分子生物学硕士.pptx

5.核酸的分子杂交核酸的分子杂交 （southern blot/northern blot）6.反义核酸技术反义核酸技术(siRNA)7.基因芯片技术基因芯片技术5.核酸的分子杂交核酸的分子杂交（southern blot/northern blot）（1）变性）变性 即打开即打开DNA双螺旋结构，变成单链双螺旋结构，变成单链DNA的过程。的过程。变性的方法有：加热变性变性的方法有：加热变性 有机溶剂变性有机溶剂变性 高浓度盐变性高浓度盐变性 碱变性等碱变性等 常用方法是常用方法是加热变性和碱变性加热变性和碱变性。DNADNA变性时，在变性时，在260nm260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称处的紫外吸光度增加，这种现象又称增色效应。当增色效应达到最大值的增色效应。当增色效应达到最大值的50%50%时温度，称熔解温度时温度，称熔解温度（melting temperature Tmmelting temperature Tm值），值），TmTm值表明值表明DNADNA溶液中一半的溶液中一半的DNADNA双链已解离为单链，也就是说，双链已解离为单链，也就是说，TmTm值反映了值反映了DNADNA变性的程度变性的程度和难易，和难易，TmTm值越大，变性越难，反之，变性容易。值越大，变性越难，反之，变性容易。大大多多数数DNADNA的的TmTm值值在在85859090左左右右。但但TmTm值值并并不不是是一一个个固固定常数，常受许多因素影响。定常数，常受许多因素影响。DNADNA的的碱碱基基组组成成。A A：T T碱碱基基对对只只有有两两个个氢氢链链，而而G G：C C碱碱基基对对有有3 3个个氢氢键键。因因此此TmTm值值主主要要受受G G：C C碱碱基基对对数数量量多多少少的的影影响响，有一个经验公式为：有一个经验公式为：TmTm(G+C)%0.41(G+C)%0.4169.3 69.3 溶液的离子强度溶液的离子强度。DNADNA链上的磷酸基团带负电荷，它们链上的磷酸基团带负电荷，它们之间的静电具有相互排斥作用，可导致之间的静电具有相互排斥作用，可导致DNADNA双链结构的不稳定，双链结构的不稳定，比如：在无盐的水中，比如：在无盐的水中，DNADNA在室温条件下就会变性，而加入盐在室温条件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNADNA双链的稳双链的稳定性增加，定性增加，TmTm值亦会升高。值亦会升高。pHpH值，值，pHpH值在值在5 59 9之间范围内，之间范围内，TmTm值变化不明值变化不明显，即显，即DNADNA双链比较稳定，在高双链比较稳定，在高pHpH值情况下，可使碱基值情况下，可使碱基失去形成氢键的能力。当失去形成氢键的能力。当pHpH值大于值大于11.311.3时，所有氢键时，所有氢键均被破坏，均被破坏，DNADNA完全变性。这就是碱变性的原理。完全变性。这就是碱变性的原理。变性剂：变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形成，因此可以降低成，因此可以降低TmTm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲。值。常用的变性剂是甲酰胺和脲。通常用通常用5050的甲酰胺可以使的甲酰胺可以使TmTm值降低值降低3030。（2）复性）复性 变性变性DNA的两条互补单链，或两条具有同源性的两条互补单链，或两条具有同源性的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火。的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火。复性的（速度）过程要受到许多因素的影响。复性的（速度）过程要受到许多因素的影响。DNADNA的的浓浓度度：DNADNA浓浓度度直直接接影影响响到到DNADNA单单链链间间碰碰撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。DNADNA的的分分子子量量：大大分分子子量量的的DNADNA扩扩散散速速度度较较慢慢，碰碰撞撞机机率率较较少少，同同时时又又很很难难形形成成正正确确配配对对，因因此此复复性性速度较慢；但一旦复性，又难于变性。速度较慢；但一旦复性，又难于变性。温温度度：温温度度过过高高，有有利利于于DNADNA变变性性而而不不利利于于复复性性；而而温温度度过过低低，碰碰撞撞机机率率减减少少，一一旦旦形形成成局局部部错错误误配配对对，又又不不易易解解离离，难难以以继继续续寻寻找找正正确确配配对对，因因而而使使复性速度降低；适宜的温度是较复性速度降低；适宜的温度是较TmTm值低值低15152525。离子强度：离子强度：离子强度过低，不利于复性。离子强度过低，不利于复性。pHpH值值：pHpH值值在在5 59 9范范围围内内，不不影影响响复复性性速速度，过低或过高则影响。度，过低或过高则影响。DNADNA分分子子的的复复杂杂性性：DNADNA总总量量一一定定时时，基基因因组组越越复复杂杂，其其中中特特定定顺顺序序的的拷拷贝贝数数就就越越少少，互互补补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。（3 3）杂交体系的建立要考虑以下几因素）杂交体系的建立要考虑以下几因素 DNADNA浓度：浓度：DNADNA浓度越高，复性速度越快。其方浓度越高，复性速度越快。其方法有：加入足够的法有：加入足够的DNADNA；尽量减少杂交的体积，一般；尽量减少杂交的体积，一般以每平方厘米滤膜面积加以每平方厘米滤膜面积加5050100l100l杂交液为宜。杂交液为宜。DNADNA探针的长度：探针的长度：在杂交过程中，待测在杂交过程中，待测DNADNA固定固定在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越慢慢，变变性性越越慢慢。因因此此探探针针的的长长度度不不宜宜过过长长，一一般般以以101050bp50bp（一般探针（一般探针20bp20bp）。）。离离子子强强度度：离离子子强强度度对对变变性性影影响响较较大大。一一般般常常用用55或或6SSC6SSC（1SSC1SSC为为0.15mol/L Nacl0.15mol/L Nacl和和0.015mol0.015mol柠檬酸钠）。柠檬酸钠）。温温度度：温温度度对对于于杂杂交交（复复性性）反反应应的的快快慢慢和和洗洗膜膜时时去去掉掉非特异杂交是至关重要的因素。非特异杂交是至关重要的因素。一一般般认认为为杂杂交交温温度度为为：6868（不不含含甲甲酰酰胺胺（作作用用：降降低低Tm值）；当含值）；当含5050甲酰胺时，在甲酰胺时，在4242进行杂交。进行杂交。洗膜温度一般认为洗膜温度一般认为55556565。对对于于寡寡核核苷苷酸酸探探针针的的杂杂交交温温度度，应应根根据据下下列列公公式式推推算算：Tm=4GTm=4G：C C对对数数量量2A2A：T T对对数数量量。而而杂杂交交温温度度一一般般比比TmTm值低值低55，即，即5555。TmTm值的推算：与值的推算：与G G：C C对数量，离子强度，变性剂等有关。对数量，离子强度，变性剂等有关。杂交时间：杂交时间：经验杂交时间经验杂交时间816h，过夜。，过夜。减减少少或或抑抑制制非非特特性性杂杂交交。一一般般在在杂杂交交前前先先进进行行预预杂杂交交，以以便便将将非非特特异异性性DNADNA位位点点封封闭闭，同同时时也也将将膜膜上上 非非 特特 异异 性性 吸吸 附附 位位 点点 封封 闭闭。采采 用用 鲑鲑 鱼鱼 精精 子子DNADNA（Salmon Salmon Sperm Sperm DNADNA）或或小小牛牛胸胸腺腺DNADNA（Calf Calf thymus thymus DNADNA）封封闭闭DNADNA非非特特异异位位点点；采采用用脱脱脂脂奶奶粉粉封封闭闭DNADNA非非特特异异位位点点外外，更更主主要要封封闭闭膜膜上上非非特特异异吸吸附附位位点。点。促促进进杂杂交交反反应应速速度度：硫硫酸酸葡葡聚聚糖糖(dextran(dextran sulfate,Mw sulfate,Mw 500000)500000)能能促促进进DNADNA链链间间的的缔缔合合，其其微微粒粒表表面面可可吸吸附附DNADNA探探针针分分子子，从从而而使使DNADNA接接触触面面积积增增大大，有有利利于于杂杂交交反反应应，促促进进杂杂交交反反应应速速度度。如如1010硫硫酸酸葡葡聚糖可使杂交反应速度提高聚糖可使杂交反应速度提高1010100100倍。倍。预预杂杂交交；将将膜膜放放在在预预杂杂液液中中，即即不不放放探探针针，预预杂杂交交液液中中主主要要含含DehardtDehardt液液和和鲑鲑鱼鱼精精DNADNA，主主要要是是封封闭闭膜膜上上非非特特异异性性的的杂杂交交位位点点。预预杂杂交交的的温温度度和和时时间间一一般般与与杂杂交交的的温温度度和和时时间是一样的。间是一样的。预杂交液：预杂交液：5SSC5SSC；5 Denhardt5 Denhardt；50mmol/L PBS50mmol/L PBS；0.2%SDS0.2%SDS；500ug500ug变性鲑鱼精变性鲑鱼精DNADNA；50%50%甲酰胺甲酰胺 杂杂交交：杂杂交交液液中中除除含含封封闭闭物物质质外外，还还含含有有1010硫硫酸酸葡葡聚聚糖糖和和探探针针。探探针针如如果果是是双双链链DNADNA，则则需需要要进进行行变变性性处处理理：沸沸水水中中加加热热5min5min，然然后后迅迅速速置置冰冰浴浴中中（防防止止蛋蛋白白酶酶作作用用）；也也可可用用碱碱变变性性处处理理。探探针针是是寡寡核核苷苷酸酸片片段段、单单链链DNADNA或或RNARNA，则则不需要进行变性处理。不需要进行变性处理。（4 4）杂交操作步骤）杂交操作步骤 将将探探针针加加到到杂杂交交液液中中，然然后后与与膜膜上上的的待待测测核核酸酸进进行行杂杂交交反反应应。温温度度6868（不不含含甲甲酰酰胺胺），4242（含含5050甲甲酰胺），杂交时间：酰胺），杂交时间：8 816h16h过夜。过夜。洗洗液液：洗洗膜膜过过程程是是将将膜膜上上未未与与DNADNA杂杂交交的的及及非非特特异异性性杂杂交交的的探探针针从从膜膜上上洗洗去去的的过过程程。由由于于非非特特异异性性杂杂交交的的杂杂交交体体稳稳定定性性较较低低，解解链链温温度度较较低低，在在一一定定的的温温度度下下，非非特特异异杂杂交交体体容容易易解解链链而而被被洗洗掉掉，而而特特异异性性杂杂交交体体由由于于稳定而保留在滤膜上。稳定而保留在滤膜上。注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液。注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温37376565）。即逐渐增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，）。即逐渐增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为下一步反应（检测）做好准备。为下一步反应（检测）做好准备。（5）杂交信号的检测）杂交信号的检测 u放射自显影：放射自显影：探针标记了放射性核素，如探针标记了放射性核素，如32P、35S、125I或或131I。其具体方法是：在暗盒里。其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤膜放在暗盒里的将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗光片上，盖上暗盒，置盒，置70曝光一定时间。放射线可使曝光一定时间。放射线可使X光片光片曝光，经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，曝光，经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与探针相应序列及大小。探针相应序列及大小。u显色反应：显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在的情况下，可发生显色反应。一般情况异性底物存在的情况下，可发生显色反应。一般情况下，大都是通过间接法结合酶。即探针标记了半抗原，下，大都是通过间接法结合酶。即探针标记了半抗原，如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋白的配体（白的配体（avidin）结合酶，酶在有底物存在的情况下）结合酶，酶在有底物存在的情况下再发生显色反应。再发生显色反应。即即:A B C 酶酶+底物底物 显色显色探探针针标记物标记物(地高辛地高辛)抗抗体体 根据显色反应斑点大小判断结果。根据显色反应斑点大小判断结果。常用的酶常用的酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶：作用底物有：作用底物有：BCIP（5-溴溴-4-氯氯-4-吲哚磷酸）吲哚磷酸）NBT(硝基蓝四氮唑硝基蓝四氮唑)。显色过程：碱性磷酸酶显色过程：碱性磷酸酶 BCIP 脱磷，产生脱磷，产生H+NBT还原还原 紫色化合物。紫色化合物。辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）：常用的底物：常用的底物：DAB（二氨基联苯胺）（二氨基联苯胺）TMB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺）DAB经经HRP消化产生红棕色，有致癌性。消化产生红棕色，有致癌性。TMB 经经HRP消化产生蓝色，无致癌性。常用后者。消化产生蓝色，无致癌性。常用后者。u化学发光反应化学发光反应 与显色反应基本一致，只是酶（与显色反应基本一致，只是酶（HRP碱性磷碱性磷酸酶）催化一种特殊底物如酸酶）催化一种特殊底物如luminol、CSPD等，等，产生发光，而不显色。该化学光可使产生发光，而不显色。该化学光可使X光片曝光，光片曝光，经显影、定影后，可获得杂交斑点。化学发光是经显影、定影后，可获得杂交斑点。化学发光是一种有发展前途的检测方法。如需准确定性和定一种有发展前途的检测方法。如需准确定性和定量，可用数字成像系统进行检测。量，可用数字成像系统进行检测。SDS-PAGE浓缩胶（5%Acrylamide）配方表 SDS-PAGE分离胶（10%Acrylamide）配方表三三种种印印记记技技术术的的比比较较6.反义核酸技术反义核酸技术 6.1 RNAi实验基本概念 6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计 6.3 siRNA转染过程相关问题及解答 6.1 RNAi实验基本概念6.1.1 RNAi的概念:RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。6.1.2.RNAi的启动途径:(1)dsRNA途径(2)siRNA途径(3)shRNA表达载体途径(2)siRNA途径:小干扰RNA，长21-23bp，双链。作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。6.1.3.RNAi的效应表现:RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计6.2.1 采用siRNA进行实验的途径：(1)化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便(2)体外转录(3)Dicer/RNase酶解这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率6.2.2 siRNA设计需要注意的问题：(1)siRNA序列设计(2)阴性对照的作用(3)阳性对照的重要性(4)siRNA荧光标记的问题(1)siRNA的设计：理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。(2)阴性对照siRNA的作用：阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。(3)阳性对照siRNA的重要性：阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因；用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可行等；阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。(4)siRNA荧光标记的问题：采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。6.2.3 RNAi Off-target(脱靶效应)：(1)什么是RNAi Off-target(脱靶效应)?(2)脱靶效应如何检测？(3)siRNA浓度是否和脱靶效应相关？(4)转染试剂是否也会造成脱靶效应？(5)如何避免脱靶效应？(1)什么是RNAi Off-target(脱靶效应)?简单地说，就是siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目前已广泛引起研究者重视。(2)脱靶效应如何检测？多种方法可以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片的方法。(3)siRNA浓度是否和脱靶效应相关？以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会产生脱靶效应。(4)转染试剂是否也会造成脱靶效应？有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调，则会出现假阳性现象。(5)如何避免脱靶效应？脱靶效应并不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应的发生，如针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70以上的不同siRNA序列，分别进行实验，可避免siRNA造成的脱靶效应；采用不同转染试剂进行实验可避免转染试剂造成的脱靶效应等。6.2.4 转染是RNAi实验的瓶颈：转染质量的好坏直接关系RNAi实验的成败。(1)选择转染方法的原则(2)siRNA转染的方法(3)siRNA转染试剂的主要种类(4)脂质体(5)非脂质体聚合物类(1)选择转染方法的原则高转染效率：较高的转染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于实验结果的观察；低细胞毒性：因为RNAi是抑制性实验，转染试剂的毒性多导致细胞凋亡等结果，这种结果是对细胞正常生理功能严重干扰（主要表现为抑制），细胞无法进行正常转录表达而出现凋亡。转染试剂的毒性不仅干扰细胞正常的生理状态，甚至还可能影响实验结果；方法简单、操作简单：越简单，操作越少的实验过程，自然出错的机会就少，重复性就好，工作量也少；成本较低：由于siRNA转染需要筛选有效的siRNA，有效siRNA后续大量研究还需要不断进行siRNA转染，siRNA转染的成本尤其是转染试剂的成本在实验开始之初就需要充分考虑。(2)siRNA转染的方法到目前为止，转染的方法主要采用化学方法，化学方法不能转染的采用电转化等物理方法。(3)siRNA转染试剂的主要种类脂质体类非脂质体聚合物类(4)脂质体开发较早，主要针对转染质粒DNA等大分子开发，现在也被改良用于siRNA的转染；适合siRNA与质粒的共转以及一些对毒性要求不高的siRNA转染；代表产品有invitrogen公司的lipofectamineTM 2000和RNAiMAX。(5)非脂质体聚合物类：为克服脂质体转染试剂的毒性，并提高转染效率而开发，现在已从高分子聚合物类发展到纳米聚合物，这两年默克（Merck）、Qiagen和Clontech均相继推出了纳米聚合物类的转染试剂。英格恩生物(Engreen Biosystem)也推出了纳米聚合物转染试剂EntransterTM系列，其中EntransterTM-R专用于siRNA转染。6.3 siRNA转染过程相关问题及解答6.3.1 siRNA转染过程相关问题：(1)转染细胞数量的问题(2)转染时siRNA工作浓度(3)转染时血清的问题(4)转染时抗生素的问题(5)转染过程(6)转染后换液的问题(7)转染条件优化的问题(8)RNAi效应检测方法(1)转染细胞数量的问题：细胞数量：以转染时，细胞的汇合度在20-40为宜，这个汇合度比通常DNA转染的汇合度要小，这是因为转染后需要培养的时间通常比DNA转染的时间要长，同时较低的细胞数量也有利于提高抑制效率。需要注意的是：转染时细胞的汇合度（细胞数量）会对RNAi结果产生一定的影响。一些转染试剂，如脂质体，需要的汇合度会高一些，这是为了减轻转染试剂的毒性，一般来说，细胞数量较少更能提高抑制效率。(2)转染时siRNA工作浓度：siRNA浓度：需要根据具体的实验进行相关的优化。过低的siRNA浓度达不到相应的抑制效果，过高的siRNA浓度可能会引起一些非特异的改变。需要注意的是这里siRNA浓度指siRNA在反应时的终浓度，也就是以转染时细胞的总体积来计算的。一般siRNA的有效反应浓度在10nM-200nM。需要注意的是：siRNA的分子量，对21nt双链siRNA oligo来说，平均分子量约为13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol换算关系由于OD值受产物中其他成分影响，如荧光标记、纯度等，具体请询问合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。(3)转染时血清的问题：一些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h再更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R采用有血清转染，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，甚至还有助于提高转染效率。(4)转染时抗生素的问题：一些转染试剂，如脂质体，需要在转染时采用无抗生素培养基，这是由于脂质体转染会同时将培养基的一些成份包括抗生素也带进细胞，造成细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，由于不会将抗生素带进细胞，所以可以采用有抗生素转染，避免细胞污染。(5)转染过程：转染过程：转染的过程其实很简单。一般是分别稀释转染试剂和siRNA，然后二者混合，滴加到细胞表面，然后细胞继续培养。这点根据不同转染试剂的Protocol操作即可。(6)转染后换液的问题：一些转染试剂要求在转染后4-6h换液，其目的就是去除在培养基中的游离转染试剂，减轻细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，大多数情况下无需转染后4-6h换液，只需第二天正常换液即可，减少了工作量，尤其大大减轻下午转染，夜里还需要换液的工作量。(7)转染条件优化的问题：优化转染条件不仅是为得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低转染各条件对细胞的毒性。优化的方面主要有：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时细胞密度、转染的过程（培养基、抗生素对细胞的影响），转染后细胞多长时间换液等。(8)RNAi效应检测方法：mRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光检测和流式细胞检测。可在48h-72h检测。生物学效应：细胞学、酶活性、芯片分析等。6.3.2 siRNA转染疑问解答Q：siRNA转染和质粒DNA转染有什么不一样？A：1.siRNA转染多是蛋白表达抑制性实验，DNA转染多是蛋白过量表达实验，抑制性实验需要控制其他抑制性因素，如细胞毒性等；过量表达实验一般只需要相关表达体系完整即可；2.siRNA长21-23bp，DNA质粒通常都在5k bp以上，转染的载体的要求是不一样的，如同装沙子和装大石头需要的装卸工具不一样是一个道理；3.siRNA更容易降解，对转染各方面的要求更严格。(8)RNAi效应检测方法：mRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光检测和流式细胞检测。可在48h-72h检测。生物学效应：细胞学、酶活性、芯片分析等。7.基因芯片技术基因芯片技术基因芯片的应用1.DNA 测序2.基因表达谱分析（cDNA芯片等）3.基因诊断（艾滋病毒芯片、p53芯片等）4.用药个体化分析（不同人、不同药、不同剂量等、SNP）5.药物发现（药物靶点）6.中药研究（药物鉴别、中药筛选、毒性评价）举例：基因表达谱分析