及其在药材质量控制中的应用表 个化合物的标准曲线方程和线性范围 化合物标准曲线方程 线性范围(/)决定系数白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 精密度考察 次重复进样测得供试品溶液中白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的峰 面 积 平 均 值 分 别 为 、和 值 分 别 为 、和 表明仪器精密度良好 稳定性试验 结果如表 所示供试品溶液中白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 的峰面积平均值分别为 、和 值分别为 、和 表明供试品溶液在 内稳定性良好表 稳定性试验 化合物峰面积()峰面积平均值()相对标准偏差()白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 重复性试验 份供试品溶液中白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 的峰面积平均值分别为、和 值分别为、和 表明该方法重复性良好 加样回收试验结果如表 所示白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 的平均加样回收率分别为 、和 值分别为 、和 表明该方法回收率良好 白头翁药材含量测定 批白头翁药材含量测定结果见表 批白头翁供试品溶液中白头翁皂苷、白头翁皂苷 和常春藤皂苷 三者对应 值分别为 、和 均大于 无显著性差异表明采用对照品法和对照提取物法测得的结果具有一致性可以使用白头翁对照提取物替代相应单体对照品对白头翁药材进行质量评价表 加样回收率试验 化合物样品中含量()加入量()测得值()回收率()平均加样回收率()相对标准偏差()白头翁皂苷 中 西 结 合 卷续表化合物样品中含量()加入量()测得值()回收率()平均加样回收率()相对标准偏差()白头翁皂苷 常春藤皂苷 表 批白头翁药材的含量测定 (/)编号白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 对照提取物法 对照品法 对照提取物法 对照品法 对照提取物法 对照品法 期刘 乙等:白头翁对照提取物的制备及其在药材质量控制中的应用续表编号白头翁皂苷 白头翁皂苷 常春藤皂苷 对照提取物法 对照品法 对照提取物法 对照品法 对照提取物法 对照品法 讨论传统医学中白头翁在临床医学以及畜牧和动物医学中的使用范围十分广泛白头翁汤及其加减药味复方、单味药白头翁是治疗细菌性痢疾、溃疡性结肠炎等肠道疾病的重要方剂白头翁散(兽用)对仔猪黄白痢、鸡大肠杆菌病等均具有确切的治疗作用 白头翁属植物在我国广泛分布各地普遍存在地方习用品“白头翁”药材销售或入药的情况 张璐等对收集到的 批商品白头翁进行白头翁皂苷 含量测定和指纹图谱评价研究发现收集到的样品中仅有 批为正品白头翁说明白头翁药材市场较为混乱 宋亚梅等收集了 批共 种不同产地的白头翁类药材测定白头翁皂苷 的含量结果显示白头翁、金县白头翁所含的白头翁皂苷 含量能达到中华人民共和国药典(年版)标准甚至达到 倍以上朝鲜、岩生、细叶、兴安白头翁含量却低于药典标准 方艳夕等对不同产地的 批白头翁药材的指纹图谱进行比较发现安徽产白头翁的白头翁皂苷 含量较高介于 /且相似度较高而吉林产白头翁与其他样品的相似度相对较低表明不同产地的药材质量存在较大差异因此对白头翁药材进行质量控制保证其临床疗效和用药安全非常重要中药对照提取物是中药质量控制中的一种对照物质形式相较于成分单一的单体对照品对照提取物的化学成分具有含量明确、比例相对固定、稳定性良好、纯度高、制备工艺简单、价格低廉等优点有利于中药质量评价方法的优化因此中药对照提取物的研究和应用前景良好 欧洲药典和美国药典把对照提取物列入标准物质之一在薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱峰定位等方面应用尤为广泛目前中华人民共和国药典收录的对照提取物共有 种数量较少需要进一步的研究和开发本试验制备了含量明确的白头翁对照提取物基于白头翁对照提取物的标定建立了白头翁药材化学成分含量的测定方法 试验结果显示采用对照提取物法和对照品法对白头翁药材进行分析值大于 种方法无显著性差异表明白头翁对照提取物可替代单体对照品将白头翁皂苷、白头翁皂苷、常春藤皂苷 作为整体对照物来应用既避免了单体化合物提取的繁琐又保证了质量控制评价的准确性为白头翁药材质量标准的进一步完善提供新思路参考文献:汪金华张敏.白头翁汤合芍药汤加减联合左氧氟沙星对细菌性痢疾患者细菌清除率及 和 水平的影响.中国微生态学杂志():.王洪杰吕冠华.白头翁汤临床应用概况.江西中医药():.马五杰张圆圆盛巧妮.白头翁汤联合葛根芩连汤加减灌肠治疗小儿感染性腹泻 例临床观察.湖南中医杂志():.刘丽春徐进.白头翁汤联合诺氟沙星治疗仔猪细菌性腹泻病中 西 结 合 卷的疗效.今日畜牧兽医():.苏柘僮肖劲邦钱柏霖等.白头翁皂苷 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