白斑综合征病毒PCR检测方法的建立及初步应用.pdf

detection method for whitespot syndrome virusJ.Journal of Zhejiang Sci-Tech University,2023,49(5):645-650.Reference Format:LIU Qin,ZHANG Qiuya,JIANG Yonghou.Establishment and preliminary application of a PCR科学），2 0 2 3，49(5):645-650.引文格式：秋，姜永厚：白斑综合征病毒PCR检测方法的建立及初步应用LJ.浙江理工大学学报（自然DOI:10.39691673-3851(n)2023.05.014Journal of Zhejiang Sci-Tech University浙江理工学学报，第49卷，第5期，2 0 2 3年9月白斑综合征病毒PCR检测方法的建立及初步应用刘芹，张秋娅，姜永厚（浙江理工大学生命科学与医药学院，杭州310 0 18)摘要：引起白斑综合征（Whitespotsyndrome，W SS)的白斑综合征病毒（White spotsyndromevirus，W SSV）是一种传播速度快、致死率高的对虾病毒，对全球对虾养殖业构成了严重威胁。为及早诊断WSS,防止WSS的传播和暴发，有必要开发一种适用于对虾养殖场所的高灵敏度WSSV检测方法。该文针对保守区VP28序列设计和优化了一种可以特异地扩增WSSV的聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR)检测方法。WSSV扩增产物在凝胶电泳图上可观察到清晰且单一的目的条带，而非靶标病毒则没有对应扩增产物出现，最低检测限可以达到50 拷贝/反应；利用该PCR方法检测杭州地区采集的112 份对虾混样样品，WSSV阳性率为15.7%。该特异和灵敏的PCR方法可被应用于WSS流行早期监控。关键词：白斑综合征病毒；检测PCR；特异性；灵敏度；对虾中图分类号：S945.19;S945.4文献标志码：A文章编号：16 7 3-38 51（2 0 2 3）0 9-0 6 45-0 6Establishment and preliminary application of a PCRdetection method for white spot syndrome virusLIUQin,ZHANG Qiuya,JIANG Yonghou(College of Life Sciences and Medicine,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China)Abstract:The white spot syndrome virus(WSSV),a causative agent of white spot syndrome(WSS),is a rapidly spreading and highly lethal shrimp virus that poses a serious threat to the global shrimpfarming industry.To diagnose WSS early and prevent its spread and outbreak,it is necessary to establisha highly sensitive WSS diagnostic method suitable for shrimp farms.In this study,a common polymerasechain reaction(PCR)assay targeting the conserved VP28 sequence was designed and optimized tospecifically amplify WSSV.According to the gel electrophoresis map of the ampification products,a clearand single band was observed with WSSV,while non-target viruses were not amplified.The limit ofdetection of the assay can reach 50 copies/reaction.It is found that by using the PCR to detect 112 shrimpsample pools collected in Hangzhou,15.7%samples were positive for WSSV.The specific and sensitivePCR method for detecting WSSV can be applied to early monitoring of disease epidemics.Key words:white spot syndrome virus(WSSV);detecting PCR;specificity;sensitivity;shrimp0引言白斑综合征病毒（White spot syndromevirus，WSSV)是线头病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（W h i s p o v i r u s）的唯一成员，基因组为双链环状DNA，大小约为30 0 kb，预测编码至少18 1个蛋白，收稿日期：2 0 2 30 52 1网络出版日期：2 0 2 30 7 0 7基金项目：浙江省自然科学基金项目（LGC21C180002）作者简介：刘芹（1998 一），女，安徽滁州人，硕士研究生，主要从事病毒分子诊断方面的研究。通信作者：姜永厚，E-mail：y o n g h o u jia n g z s t u.e d u.c n2023年646第49 卷浙江理工大报（自然科学）是目前已知最大基因组的病毒之之_1-2 。WSSV是一种高致死率和高传染性病毒，侵染对虾鳃、肝胰腺、外壳等组织，导致患病虾外骨骼出现白色钙化斑点，引起白斑综合征（Whitespotsyndrome，W SS）。感染WSSV宿主在310 d内累积死亡率一般在90%10 0%3-41，自1992 年首次发现以来造成的经济损失总额约为8 0 150 亿美元，并且还以每年10亿美元的速度增加5-6 。1995年，国际兽疫局(Office international des epizooties,OIE)、联合国粮农组织(Food and agriculture organization,FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心（Networkofaquaculture centers in Asia-Pacific,NACA）将WSSV列为需要报告的重要水生动物病毒病的病原之一。由于尚未发现有效的防治药物7，建立一种有效检测WSSV的方法，从而在疫病流行早期阶段及时做出诊断，并采取隔离措施是控制该病毒传播的关键。近30 年来，研究人员开发了多种WSSV检测技术，包括原位杂交8 、单克隆抗体9、侧流免疫测定10 、酶联免疫和聚合酶链式反应（Polymerasechain reaction,PCR)12等。尽管这些技术解决了诊断问题的某些方面，但存在诸多局限性。原位杂交方法涉及切片及探针制备，需要专业的操作培训；单克隆抗体、侧流免疫测定及酶联免疫依赖免疫学原理，病毒免疫分析的成功取决于抗体的高度敏感性和特异性,而免疫抗体对某些变异病毒的敏感性和特异性较低，容易受到基质干扰的影响，限制了靶病毒抗原的稳定表达，进而影响检测的准确性13。PCR技术根据病毒核酸序列特异性扩增原理检测病毒，具有高效、便捷和准确性高等优点，逐渐成为病毒检测的主要方法。关于WSSV的PCR检测方法已有报道14-15，但最低检测限为10 410 拷贝反应，灵敏度较低；荧光定量PCR方法虽然灵敏度高，但需要的仪器和试剂成本较高，且容易出现假阳性16 。因此，本文针对WSSV建立一种特异性好、灵敏度高的常规PCR检测方法，对预防对虾WSS，选取正确的防治措施控制WSSV的传播及减少危害具有非常重要的指导意义1材料与方法1.1病毒与样品来源WSSV、对虾肝胰腺细小病毒（Hepatopancreasparvovirus,HPV)、传染性皮下和造血坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus,IHHNV)和无特定病原体(Specific pathogenfree,SPF)对虾基因组DNA/cDNA以及含目的片段WSSV质粒保存于本实验室；黄头病毒（Yellowhead virus，YH V）、斑节对虾杆状病毒（Monodonbaculovirus,MBV）和陶拉病毒（Taura syndromevirus，T SV)病毒基因片段由苏州金唯智生物有限公司直接合成。浙江杭州新农都市场共采集56 0 只活对虾，5只对虾混合作为一个混样样品，保存于一8 0 的冰箱中1.2实验试剂及仪器PCR扩增仪（Bio-Rad公司）,PowerPac电泳仪(Bio-Rad公司），Fresco21离心机（Eppendorf公司），Tanon3500R凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），超微量分光光度计Nanodrop2000（T h e r mo 公司），微波炉（Galanz公司）和快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒和AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒（Axygen公司），2 XTaqMasterMix(诺唯赞公司），琼脂糖（Invitrogen公司）。1.3病毒核酸提取取虾鳃、肝胰腺、肌肉组织0.2 g于1.5mL离心管中，研磨仪研磨充分，然后加1XPBSbuffer2mL混匀，反复冻融3次，病毒粒子充分释放后13000r/min离心10 min，吸取上清备用。根据AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书，取2 0 0 L上清提取病毒DNA。1.4引物设计参照WSSV基因组序列（GenBank序列号DQ979320），在包膜蛋白基因VP28保守序列中设计一对引物，上游引物WSSV-F：5-CT CT T T CGGTCGTGTCGGC-3,下游引物WSSV-R：5-T G CCAACTTCATCCTCATCAATA-3，目标产物493bp。引物由苏州金唯智生物有限公司合成。1.5模板定量及稀释将WSSV质粒解冻后，利用Nanodrop测量初始浓度，计算质粒初始浓度，将质粒10 倍梯度依次稀释到5拷贝/L，保存在一2 0 冰箱中备用。1.6体系优化根据实验室已有的PCR反应体系，对扩增程序进行优化，优化循环数（30、35、40 个循环和45个循环）和退火温度（40.0 6 5.0)：7.5L2MasterMix，0.4L上引物和下引物（浓度10mol/L)，1L对虾病毒模板（510 5拷贝/L)，最后用ddH,O补足至15L。初始反应程序647刘芹等：白斑综合征病毒PCR检测方法的建立及初步应用第5期如下：95预变性3min，95变性30 s，55退火30s，7 2 延伸30 s，循环34次，在7 2 延伸5min,PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳。1.7特异性分析根据优化后的PCR体系，分别以SPF虾基因组、YHV、M BV、T SV、I H H NV 和HPV 基因组DNA/cDNA为模板扩增，以ddH,O作为阴性对照，判断引物是否有非特异性扩增，以WSSV模板为阳性对照，判断产物大小是否符合预期1.8灵敏性分析取5X105拷贝的WSSV模板分别加反应体系中，通过琼脂糖凝胶电泳结果判断检测最低限度。1.9对虾样品的检测将56 0 只对虾分成112 组混样（5只对虾1组），采用已优化的PCR方法对112 组对虾混样样品进行检测，PCR产物经凝胶电泳初步认定为阳性后送苏州金唯智生物有限公司进行测序以再次验证。2结果与分析2.1退火温度优化为确定WSSV的PCR最适退火温度，在初始PCR程序基础上（循环数为35）进行温度梯度（40.0 6 5.0)扩增（图1)。从图1中可以看出，在40.0 6 0.0 均有条带扩增，在59.7、55.0 和49.4退火温度下条带最亮。综合考虑引物特异性和二聚体等因素，最终选择55.0 作为最佳退火温度。M12345678N2000bp1500bp1000bp750bp500bp493bp250bp100bp图1不同PCR退火温度扩增WSSV的产物电泳图注：M表示DL2000DNAMarker；1 8 分别表示不同退火温度的泳道，退火温度分别为6 5.0、6 3.0、59.7、55、49.4、44.7、41.7 和40.0;N表示阴性对照，WSSV病毒模板浓度为5X105拷贝/L。2.2循环数优化为确定WSSV普通PCR合适循环数，在最佳退火温度55.0 基础上，分别进行30、35、40 个循环和45个循环的扩增（图2）。从图2 中可以看出：WSSV在30 个循环下条带暗淡甚至降低一个灵敏度；35个循环下虽然能达到检测限最低拷贝数，但条带不够清晰；在40、45个循环下检测最低拷贝数时，条带都较为清晰且均无引物二聚体和非特异性扩增。考虑到反应时间和检测效率的问题，最终选择40 个循环作为PCR反应条件。M12345678910 111213141516N2000 bp1500bp1000bp750bp500bp493bp250bp100bp30个循环35个循环40个循环45个循环图2 大不同PCR循环数扩增WSSV的产物电泳图注：M表示DL2000DNAMarker;14、5 8、9 12、13 16 分别为510 3、510 2、510 1拷贝/L和5拷贝/L浓度病毒模板；N表示阴性对照。6482023年浙江理工大报（自然科学）第49 卷2.3特异性分别以 WSSV、YH V、H PV、IH H NV、M BV、TSV、PED V 和SPF对虾基因组DNA/cDNA为模板进行PCR,分析WSSVPCR检测方法特异性（图3）。从图3中可以看出：以WSSV为模板时，有清晰的单一条带产生，符合预期大小；以非靶标病毒为模板时没有非特异性扩增，同时阴性对照无二聚体产生。这表明建立的WSSV方法具有较好的特异性。2.4灵敏度分析以10 倍梯度稀释后的病毒标准品（510 5拷贝/L)为模板，在优化后的PCR反应体系中扩增，通过凝胶电泳图条带清晰度判断最低检测浓度，结果如图4所示。图4显示：随着标准品模板拷贝数的逐级降低，对应的特异性条带亮度也逐渐减弱，模板浓度最低为510 1拷贝/L时仍可以观察到特异性条带，表明针对WSSV建立的PCR方法最低检测限为50 拷贝/反应，灵敏度表现较好。M1234567N2000bp1000bp750bp500bp493bp250bp100bp图3WSSVPCR扩增不同对虾病毒的产物电泳图注：M表示DL2000DNAMarker;17 分别代表不同的病毒模板，1为WSSV；2 为YHV；3为HPV;4为IHHNV,5为MBV；6为TSV;7为SPF对虾基因组；WSSV病毒模板浓度为1X103拷贝/L；N表示阴性对照。2.5样品检测利用建立的WSSV检测方法检测112 份混合对虾样品，17 份阳性样品检出，样品阳性率为15.7%，根据俞潇潇等17 报道的混合检验总体率可信区间估计方法，获得虾群中WSSV的阳性率为3.3%；部分阳性样品送苏州金唯智生物有限公司测序，经BLAST序列比对，确定虾样品中的病毒为WSSV。M1234567N2000bp1500bp1000 bp750bp500bp493bp250bp100 bp图4WSSVPCR扩增不同浓度WSSV的产物电泳图注：M表示DL2000DNAMarker；泳道分别表示不同浓度质粒拷贝数，其中1表示5X10拷贝/L；2 表示510 5拷贝/L；3表示510 4拷贝/L；4表示510 3拷贝/L；5表示510 2 拷贝/L；6 表示510 拷贝/L；7 表示5拷贝/L；N表示阴性对照3 讨 论PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、效率高等优点，已广泛应用于水产品的各个研究领域18 。在PCR检测方法建立的过程中，引物对靶标病毒的特异性是诊断方法各项性能的基础1。通过对WSSV全基因组比对分析，找到保守区VP28并设计一对特异性引物，同时通过对退火温度和循环次数的优化，使得建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性。本文建立的PCR检测方法只对WSSV模板产生特异性单一扩增产物，对非目标模板和阴性对照均未产生扩增；对WSSV的最低检测限为50 拷贝/反应，比闫冬春等2 0 和Xie等2 1建立的WSSVPCR方法最低检测限（8 X105拷贝/反应和2 10 拷贝/反应）要低47 个数量级，接近于陈信忠等2 2 和Moody等2 3 建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法（30 拷贝/反应和2 拷贝/反应)以及Mendoza-Cano等2 4 建立的SYBR实时荧光定量PCR（12 拷贝/反应）。因此，本文建立的WSSVPCR检测方法具有特异性强和灵敏度高等优势，为WSS早期诊断提供了新的技术手段。近年来，WSSV在国内多个地区养殖对虾体内均有检出2 5-2 6 。本文采集了杭州地区112 份混合对虾样品，检测发现样品阳性率为15.7%，计算虾群刘649芹等：白斑综合征病毒PCR检测方法的建立及初步应用第5期阳性率为3.3%。施慧等2 5 在对浙江地区118 份凡纳滨对虾苗种检测发现，WSSV的阳性样品检出率为2 7.1%。陈一兵等2 6 在苏北地区养殖场516 份对虾样品中检测出139份阳性样品，阳性率为21.9%。孙悦等2 7 对2 0 14一2 0 2 0 年在天津地区采集的对虾样品检测发现，WSSV的感染率在1.23%7.2 3%。梁静真等2 8 对广西地区养殖对虾调查发现，2 0 132 0 16 年的WSSV样品检出率在13.8%2 1.6%。本文所检测对虾样品WSSV虾群阳性率略低于之前报道，可能与所采集样品皆为相对健康的成体虾有关，而健康成体虾携带WSSV更应引起养殖户警惕。4结论本文建立了一种特异性好、灵敏度高、操作简单和成本低的对虾WSSVPCR检测方法，最低检测限度可以达到50 拷贝/反应；应用该方法对112 份田间样品进行了检测和测序分析验证，确认了该方法的可靠性，为WSS早期防控及流行病学调查提供了技术支持。参考文献：1 Jeeva S,Kim N I,Jang I K,et al.Development of 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