补阳还五汤通过激活大鼠海马区沉默信息调节因子1减轻脑缺血_再灌注损伤后炎症反应的机制.pdf

网络出版时间：网络出版地址：补阳还五汤通过激活大鼠海马区沉默信息调节因子 减轻脑缺血 再灌注损伤后炎症反应的机制辛紫媛，刘真一，高萍，马娴，张彐宁，靳晓飞，高维娟，（承德医学院附属医院检验科，承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 ；河北中医学院 河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 ）收稿日期：，修回日期：基金项目：中央引导地方科技发展资金项目（）；河北省自然科学基金资助项目（）；河北省中医药管理局科研计划项目（）；河北中医学院科技能力提升项目（）作者简介：辛紫媛（），女，硕士，研究方向：缺血性脑血管病的发生机制及中医药防治，：；高维娟（），女，博士，博士生导师，研究方向：缺血性脑血管病的发生机制及中医药防治，通信作者，：文献标志码：文章编号：（）中国图书分类号：；摘要：目的探讨补阳还五汤（，）通过调节沉默信息调节因子 （，）发挥对脑缺血 再灌注损伤（，）大鼠脑组织海马区炎症反应的抑制作用及机制。方法大鼠制备大脑中动脉栓塞（）模型，分为假手术组（）、模型组（）、补阳还五汤组（）、抑制剂组（）。各组大鼠通过 检测神经功能学评分；染色测定脑梗死体积；染色观察海马区的病理损伤情况；检测 、表达水平；免疫组化检测 、表达水平。结果与 组相比，组神经功能学评分增高（）；脑梗死体积增加（）；海马区神经细胞损伤严重、排列紊乱、核破碎；表达减少，表达增加（）；、表达增加（）。与 组相比，组神经功能学评分降低（）；脑梗死体积减小（）；海马区神经细胞损伤减轻；表达增加，表达减少（）；、表达减少（）。与 组相比，组神经功能学评分增高（）；脑梗死体积增加（）；海马区神经细胞损伤加重；表达减少，表达增加（）；、表达增加（）。结论 可激活大鼠脑组织海马区 ，减轻 后炎症反应发挥脑保护作用。关键词：补阳还五汤；脑缺血 再灌注损伤；组蛋白去乙酰化酶；炎症反应；海马开放科学（资源服务）标识码（）：脑缺血 再灌注损伤（，）是一种诱发缺血性脑中风的主要病理生理进程，目前普遍研究表明，神经炎症反应在 早期脑损伤的病理过程中发挥至关重要的作用，脑组织受到缺血刺激后血液再通可合成和分泌大量的炎症细胞因子导致过度的炎症反应，进而导致神经细胞损伤加重 。沉默信息调节因子 （，）被预见为对于越来越多的心脑血管疾病的潜在治疗靶标，其激活也可以被认为是一种神经保护策略 。中医药在治疗气虚血瘀症中风上具有辩证论治的独特优势，其治疗效果较为明显，补阳还五汤（，）是益气活血的经典方剂切合中风病机，可有效减轻炎症反应，然而其潜在机制尚未完全阐明。本实验在建立大鼠大脑中动脉栓塞（，）模型的基础上，给予 干预，观察对大鼠脑组织海马区的神经细胞损伤以及炎症因子产生的抑制作用，探讨是否通过激活 靶点进而减轻炎症反应，将有助于进一步明确 干预 潜在的病理生理机制，为临床治疗缺血性脑卒中提供更加明确的实验依据。材料 实验动物 级健康雄性 （）大鼠，体质量（），购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：（京），全程均符合学校实验动物伦理标准对动物处理的相关规定进行操作，审查批号：。实验药物中药复方 由黄芪 、当归、赤芍、红花、地龙、桃仁、川芎中国药理学通报 ；（）：七味药组成，购自北京同仁堂药店，上述药物浸泡 后煎煮两次得到水煎液，冷藏备用。特异性抑制剂 由 公司提供，粉末溶于 二甲基亚砜（）聚乙二醇（）双蒸水（）中，现配现用。主要试剂，氯化三苯基四氮唑（）染液（）、苏木精 伊红（）染液（）、免疫组化试剂盒（）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；兔源抗 抗体（）购自 公 司；鼠 源 抗 （）、（）、（）抗体购自 公司；辣根酶标记山羊抗兔 （）、辣根酶标记山羊抗小鼠 （）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；凝胶配制试剂盒（）、蛋白浓度测定试剂盒（）购自 碧 云 天 生 物；化 学 发 光 超 敏 显 色 试 剂 盒（）购自翌圣生物科技股份有限公司。主要仪器大鼠 栓线（北京西浓科技有限公司）；脑切片模具（北京西浓科技有限公司）；型组织包埋机（）、型轮转切片机（）、摊片机（）、正置显微镜（）；电泳仪及半干转膜仪（）；多 功 能 酶 标 仪（）；型制冰 机（）；化学发光成像系统（）。方法 动物模型的建立与实验分组给药模型制备方法参照实验室前期基础 制备大鼠 模型。级 健 康 雄 性 大 鼠 随 机 分 为 假 手 术 组（）、模型组（）、补阳还五汤组（）、补阳还五汤 抑制剂组（）。组大鼠只分离血管不造模，组、组、组大鼠均建立模型缺血 后再灌注 。造模结束后 组、组分别给予 剂量为 ，抑制剂剂量为 。于大鼠术后清醒至再灌注 ，每天灌胃给药次；抑制剂于造模前 开始至再灌注 ，每 腹腔注射给药 次。组和 组同时灌胃给予相同体积的溶剂蒸馏水，组、组和 组同时腹腔注射给予相同体积的 二甲基亚砜（）聚乙二醇（）双蒸水（）混合而成的溶剂作为对照。检测指标 神经功能学评分参照 评分方法的分级标准，于造模结束后 取材前对大鼠的行为学表现进行评定，无明显神经功能缺陷记为 分；提尾倒悬时，瘫痪侧前爪屈曲不能伸展记为 分；行走时，向瘫痪侧转圈记为 分；行走时，向瘫痪侧倾倒记为 分；不能自主行走或意识丧失记为 分。脑组织梗死体积测定神经功能学评分结束后，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，断头取脑。完整脑组织放于专用切片脑槽内，冰箱冰冻 后沿冠状面制备每间隔 的均匀连续大脑切片，完整的转移到染色盒中，染液 恒温培养箱避光染色 ，期间晃动脑切片使其染色均匀。染色完成后 中性福尔马林固定液使其固定，整齐按顺序依次摆放后拍照采图，在 软件上分析各组大鼠脑梗死体积百分率，计算公式为：脑梗死体积 白色脑梗死区体积 红色全脑总体积 。脑组织海马区病理形态结构变化麻醉大鼠迅速断头取出完整大脑，在 中性福尔马林固定液浸泡至少 ，修剪后的组织经过梯度乙醇脱水、浸蜡、石蜡包埋、制备 石蜡切片。染色时经过脱蜡、苏木精和伊红染液染色、脱水、透明、中性树脂封片，显微镜下观察脑组织海马区神经细胞的病理形态结构改变。检测脑组织海马区 、蛋白表达麻醉大鼠迅速断头取出大脑海马组织，放于液氮中保存。检测时取出组织低温匀浆、裂解，离心机离心后取上清液 法测定蛋白浓度，剩余液体加入溴酚蓝高温变性。配制合适浓度的 凝胶，蛋白上样后进行电泳、转膜，抗体（）、抗 体（）、抗 体（）中 冰箱孵育过夜，次日洗膜后相应二抗中室温孵育 ，洗膜后 发光液避光浸染，使用 化学发光成像系统采集图片进行拍照，在 软件上分析目的蛋白与 条带的灰度比值，计算蛋白的相对表达量。免疫组化检测脑组织海马区 、表达石蜡切片脱蜡、复水，柠檬酸抗原修复液中微波炉加热进行抗原修复，洗片后 过氧化氢溶液置于 恒温箱中避光孵育消除内源性过氧化物酶活性，洗片后 室温封闭，（）、（）一抗 冰箱孵育过夜，次日洗片后辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育，洗片后 显色，苏木精染液复染细胞核，脱水、透明、中性树胶中国药理学通报 ；（）封片，显微镜下观察并拍照，在 软件上分析各组大鼠脑组织海马区 、阳性表达量，计算公式为：平均光密度值（，）积分光密度值（，）区域面积（）。统计分析应用 软件进行统计分析，实验中所有数值均采用珋 表示，比较分析方法各组间采用（）单因素方差分析，组间两两比较采用 法，应用 软件绘制统计图。结果 检测神经功能学评分 组大鼠神经功能无异常。与 组相比，组大鼠神经功能学评分明显升高（）；与 组相比，组大鼠神经功能学评分明显降低（）；与 组相比，组大鼠神经功能学评分升高（）（）。染色测定脑组织梗死体积红色区域代表正常脑组织，苍白色区域代表梗死灶区域。与 组相比，组大鼠缺血侧脑组织出现大面积的苍白色梗死灶，脑梗死体积百分比增加（）；与 组相比，组大鼠缺血侧脑组织苍白色梗死灶体积缩小，脑梗死体积百分比降低（）；与 组相比，组大鼠缺血侧脑组织苍白色梗死灶体积增大，脑梗死体积百分比增加（）（）。染色观察脑组织海马区病理形态结构变化 组大鼠脑组织海马区神经细胞圆润、排列整齐，核仁清晰可见，染色质分布均匀。与 组相比，组神经细胞被破坏、萎缩甚至坏死、排列紊乱，核仁破碎，染色质分布不均、淡染；与 组相比，组神经细胞结构松散、损伤减轻、形态较为规整；与 组相比，组神经细胞损伤进一步加重（）。（珋 ，），检测脑组织海马区 、蛋白表达与 组相比，组 表达下降，表达上升（）；与 组相比，组 表达上升、表达下降（）；与 组相比，组 表达下降，表达上升（）（）。免疫组化检测脑组织海马区 、表达棕黄色颗粒为 和 的阳性表达，均位 于细胞胞浆中。与 组相比，组大鼠脑组织海马区 和 阳性表达明显增高（）；与 组相比，组大鼠脑组织海马区 和 阳性表达明显降低（）；与 组相比，组大鼠脑组织海马区 和 阳性表达升高（）（）。（珋 ，），中国药理学通报 ；（）（）（珋 ，）：；：；：；：，（珋 ，）（），中国药理学通报 ；（）讨论缺血性中风（，）具有高发病率、高病死率、高致残率、高复发率的特点成为全球重点防治疾病，危害性极大，给整个社会和患者的家庭带来了沉重负担。在 患者中，主要治疗方法是通过手术治疗和组织型纤溶酶原激活剂静脉溶栓快速重建血液循环，但是在再灌注的过程中会进一步导致恶性损伤称为 。由于一系列病理生理进程产生的相互关联作用机制，除了单独缺血造成的脑损伤，快速再灌注后对大脑造成更加严重的损害不容忽视 。因此，临床治疗急性 的研究方向重点在于如何延缓 的发生与发展。中导致脑损伤的潜在机制包括线粒体失调、氧化应激、血脑屏障的破坏、大脑神经炎症反应、神经细胞凋亡增加等 。炎症反应作为其中的一个主要机制，在损伤发生后早期阶段产生的过度级联反应可导致 的加重，结合抗炎治疗靶点的探索，配合有效干预再灌注早期的发生发展是防治 的关键策略 。细胞因子在 后的大脑中上调，不仅在免疫系统细胞，还可在脑细胞如胶质细胞和神经元细胞中发现 。与 炎症相关的细胞因子有白细胞介素 （，）、白细胞介素 （，）和肿瘤坏死因子 （，）等，通过调节这些炎症细胞因子对 后产生的损伤具有显著影响，临床研究发现，炎症生物标志物水平升高与 发生发展风险之间存在直接关系，促炎细胞因子 、表达程度的增加可以代表炎症反应的提高 。哺乳动物 家族是一种进化上高度保守的蛋白，属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（，）依赖性类组蛋白去乙酰化酶，由 多个成员组成，其中 是第一个被发现，并且研究最广泛和特征最明确，可通过参与各种细胞过程调控细胞功能，如代谢反应和应激反应等，被认为是极有吸引力的治疗 的关键靶标 。越来越多的数据表明，可能参与大脑的稳态调控，通过调节多种机制在 中发挥重要的神经保护作用 。在 后，受到缺血缺氧刺激，导致大脑 的缺失明显，增加了炎症细胞因子的表达，促进炎症反应，加重病理损伤 。中药复方以其辨证论治、药物配伍使用的独特优势，在临床上治疗中风具有显著疗效。著名方剂 药物配方为黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙 味药组成，在清代王清任所著 医林改错 中首次提出，书中论述到“元气亏五成，下剩五成，周流一身，必见气亏诸态，元气归并左右，病半身不遂，不能行于上下，则病两腿瘫痿”，故重用君药黄芪补益元气，亏空的五成元气得以恢复，配以当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙活血祛瘀通络 。及其主要单药黄芪中有效活性成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮，可延缓、减轻 后过度激活的炎症反应产生的损伤，对短暂性 具有神经保护作用 。为了进一步探究 对 的保护作用机制，我们利用大鼠 模型缺血 再灌注 模拟 。发现 可以改善大鼠 后的神经功能损伤情况、减少脑梗死体积，减轻大鼠脑组织海马区病理损伤，有效发挥神经保护作用。抑制海马区炎症因子 、的过度产生，对 后早期炎症反应产生的损伤发挥抑制作用。通过 抑制剂 干预，利用其独特的 依赖的去乙酰化机制，改变支持其催化相关性的酶构象，可有效抑制 的酶活性。发现 抑制炎症的具体作用机制可能与调节海马区关键靶点 蛋白的激活相关。本研究仅从 调节炎症因子的角度初步探讨了 对 发生发展的影响，其发挥治疗炎症反应的免疫机制仍需进一步研究。参考文献：，（）：，：，（）：李媛，靳晓飞，周晓红，等 黄芪甲苷对脑缺血 再灌注损伤大鼠细胞自噬的影响 中国病理生理杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：中国药理学通报 ；（），：，（）：，（）：，：，：，（）：谭凌菁，王金凤，梅志刚 沉默信息调节因子 信号通路在脑缺血再灌注损伤中的保护作用 中国脑血管病杂志，（）：，（）：，：，（）：孟瑶，李文志 蛋白调节缺血性脑卒中后免疫功能的研究进展 中国免疫学杂志，（）：，（）：陈大舜，周德生 临床医论及医案之二 中风 湖南中医药大学学报，（）：，：（），（）：田倩倩，刘建春，王晓庆，等 补阳还五汤抗炎作用研究进展 中华中医药学刊，（）：，（）：，：陈雨菡，石小鹏，马善波，等 黄芪中毛蕊异黄酮的脑保护作用研究进展 中国急救医学，（）：，（）：，（，；，）：（）（），（），（），（）；，（）；（）；，；，（）；，（），（）；（）；中国药理学通报 ；（）（）；，（），（）；（）；（）；，（）：；网络出版时间：网络出版地址：实验方法学一种 受体激动剂高通量筛选细胞模型王芮，杨紫鑫，柯志强，成细瑶，苏正定（湖北工业大学工业发酵省部共建协同创新中心，湖北 武汉 ；湖北科技学院咸宁医学院，糖尿病与心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 ；广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 ）：文献标志码：文章编号：（）中国图书分类号：；摘要：目的构建 受体激动剂高通量筛选细胞模型。方法构建 重组质粒，转染 细胞，用 和流式细胞仪进行筛选。所构建的细胞系命名为 细胞系。和激光共聚焦检测 蛋白的表达。将环磷酸腺苷（，）响应元件报告基因转染 细胞，不同浓度的 刺激后，用一步法荧光素酶报告基因检测试剂盒检测发光值反映细胞 水平，采用 试剂盒（）进行验证。结果成功构建 细胞系。不同浓度 刺激后，发光值变化趋势与细胞 水平变化趋势相似。本实验中 因子的值为 。结论本研究建立了基于重组 细胞株，其可用于 受体激动剂高通量筛选。收稿日期：，修回日期：基金项目：湖北省教育厅科学研究计划指导性项目（）作者简介：王芮（），女，硕士生，研究方向：细胞信号传导机制和结构生物学、糖尿病和癌症靶向药物设计及甾体生物转化新技术，：；柯志强（），男，博士生，讲师，研究方向：糖尿病心脑血管病变药理，通信作者，：；苏正定（），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：细胞信号传导机制和结构生物学、糖尿病和癌症靶向药物设计及甾体生物转化新技术，通信作者，：关键词：型糖尿病；受体激动剂；小分子 受体激动剂；响应元件；荧光素酶报告基因；因子开放科学（资源服务）标识码（）：型糖尿病影响全球 亿多人，糖尿病特异性并发症（视网膜病变、肾病和神经病变等）以及心血管疾病风险导致沉重的经济负担 。选择 型糖尿病治疗药物时，同时需要考虑药物的心血管获益 。多种胰高血糖素样肽 （，）类似物亦称为 受体激动剂（艾塞那肽、索马鲁肽、度拉糖肽和利拉鲁肽等）已被批准用于治疗 型糖尿病，临床试验表明，类似物可降低心血管事件风险 。尽管 类似物治疗 型糖尿病取得成功，但是，它们分子量大，制备和保存困难，且容易降解，大部分 类似物需皮下注射等方面因素都限制其临床应用 。索马鲁肽口服剂型于 年获批用于治疗 型糖尿病 ，然而，口服索马鲁肽生物利用度低，并且出现恶心和呕吐等胃肠道症状的概率高于其他 类似物。因此，另一种 受体激动剂即非肽类小分子药物引起研究人员的关注，小分子 受体激动剂可以口服给药，并可以减少 类似物的副作用。尽管经过不断地探索，市场上仍然没有靶向 受体的小分子非肽类药物，目前只有 种化合物（、和 ）进入临床前或临床试验 。天然化合物一直是最丰富的药物资源，其往往是发现新的更有效、更安全或更具选择性治疗分子的起点 。高通量药物筛选是目前最流行的药物发现系统，本研究拟构建中国药理学通报 ；（）：