吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响.pdf
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1、 四川动物 Sichuan Journal of Zoology 2023,42(6):609-617吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响李舒泓,陈天赐,赵永鹏,李呈浩,梁植,郭慧*(广东海洋大学水产学院,湛江市海洋生态与养殖环境重点实验室,广东湛江524025)摘要:目的研究吡啶硫酮铜(CuPT)对凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei肝胰腺能量利用、脂质过氧化相关指标和抗氧化、凋亡相关基因表达量的影响。方法设置空白对照组、DMSO溶剂对照组(0.128 mL L1)和2个CuPT处理组(64 g L1和128 g L1),每组3个平行,在2
2、00 L水体中暴露48 h,分别于胁迫0 h、3 h、12 h、24 h和48 h取肝胰腺进行测定。结果随着CuPT暴露浓度的增加及胁迫时间的延长,凡纳滨对虾肝胰腺中的糖原、乳酸含量显著下降(P0.05),丙二醛含量显著升高(P0.05);锰超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因、过氧化氢酶基因和凋亡相关基因半胱氨酸蛋白酶 3基因和肿瘤抑制基因的表达水平也发生了显著变化(P0.05)。结论CuPT可能影响凡纳滨对虾正常能量供应,并使机体出现脂质过氧化,还会影响机体内抗氧化应激以及凋亡相关基因的表达水平。关键词:吡啶硫酮铜;凡纳滨对虾;肝胰腺;能量利用;脂质过氧化;基因表达中图分类号:Q95
3、9.223+.63;S917.4 文献标志码:A 文章编号:1000-7083(2023)06-0609-09Effects of Copper Pyrithione on Energy Utilization,Lipid Peroxidation andGene Expression in the Hepatopancreas of Litopenaeus vannameiLI Shuhong,CHEN Tianci,ZHAO Yongpeng,LI Chenghao,LIANG Zhi,GUO Hui*(Key Laboratory of Marine Ecology and Aquacu
4、lture Environment of Zhanjiang,College of Fisheries,Guangdong Ocean University,Zhanjiang,Guangdong Province 524025,China)Abstract:ObjectiveThe effects of copper pyrithione(CuPT)on hepatopancreas energy utilization,lipid peroxidation-related indexes,and the expression of antioxidant and apoptosis-rel
5、ated genes in Litopenaeus vannamei were studied.MethodsL.vannamei grew in 200 L water containing DMSO(0.128 mL L1),64 g L1 or 128 g L1 of CuPT for 48 h.The hepatopancreaswere obtained at 0 h,3 h,12 h,24 h,and 48 h after exposure,respectively.ResultsWith the increase of concentration of CuPT and the
6、exposure time,the contents of glycogen and lactic acid decreased significantly(P0.05)compared to the control group,while the content of malondialdehyde increased significantly(P0.05).At the same time,the expression levels of antioxidant-encoding genes MnSOD,GPx and CAT,and apoptosis-related genes ca
7、spase3 and p53 changed significantly(P0.05).ConclusionCuPT may disrupt the normal energy supply and cause lipid peroxidation of L.vannamei,and also affects the expression levels of antioxidant stress and apoptosis-related genes.DOI:10.11984/j.issn.1000-7083.20220348收稿日期:2022-09-29 接受日期:2023-04-25作者简
8、介:李舒泓(1998),女,硕士研究生,研究方向:水产动物健康养殖,E-mail:*通信作者Corresponding author,副教授,研究方向:水产动物健康养殖生态学,E-mail:609四川动物 2023 年 第 42 卷 第 6 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.6 2023Keywords:copper pyrithione(CuPT);Litopenaeus vannamei;hepatopancreas;energy utilization;lipid peroxidation;gene expression近年来,随着人们对海洋资源
9、开发力度的不断加大,生物污损的危害日渐突出,海洋防污问题也越来越严峻。海洋防污剂通常被添加到船舶及其他海洋设备的涂料中以减少生物黏附、防止腐蚀(Qian et al.,2013)。但防污涂料中使用的很多防污剂都具有不同程度的生态毒性,如三丁基锡因对海洋生态环境具有严重的影响已于2008年在全球范围内被禁止用作防污剂成分(汝少国,李雪富,2017)。新型防污剂吡啶硫酮铜(copper pyrithione,CuPT)因具有高效、易降解的特点而被广泛应用(Almond&Trombetta,2017),2014 年全球以CuPT 为主要成分的防污剂占有的市场份额超过50%(Ciriminna et
10、al.,2015)。起初,CuPT被认为是非持久性的化合物,因其在海水中的直接光照条件下能够快速地被光降解形成毒性较低的化合物。然而,在光照有限的地方,如在游艇码头和港口背光处的水体或浑浊度较高的水体中,则容易发生积累(Maraldo&Dahllf,2004;Turley et al.,2005)。目前,已经在日本太平洋海岸和越南中北部沿海海域的沉积物中检测到 CuPT 的存在(Harino et al.,2006,2007)。此外,Gnal等(2022)报道在污水处理厂的废水中可检测到 CuPT的浓度为10260 ng L1。随着CuPT的广泛使用,其对水生生物的毒性影响也开始引起人们的关注
11、。汝少国和李雪富(2017)的研究显示,CuPT对藻类、多毛类、软体动物、鱼类、甲壳类等生物均具有较高的生态毒性。以鱼类为例,CuPT可导致底鳉Fundulus heteroclitus幼鱼的畸形和侧肌炎症团块的形成(Mochida et al.,2008);可引起斑马鱼Danio rerio胚胎形态学异常、凋亡增加和抗氧化能力降低(Almond&Trombetta,2017);可引起斑马鱼组织损伤(Gnal et al.,2022)和褐牙鲆Paralichthys olivaceus胚胎发育畸形(Shin et al.,2022)。在软体动物中,CuPT暴露导致一种贻贝Unio crassu
12、s血细胞总数发生显著变化,总蛋白在暴露7 d后显著下降(Tekov et al.,2020)。在甲壳类动物中,CuPT可导致凶猛片钩虾Elasmopus rapax的RNA/DNA比率显著降低(Vivien et al.,2012)。然而,生物体对环境污染物的生理反应是一个极其复杂的过程,因此,需要深入研究 CuPT对非目标生物的毒性作用机制。甲壳动物是水生生态系统中分布较为广泛的种群,其典型的底栖生活习性和特殊的生理生化特征使其体内易积累有毒物质,常作为水环境污染的指示生物。利用甲壳动物系统研究水环境毒理学和生态风险评价具有重要的实用价值,对保护人类和动物的生存与健康具有重要的意义。凡纳滨对
13、虾Litopenaeus vannamei又名南美白对虾,是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一(徐德峰等,2022),也是我国养殖规模和产量第一的经济甲壳动物(李会峰,2019)。凡纳滨对虾对环境胁迫非常敏感,且容易养殖、处理,已经被作为毒理学研究的模型生物(Su et al.,2019)。肝胰腺是十足目Decapoda甲壳动物消化系统中最大的器官,同时也是甲壳动物重要的代谢器官,其与一些重金属和有机异生素解毒相关(Vogt,2019)。Chen等(2022)报道了 CuPT对凡纳滨对虾血细胞的毒性影响,但关于CuPT对其肝胰腺的毒性影响还未见报道。本实验以凡纳滨对虾为研究对象,检测Cu
14、PT胁迫对肝胰腺糖原、乳酸、丙二醛(MDA)含量,以及抗氧化相关基因,如锰超氧化物歧化酶基因(MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx)、过氧化氢酶基因(CAT)和凋亡相关基因,如半胱氨酸蛋白酶3基因(caspase3)和肿瘤抑制基因(p53)的表达量,旨在从生物化学和分子生物学水平研究610李舒泓等:吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响CuPT对凡纳滨对虾的毒性影响,为深入CuPT对水生生物的毒性效应机制研究提供前期基础。1材料与方法1.1实验动物凡纳滨对虾平均体重 7.51 g1.94 g,来自广东海洋大学东海岛养殖基地,实验前暂养在养殖桶(300
15、L)中 14 d。实验用海水经过消毒过滤,实验过程中为养殖海水连续曝气,海水盐度26,pH7.57.9,温度 26.226.8,溶解氧含量5.86.2 mgL1。暂养期间,每日按照对虾体重的 5%投喂 2 次(0800 和 2000)普通商业虾饲料,每天换水50%,实验前24 h停止投喂。1.2实验仪器与试剂Finnpipette移液器(Thermo)、电热恒温培养箱(武汉一恒苏净科学仪器有限公司)、RT-6100酶标仪(Rayto)、TG16W 离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)、TGL16M 冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、HT-111B 恒温摇床(上海赫田科学仪器有限公司)
16、、XB220A 电子分析天平(Precisa)、JY98-IIIN细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)、81-2恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)、NanoDrop 2000分光光度计(NanoDrop Technologies);反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa);荧光定量试剂 SYBR Premix Ex Taq(Takara);荧光定量仪器Light Cycler 480(Roche)。1.3胁迫实验根据已有研究(Mochida et al.,2008;Vivien et al.,2012;Almond&Trombetta,20
17、17),以二甲基亚砜(DMSO,广东光华科技股份有限公司)为助溶剂制备浓度为1 g L-1的CuPT母液(纯度97%,上海源叶生物科技有限公司),实验时用海水进一步稀释到实验所需浓度。根据 Chen 等(2022)的研究,实验设置空白对照组、DMSO 溶剂对照组(0.128 mL L1)和2 个 CuPT 处理组(64 gL1和128 g L1)。挑选体色健康、大小均一、无病患、活力强且处于蜕皮间期的个体进行实验,每桶20尾。每组 3个平行,每桶盛有 200 L暴露溶液。在48 h的暴露过程中不投喂,每24 h更换50%暴露溶液,其他条件与暂养期相同。由于CuPT在光照条件下容易降解,根据 T
18、ekov 等(2020)的报道,本实验在黑暗环境中进行。在胁迫0 h、3 h、12 h、24 h和48 h取样,每桶取对虾3尾,分离肝胰腺于1.5 mL冻存管中放入液氮速冻,80 保存。1.4生化分析取肝胰腺组织在冰上解冻,称量组织样品,加入PBS(pH7.4),用匀浆器将样品充分匀浆,低温离心(2 500 r min1,20 min),吸取上清用于检测。根据使用说明书,使用糖原、乳酸和MDA的ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)检测肝胰腺中的糖原、乳酸和MDA含量。1.5肝胰腺基因表达根据说明书,用 Trizol 法提取肝胰腺细胞总RNA,使用 NanoDrop 2000 分光光
19、度计检测 RNA的质量及浓度,琼脂糖凝胶电泳验证 RNA 完整性。qRT-PCR 的引物(表 1)使用 Primer Premier 5设计。使用去基因组DNA的反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit合成 cDNA。利用荧光定量分析仪器Light Cycler 480 和荧光定量试剂SYBR Premix Ex Taq 进行 RNA 表达量分析。10 L反应 体 系 为:5 L 2SYBR Premix Ex Taq、1 L cDNA(50 ng L1)、正向和反向引物各 0.4 L(10 mmol L1)和 3.2 L ddH2O。通过 2ct法计算mRNA相对
20、表达水平(Livak&Schmittgen,2001)。1.6数据分析利用 SPSS 19.0 进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和多重比较(Tukey)分析。数据以x SD表示,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1毒性症状在各实验组中,凡纳滨对虾均未出现死亡现象。但64 g L1和128 g L1 CuPT处理组观察到611四川动物 2023 年 第 42 卷 第 6 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.6 2023虾聚集、身体侧翻的现象,而空白对照组和DMSO溶剂对照组中的虾游动正常,在水体中分布均匀。2.2凡纳滨对虾肝胰腺糖原、
21、乳酸含量与空白对照组及 DMSO 溶剂对照组相比,在CuPT胁迫初期(3 h),2个处理组的糖原、乳酸含量均呈明显下降(P0.05),128 g L1组的下降幅度显著高于 64 gL1组(P0.05)。随着胁迫时间延长(1224 h),64 g L1组的糖原、乳酸含量趋于稳定,在胁迫48 h时显著下降(P0.05);128 g L1组的糖原、乳酸含量在胁迫 24 h 后显著下降(P0.05)(图1)。2.3凡纳滨对虾肝胰腺MDA含量胁迫开始后,2个处理组的MDA含量与空白对照组、DMSO溶剂对照组之间的差异显著(P0.05),在 CuPT 胁迫初期(3 h),2 个处理组的 MDA 含量均 显
22、 著 升 高(P0.05);随 着 胁 迫 时 间 延 长,表1荧光定量PCR引物Table 1Primers used for qRT-PCR基因GeneactinMnSODGPxCATcaspase3p53GenBank登录号GenBank accession numberAF300705DQ298207.1AY973252AY518322EU421939KC422442序列Sequence(5-3)F:CATCAAGGAGAAACTGTGCTACGR:CATGATGGAGTTGTAGGTGGTCTF:GCAATGAATGCCCTTCTACCR:CAGAGCCTTTCACTCCAACGF:
23、AGGGACTTCCACCAGATGR:CAACAACTCCCCTTCGGTAF:TCAGCGTTTGGTGGAGAAR:GCCTGGCTCATCTTTATCF:GGTGGACAAAGGCGTGAGTAR:GTTCTTGAGGTTCTCGGCCAF:CGTCAGTCGGTGGTGTATCAGR:GAATGTGCCAGAGTAGAGTCAGC图1CuPT对凡纳滨对虾肝胰腺糖原和乳酸含量的影响Fig.1Effects of CuPT on the content of glycogen and lactic acid in the hepatopancreas of Litopenaeus van
24、namei不同大写字母代表相同处理组不同胁迫时间之间具有显著差异(P0.05);不同小写字母代表相同胁迫时间不同处理组间具有显著差异(P0.05);下同Different capital letters indicate there is a significant difference between the same treatment group at different exposure times(P0.05),different lowercase letters indicate there is a significant difference between differen
25、t treatment groups at the same exposure time(P0.05);the same below612李舒泓等:吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响64 gL1组的 MDA 含量变化趋势较为平稳,128 g L1组的MDA含量则持续增加,二者均在胁迫48 h时达到峰值(P0.05)(图2)。2.4凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化、凋亡基因表达胁迫开始后,MnSOD表达水平在64 g L1组的 12 h和 24 h被显著诱导,48 h后受到显著抑制(P0.05);在128 g L1组的12 h被显著诱导,24 h后受到显著抑制,达到最
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