TMEM39A在原发性胆汁性胆管炎中的作用机制.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17TMEM39A在原发性胆汁性胆管炎中的作用机制孙晓彤1 韩崇旭1，2 王婵1 任传利2 张明明31扬州大学医学院（江苏扬州 225009）；2扬州大学临床医学院，江苏省苏北人民医院医学检验科（江苏扬州225009）；3东南大学生命科学与技术学院发育基因与人类疾病重点实验室（南京 210096）【摘要】目的探讨TMEM39A在原发性胆汁性胆管炎中的作用机制。方法为研究TMEM39A在原发性胆汁性胆管炎中如何调节自噬的表达，选用人肝胆管癌细胞RBE来进行研究。并用疏水性胆汁酸甘氨鹅脱氧胆酸（GCDC）处理人肝胆管癌细胞RBE分为3组：control组、500 mol/L组和1 000 mol/L 组。细胞计数试剂盒（CCK-8）、细胞克隆、细胞划痕和 Hoechst 染色实验检测细胞活力、增殖、伤口愈合率和凋亡。qPCR 检测细胞中 TMEM39A mRNA 表达量；Western blot 检测 TMEM39A 和 LC3 的蛋白表达量。结果与control 组相比较，1 000 mol/L 组的细胞活力、增殖和伤口愈合率降低，细胞凋亡现象最明显。在构建的原发性胆汁性胆管炎的模型中，过表达 TMEM39A 会促进 LC3 的表达。结论TMEM39A 的表达增高引起胆管细胞自噬增强使胆管受损，可能是引起原发性胆汁性胆管炎的机制之一。【关键词】TMEM39A；原发性胆汁性胆管炎；人肝胆管癌细胞；微管相关蛋白3；甘氨鹅脱氧胆酸【中图分类号】R575.7Preliminary study on the mechanism of TMEM39A in primary biliary cholangitis SUN Xiaotong*，HAN Chongxu，WANG Chan，REN Chuanli，ZHANG Mingming.*Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225009，China Corresponding author：HAN Chongxu Email：【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of TMEM39A in primary biliary cholangitis.MethodIn order to study how TMEM39A regulates the expression of autophagy in primary biliary cholangitis，human hepatobiliary cancer cell RBE was selected for study.Human hepatobiliary cancer cells were treated with the hydrophobic bile acid glycine deoxycholic acid（GCDC）into three groups：control group，500 mol/L group and 1 000 mol/L group.Cell counting kits（CCK-8），cell cloning，cell scratching，and Hoechst staining assays were used to detect cell viability，proliferation，wound healing rates，and apoptosis.qPCR detected TMEM39A mRNA expression in cells；Western Blot detects protein expression of TMEM39A and LC3.ResultsCompared with control group，cell viability，proliferation and wound healing rate were decreased in 1 000 mol/L group，while apoptosis was the most obvious.In the constructed model of primary biliary cholangitis，overexpression of TMEM39A promoted LC3 expression.Conclusion The increased expression of TMEM39A leads to enhanced autophagy of bile duct cells and bile duct damage，which may be one of the mechanisms causing primary biliary cholangitis.【Key words】TMEM39A；primary biliary cholangitis；human hepatobiliary duct cancer cells；LC3；glycochenodeoxycholic acid原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是由先天和后天免疫同时介导，并由单核细胞浸润胆管细胞，破坏小叶间胆管，导致胆汁淤积，使胆管细胞长时间处于胆汁淤积环境，从而致胆管细胞变性和坏死的疾病1-3。PBC在男女之间的患病率具有差异性，患者多为中老年妇女，男女比例为10 14。PBC目前尚无最优的治疗方法。目前治疗PBC的药物首选是熊去氧胆酸，若熊去氧胆酸治疗效果甚微，就可用二线药物奥贝胆酸进行治疗5-6，但无治愈作用。若患者合并其他疾病，无法选择肝移植手术，还可进行人工肝支持系统和血浆置换治疗7。因此研究其发病机制寻找新的治疗方法具有重要的社会意义。PBC是起源于胆管的炎症。由于胆汁分泌及排泄障碍可导致胆汁淤积，而肝脏长期处于胆汁淤积状态可导致肝脏的纤维化和肝硬化。胆汁酸（bile acids，BAs）是胆汁的主要成分，对胆管细胞基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.17.005基金项目：国家重点基础项目研究发展计划（973计划）子课题基金（编号：2015CB755402）通信作者：韩崇旭 E-mail：2176实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17具有细胞毒性作用。在胆汁淤积状态下，胆管细胞长期暴露在具有细胞毒性的胆汁酸中，血清胆汁酸水平继而升高。疏水性胆汁酸甘氨鹅脱氧 胆 酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDC）是 胆汁淤积性肝病患者血清中主要的胆汁酸，因此大多数研究都采用 GCDC 来诱导细胞凋亡作为研究模型。TMEM39A是TMEM家族中的一员，其蛋白序列由 488 个氨基酸和 8 个跨膜螺旋片段组成8。现已发现TMEM39A的分子功能与自噬相关9，遗传学研究10表明，TMEM39A基因与原发性胆汁性胆管炎相关。又有研究进一步对PBC患者和其他自身免疫性疾病分析发现，TMEM39A在PBC患者的血液中高表达，并显著高于其他自身免疫性疾病（系统性红斑狼疮和桥本氏病）和健康对照组体内表达，并且TMEM39A浓度越高，其肝功能越差，预后越差。且已有研究11报道称，在早期和晚期PBC受损的胆管中自噬相关蛋白即微管相关蛋白3（LC3）的表达增高。这表明 TMEM39A 水平异常在PBC发病机制中扮演着重要作用。本研究拟模拟PBC胆管细胞模型，对TMEM39A在PBC中的作用机制做初步探索，旨在为PBC的靶向治疗提供新的策略。1材料与方法1.1细胞系培养人肝胆管癌细胞（RBE），由东南大学刘向东教授馈赠，细胞用 10%FBS RPMI-1640培养基培养，放在5%CO2、37 及饱和湿度的恒温培养箱培养。1.2试剂RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自北京全式金生物，BCA蛋白定量试剂盒、质粒小提试剂盒、细胞计数试剂盒（CCK-8）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Hoechst 染色试剂盒、结晶紫染色液购自上海碧云天生物科技有限公司，兔抗人 TMEM39A 多克隆抗体购自 Abnova 公司，兔抗人 LC3 多克隆抗体购自 Proteintech 公司，GCDC、4%多聚甲醛购自Sigma-Aldrich公司，RNA转染试剂RNA Fit购自汉恒生物科技有限公司。1.3实验方法1.3.1细胞活力检测使用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞活力。将RBE细胞以每孔2 103个细胞接种于 96 孔板中。设置 control 组、GCDC（500 mol/L 和 1 000 mol/L）组，三组处理同时培养 24、48、72 h 和 96 h。培养至第 6 天，将新的培养基（不含GCDC）90 L和10 L CCK-8加入到孔中，在培养箱中避光孵育2 h，使用酶标仪（Biotek）在450 nm处读吸光值。1.3.2细胞克隆形成实验使用结晶紫染色液染色观察细胞克隆形成。将RBE细胞以每孔1 000个细胞接种于 6 孔板中，设置 PBS 组和 GCDC 组，每天观察细胞生长状态，每三天更换一次培养基，培养10 d。使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色液染色观察。1.3.3细胞划痕实验提前在 6 孔板背面划线，将 RBE 细胞以每孔 2 106个细胞接种于 6 孔板中，设置 PBS 组和 GCDC 组，培养 24 h 后，加入含有PBS和不同浓度的GCDC的培养基，用细胞微孔成像系统（Biotek）拍照，计为 0 h，24 h 后再拍照，计为24 h。比较0、24 h划痕愈合程度。1.3.4Hoechst染色实验使用Hoechst染色观察RBE 细胞凋亡。RBE 细胞以 1 105个细胞/孔接种于12孔板中，培养24 h后，加入含有PBS和不同浓度的 GCDC 的培养基，继续培养 24 h 后，使用Hoechst染色，在倒置显微镜下观察细胞凋亡。1.3.5构建TMEM39A过表达载体通过设计合成的 TMEM39A 引物，上游引物（TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGCCCGGTGGAAGGAGG），下游引物（TTATCTAGATCCGGTGGATCCGTTTGCCTTGAGTTCATAACTGTTG）扩增 TMEM39A 基因。将质粒pEGFP-C1和TMEM39A经过双酶切、同源重组、转化进大肠杆菌，在含有Kan抗性的LB固体平板上挑取单克隆，扩大培养12 16 h，提取重组pEGFP-C1-TMEM39A 质粒，并经双酶切和测序验证重组质粒。1.3.6合成 siRNA 及阴性对照将 TMEM39A 基因（Gene ID：55254）提交至汉恒生物公司，由其设计和合成3对siRNA，同时合成了一对通用阴性对照（Negative Control siRNA，si-NC），将 siRNA 转染到RBE细胞48 h。1.3.7蛋白免疫印迹实验重组pEGFP-C1-TMEM-39A质粒和si-TMEM39A及si-NC转染进原发性胆汁性胆管炎的模型（用1 000 mol/L GCDC处理24 h的RBE 细胞）中48 h后，用1 PBS 洗涤1 2次，每孔加入50 L的细胞裂解液，置于冰上20 min，每隔5 min涡旋10 s，低温离心机离心12 000 r/min，15 min，吸取上清，利用BCA蛋白定量试剂盒定量，加入适量的5 SDS loading 蛋白上样缓冲液。用12%的SDS-PAGE的分离胶进行电泳（条件：80 V，30 min；120 V，60 min），电泳结束后，将蛋白电转至PVDF膜上（条件：260 mA，60 min），用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，再用1%BSA将TMEM39A抗体和LC3抗体分别稀释500和2 000倍后于室温下孵育2 h，TBST清洗PVDF膜4次，每次5 min，再以抗兔IgG二抗（1 10 000）于室温下孵育1 h，用TBST2177实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17清洗 PVDF 膜 6 次，每次 5 min，使用适量的高敏型 ECL 发光液，使用生物分子成像仪曝光，利用Image J软件进行灰度值分析。1.3.8实时荧光定量 PCR使用 Trizol 试剂提取RBE 细胞中的总 RNA，通过 HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒逆转录合成cDNA，Actin 作为内参，每个样品设置3个重复孔，引物由南京金斯瑞和生工生物工程（上海）股份有限公司合成，数据处理根据 2-Ct为目标基因在实验组和对照组的差异倍数。1.3.9统计学方法所有实验均重复 3 次以上，使用 GraphPad Prism7.0 软件进行统计学分析，数据均以均数标准差表示。两组组间数据比较采用非配对t检验，P 0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1TMEM39A在原发性胆汁性胆管炎中的发现及其表达本课题组前期协助完成对 2 069 例汉族 PBC 样品和 6 163 例对照样品的 GWAS 扫描和验证试验，证实TMEM39A（rs3732421）位点达到了GWAS显著性，见图1A。（rs3732421数据库原定位于CD80，现已更正为 TMEM39A，见 https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？term=rs3732421）。通过本课题组前期研究，发现通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测 PBC 患者和健康对照组的血液标本中的 TMEM39A 外周血浓度。发现 PBC 组中的TMEM39A的浓度要高于对照组，见图1B，差异有统计学意义（P 0.05）。2.2GCDC 对 RBE 细胞活力的影响为了研究GCDC 对 RBE 细胞活力的影响，利用不同浓度的GCDC（500、1 000 mol/L）处理 RBE 细胞，处理时间为24、48、72、96 h。结果表明，随着GCDC处理时间的延长，细胞活力逐渐降低，且GCDC浓度升高，细胞活力降低，见图2。差异具有统计学意义（P 0.05）。2.3GCDC对RBE细胞增殖的影响利用细胞克隆和细胞划痕检测GCDC对RBE细胞增殖的影响，分别用PBS和GCDC（500、1 000 mol/L）处理 RBE细胞。结果显示，GCDC浓度越高，GCDC对RBE细胞的抑制作用越明显，细胞克隆数越少，见图3A。细胞划痕实验显示，GCDC 浓度越高，细胞愈合率下降，1 000 mol/L的GCDC处理的RBE细胞愈合率降低最显著，见图3B。差异具有统计学意义（P 0.05）。2.4GCDC 对RBE 细胞凋亡的影响Hoechst 染色观察细胞凋亡，结果显示，在GCDC浓度为1 000 mol/L时，细胞凋亡指数最高，见图4。差异具有统计学意义（P 0.05）。2.5成功构建 TMEM39A 过表达载体为研究TMEM39A 在原发性胆汁性胆管炎中如何调节自噬，通过PCR成功扩增出TMEM39A全基因组序列，并与 pEGFP-C1 质粒构建融合表达质粒 pEGFP-C1-TMEM39A，并将重组质粒成功转化和提取，通P 0.001对照组PBC组50403020100TMEM39A浓度（ng/L）AB注：A，GWAS研究发现TMEM39A是原发性胆汁性胆管炎的易感位点；B，健康对照组和PBC患者外周血TMEM39A浓度图1在原发性胆汁性胆管炎中发现了TMEM39AFig.1The TMEM39A gene has been identified in primary biliary cholangitis.500 mol/L1 000 mol/L024 48 72 96120时间（h）1.51.00.50.0*cell viability（%）图2GCDC对RBE细胞细胞活力的影响Fig.2Effect of GCDC on cell viability of RBE cells2178实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17过双酶切验证和测序验证重组成功，见图 5A，并通过实时荧光定量PCR确定重组质粒转染时间为48 h，见图5B。差异具有统计学意义（P 0.05）。2.6干扰片段的筛选由公司合成的3对TMEM39A干扰片段和1对阴性对照，将siRNA转染至RBE细胞中，通过Western blot和实时荧光定量PCR，筛选到1对siRNA的敲降趋势更明显，见图6。差异具有统计学意义（P 0.05）。2.7TMEM39A对原发性胆汁性胆管炎中自噬蛋白表达的影响在体外根据前文所述实验结果，1 000 mol/L GCDC 浓度处理 RBE 细胞，其凋亡指数更高；同时使用 1 000 mol/L GCDC 浓度作用细胞后，观察细胞增殖率最佳时间为 24 h。所以在体外利用 1 000 mol/L 的 GCDC 浓度来处理1 000 mol/L GCDC500 mol/L GCDCPBS*250200150100500Colony numbers1 000 mol/L500 mol/LGCDC组PBS组PBS组GCDC组1 000 mol/L500 mol/L0 h24 h1 000 mol/L GCDC500 mol/L GCDCPBS*543210Wound healing rate（%）AB注：A，不同浓度的GCDC对RBE细胞细胞克隆形成的影响；B，不同浓度的GCDC对RBE细胞细胞迁移能力的影响图3不同浓度的GCDC对RBE细胞细胞克隆形成和愈合的影响Fig.3Effects of different concentrations of GCDC on cell clonal formation and healing in RBE cells1 000 mol/L GCDC500 mol/L GCDCPBS*2520151050Apoptosis cell numbers1 000 mol/L500 mol/LGCDC组PBS组注：每个标本观察5个视野，每个视野观察100个细胞核，其中凋亡指数为凋亡细胞在观测细胞中所占的百分比图4不同浓度的GCDC诱导RBE细胞发生细胞凋亡Fig.4Different concentrations of GCDC induced apoptosis in RBE cells2179实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17细胞 24 h，构建原发性胆汁性胆管炎模型，转染TMEM39A 过表达载体和 TMEM39A 干扰片段，检 测自噬蛋白 LC3 的蛋白表达水平。结果表明，过表达 TMEM39A 会促进自噬蛋白 LC3 的蛋白表达量，敲降 TMEM39A 会降低自噬蛋白 LC3的蛋白表达量，见图 7，差异具有统计学意义（P 0.05）。3讨论PBC 是由免疫介导的胆汁淤积性疾病，会进行性破坏胆管上皮细胞，最终导致肝硬化和肝衰竭，其临床症状多为乏力、瘙痒等，隐匿性强12。遗传易感性被认为是PBC发展的主要因素之一13。原发性胆汁性胆管炎是胆管细胞浸润在胆汁酸中，胆汁酸对胆管细胞具有细胞毒性作用。胆汁酸的合成是由胆固醇通过经典和替代途径进行的，并且由肝细胞分泌胆汁酸合成所需要的所有酶14，而人体主要的胆汁酸包括胆酸和鹅去氧胆酸，初级鹅去氧胆酸和胆酸是在肝脏中通过多级酶的作用完成的15-16。而现在大多数PBC的研究是基于胆管细胞浸润在胆汁酸中，其中经常使用的胆汁酸，即是甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC），它是胆汁中的主要胆盐成分。在本研究中，即是选用GCDC来处理胆管细胞，用于模拟原发性胆汁性胆管炎中的胆管上皮细胞在胆汁淤积的情况。通过pEGFPC1TMEM39ApEGFPC1pEGFPC1*86420TMEM39A mRNA Relative levelsM 1 25 000 bp3 000 bp2 000 bpAB注：A，双酶切验证结果，M：DL5000 DNA marker，1：空载体，2：过表达载体；B，转染空载体和过表达载体24、48 h和72 h后细胞内TMEM39A的表达量图5基因TMEM39A过表达载体的构建Fig.5Construction of overexpression vector of gene TMEM39AsiNCsi1si1si3siNCsi1si1si3*1.51.00.50.0Relative TEMEM39A mRNA levelsTEMEM39AGAPDH图6转染干扰片段后TMEM39A的表达量Fig.6The expression of TMEM39A after transfection ofinterference fragmentpEGFPC1TMEM39ApEGFPC1GCDCTMEM39ALC3GAPDH+-+-+-+-+siTMEM39AsiNCGCDC+-+-+-+-+TMEM39ALC3GAPDHpEGFPC1TMEM39ApEGFPC1GCDC+-+-+-+-+*1.51.00.50.0Relative protein expression ofLC3（LC3/GAPDH）+-+-+-+-+*1.00.80.60.40.20.0Relative protein expression ofTMEM39A（TMEM39A/GAPDH）*+-+-+-+-+siTMEM39AsiNCGCDC+-+-+-+-+siTMEM39AsiNCGCDCRelative protein expression ofLC3（LC3/GAPDH）1.51.00.50.0AB0.40.30.20.10.0Relative protein expression ofTMEM39A（TMEM39A/GAPDH）pEGFPC1TMEM39ApEGFPC1GCDC注：A，GCDC处理的细胞过表达TMEM39A促进自噬蛋白LC3表达；B，GCDC处理的细胞敲降TMEM39A降低自噬蛋白LC3表达图7TMEM39A对原发性胆汁性胆管炎中自噬蛋白表达的影响Fig.7Effect of TMEM39A on autophagy protein expression in primary biliary cholangitis2180实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17不同的实验方法来检测不同GCDC浓度和处理人胆管细胞的最佳时间。最后选择了GCDC浓度为1 000 mol/L 和处理时间为24 h来作为后续处理细胞的条件。已有研究17发现，血清中的胆汁酸浓度在体内一般不会直接引起细胞毒性作用。相比之下，1 000 mol/L的GCDC浓度存在广泛的细胞毒性作用，代表了体内的胆道水平。胆汁酸的积累会使肝损伤，从而引发一系列的其他的全身症状，胆汁酸流量减少会引起胆汁淤积患者的自噬18。自噬是可以降解潜在毒性的细胞结构的保守的分解代谢过程19，自噬的失调会导致严重的人体病理18。现在越来越多的证明表明，自噬的失调参与了PBC的发病机制。参与慢性非化脓性破坏性胆管炎（CNSDC）的受损胆管细胞显示自噬标志物LC3和p62/SQSTM1的积累。LC3在PBC受损的胆管细胞中具有特征性表达20，并且自噬体的增加是由于自噬受损所致。有研究表明，GCDC会导致胆管细胞发生自噬引起自噬失调，而发生自噬的原因尚不明确，但自噬在生理上可控制内质网动力学，从而可能引起内质网应激，并且在研究中表明在PBC的胆管细胞中可见到内质网应激标记物PDI和GRP78的广泛性表达 21。TMEM39A 是跨膜蛋白家族的蛋白，它的编码序列具有保守型，它的单核苷酸多态性与主要人类疾病相关22。有全基因组关联研究确定了TMEM39A中的单核苷酸多态性（SNPs）与原发性胆汁性胆管炎（PBC）的风险增加相关10。TMEM39A定位于内质网上，且它的的分子功能与自噬相关9。在本次研究中，构建了 TMEM39A 过表达载体和TMEM39A干扰片段，利用RBE细胞作为研究对象，通过转染TMEM39A过表达载体和干扰片段，观察到在RBE细胞中，TMEM39A过表达会促进自噬蛋白LC3的表达。随后，又用GCDC处理RBE细胞，模拟胆汁淤积，再转染 TMEM39A 过表达载体和干扰片段，发现在胆汁淤积的环境下，TMEM39A仍会促进自噬蛋白 LC3 的表达。但是，本研究仍存在很多局限性，因实验条件的限制，未能在在原代胆管上皮细胞中，进行以上一系列实验的研究。综上所述，疏水性胆汁酸 GCDC 会诱导人胆管细胞凋亡，模拟胆汁淤积。TMEM39A的表达增高引起胆管细胞自噬增强使胆管受损，可能是引起PBC的机制之一。【Author contributions】SUN Xiaotong performed the experiments and wrote the article.WANG Chan，ZHANG Mingming and SUN Xiaotong designed the study.HAN Chongxu and REN Chuanli reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 PRIETO J，BANALES J M，MEDINA J F.Primary biliary cholangitis：pathogenic mechanisms J.Curr Opin Gastroenterol，2021，37（2）：91-98.2 TANAKA A.Current understanding of primary biliary cholangitis J.Clin Mol Hepatol，2021，27（1）：1-21.3 LEUNG K K，DEEB M，HIRSCHFIELD G M.Review article：pathophysiology and management of primary biliary cholangitis J.Aliment Pharmacol Ther，2020，52（7）：1150-1164.4 TANAKA A，LEUNG P S C，GERSHWIN M E.Evolution of our understanding of PBC J.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2018，34-35：3-9.5 CHASCSA D M H，LINDOR K D.Emerging therapies for PBC J.J Gastroenterol，2020，55（3）：261-272.6 PHAW N A，DYSON J K，JONES D.Emerging drugs for the treatment of primary biliary cholangitis J.Expert Opin Emerg Drugs，2020，25（2）：101-112.7 党富涛，唐谭绪，徐加敏.原发性胆汁性胆管炎患者中人工肝支持系统的应用 J.实用医学杂志，2020，36（22）：3153-3156.8 TRAN Q，PARK J，LEE H，et al.TMEM39A and Human Diseases：A Brief Review J.Toxicol Res，2017，33（3）：205-209.9 MIAO G，ZHANG Y，CHEN D，et al.The ER-Localized Transmembrane Protein TMEM39A/SUSR2 Regulates Autophagy by Controlling the Trafficking of the PtdIns（4）P Phosphatase SAC1 J.Mol Cell，2020，77（3）：618-632.e615.10QIU F，TANG R，ZUO X，et al.A genome-wide association study identifies six novel risk loci for primary biliary cholangitis J.Nat Commun，2017，8：14828.11SASAKI M，MIYAKOSHI M，SATO Y，et al.Autophagy may precede cellular senescence of bile ductular cells in ductular reaction in primary biliary cirrhosis J.Dig Dis Sci，2012，57（3）：660-666.12LI H，GUAN Y，HAN C，et al.The pathogenesis，models and therapeutic advances of primary biliary cholangitis J.Biomed Pharmacother，2021，140：111754.13TANAKA A，LEUNG P S C，GERSHWIN M E.The genetics of primary biliary cholangitis J.Curr Opin Gastroenterol，2019，35（2）：93-98.14ASEEM S O，HYLEMON P B，ZHOU H.Bile Acids and Biliary Fibrosis J.Cells，2023，12（5）：792.15HOFMANN A F，HAGEY L R，KRASOWSKI M D.Bile salts of vertebrates：structural variation and possible evolutionary significance J.J Lipid Res，2010，51（2）：226-246.16CHIANG J Y L，FERRELL J M.Bile Acids as Metabolic Regulators and Nutrient Sensors J.Annu Rev Nutr，2019，39：175-200.17WOOLBRIGHT B L，DORKO K，ANTOINE D J，et al.Bile acid-induced necrosis in primary human hepatocytes and in patients with obstructive cholestasis J.Toxicol Appl Pharmacol，2015，283（3）：168-177.18KLIONSKY D J，PETRONI G，AMARAVADI R K，et al.Au2181实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17tophagy in major human diseases J.Embo J，2021，40（19）：e108863.19PANZITT K，FICKERT P，WAGNER M.Regulation of autophagy by bile acids and in cholestasis-CholestoPHAGY or CholeSTOPagy J.Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2021，1867（2）：166017.20SASAKI M，MIYAKOSHI M，SATO Y，et al.Autophagy mediates the process of cellular senescence characterizing bile duct damages in primary biliary cirrhosis J.Lab Invest，2010，90（6）：835-843.21SASAKI M，NAKANUMA Y.Bile Acids and Deregulated Cholangiocyte Autophagy in Primary Biliary Cholangitis J.Dig Dis，2017，35（3）：210-216.22LUO S，WANG X，BAI M，et al.The conserved autoimmune-disease risk gene TMEM39A regulates lysosome dynamics J.Proc Natl Acad Sci U S A，2021，118（6）：e2011379118.（收稿：2023-03-27 编辑：黄月薪）bacterium nucleatum-infected colorectal cancer cells facilitate tumour metastasis by selectively carrying miR-1246/92b-3p/27a-3p and CXCL16 J.Gut，2021，70（8）：1507-1519.19REYES L.Porphyromonas gingivalisJ.Trends Microbiol，2021，29（4）：376-377.20DURAIVELAN K，SAMANTA D.Emerging roles of the nectin family of cell adhesion molecules in tumour-associated pathwaysJ.Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2021，1876（2）：188589.21LIN X，ZHUANG S，CHEN X，et al.lncRNA ITGB8-AS1 functions as a ceRNA to promote colorectal cancer growth and migration through integrin-mediated focal adhesion signalingJ.Mol Ther，2022，30（2）：688-702.22JAILLON S，BONAVITA E，GARLANDA C，et al.Interplay between Myeloid Cells and Humoral Innate Immunity J.Microbiol Spectr，2016，4（6）.PMID：28087941 Review.23丁晓敏，胡海燕.骨肉瘤组织中巨噬细胞炎性蛋白4的表达及其与肺转移的相关性 J.实用医学杂志，2019，35（22）：3513-3516.24刘娜，张长庚，李伟，等.趋化因子干扰素诱导蛋白-10和巨噬细胞炎性蛋白-3a在肝癌患者外周血中的表达及诊断价值J.实用医学杂志，2019，35（16）：2641-2644.25PAUL S，GHOSH S，KUMAR S.Tumor glycolysis，an essential sweet tooth of tumor cellsJ.Semin Cancer Biol，2022，86（Pt 3）：1216-1230.26FUKUSHI A，KIM H D，CH