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SN∕T 3675-2013 草莓花枯病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3675-2013 草莓花枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Rhizoctonifrgrze Husain et W.E.McKeen 2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民八芳和国发布国家质量监告恒L在疫总局SN/T 3675-2013 目IJ 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由同家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和同湖北出人境检验检疫局、中同检验检疫科学研究院、中华人民共和同江苏出入境检验检疫局、中华人民共和同厦门出入境检验检疫
2、局、中华人民共和同山东出入境检验检疫局、中华人民共和同天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人:王振华、冯汉利、张剑锋、李凤新、王宏毅、叶去、吴品珊、吴翠萍、李彬、王英超、罗加凤。SN/T 3675-2013 草莓花枯病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了草莓花枯病菌检疫鉴定方法。本标准适用于草莓种子、种苗及果实上的草莓花枯病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注明日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 病菌基本信息中文名:草莓花枯病
3、菌学名:Rhizoctoniafragariae Husain et W.E.Mckeen 分类地位:草莓花枯病菌元性态Rhizctniafragariae属于真菌界Fungl,半知菌门Basidiomycota,丝子包纲Hyphomycetes ,无子包目Agonomycetales,无子包科Agonomycetaceae,丝核菌属Rhizoctnz正l 0有性态C旷tobidiumcrnzgeruln,属于担子亚门Basidiomycota,伞菌纲Agaricomycetes,鸡油菌日Cantharellales,角担子菌科Cerato basidiaceae,角担菌属Ceratob汀di
4、um。传播途径:带菌的草莓、根系、花营、士壤是远距离传播主要途径。其他信息参见附录Ao4 方法原理根据草莓花枯病菌在寄主上的为害症状、形态特征、培养性状等特征进行结果判定O5 仪器设备和主要试剂5.1 仪器设备PCR仪、超净工作台、高压灭菌器、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微量进样器、电泳仪、凝胶电泳设备、凝胶成像系统、体视显微镜、生物显微镜(带显微照相装置)、天平(感量0.1g)、测微尺、光照培养箱等O5.2 主要试剂和培养基琼脂i情粉、次氯酸铀(NaCIO)、氯霉素、引物、三连甲基氨基甲皖(Tris)、十六皖基三乙基澳
5、化镀(CTAB)、乙二胶四乙酸CEDTA)、无水乙醇、蛋白酶K、苯盼、气氯甲:皖、异戊醉、乙酸按CNH4Ac)、氯化娱CMgC12)、PCR缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、TaqDNA聚合酶、澳化乙键(EB)、液氮、3.5%甲醒、二氨基2苯基呵|睐(DAPD、硝酸锦(KNO!,),71.琼脂和马铃薯葡萄糖培养基(PDA)。实SN/T 3675-2013 验用水应符合GB/T6682巾的规定。6 现场检疫检查根是否根腐,颜色棕色或黑色,植株是否矮小、萎焉,似冻害状。花开时,花粉囊是否黑色,花梗正常,花心黑色。果实的组织是再变褐,变硬,成熟果实是再变软,表面是再有白色
6、稀疏菌丝体(参见附录B)。7 实验室检疫7.1 直接镜检将有明显病症的根系、花营或果实材料置于体视显微镜下检查,或直接挑取病部子实体制成玻片,置于生物显微镜下镜检,观察记录菌丝、担子果、担子的形态特征和着生方式.并测量其大小。7.2 保湿培养如根系、花营或病果上只有可疑病状而无明显病症,则将病根(截成:5cm)或繁殖材料置于样品袋巾,于20oc 25 oc下保湿培养,每天观察症状的变化,并进行显微镜检或分离培养。7.3 病原菌的分离培养取具有疑似发病症状的根或繁殖材料,用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分C用1%NaCIO表面消毒1min2 min,用无菌水冲洗3次,用无菌吸水纸吸干表面水分后,
7、放人水琼脂(含250JJ.g/mL 氯霉素)表面,当组织表面长出菌丝后,将菌丝转移至PDA平板(含250g/mL氯霉素)上,继续培养2 d3 d。小心挑取新长出的菌丝,转接到新的PDA平板上进行真菌的纯化培养。连续转接3次,获得真菌的纯培养物。7.4 菌丝和菌核的形态观察将纯培养物接种在含有1mm厚PDA的平板上,培养3d5 d,在菌丝生长最旺盛的边缘取出带有菌丝的琼脂碟片,在3.5%的甲醒中同定,用无菌水冲洗,然后在二氨基2苯基呵|睐(DAPD染色4 min,再用无菌水褪色3mino在生物显微镜的紫外光下观察菌丝的形态及菌核的数量。7.5 分子生物学鉴定DNA提取方法、引物、PCR扩增及产物
8、测序分析等参见附录Co8 鉴定特征在生物显微镜下观察,菌丝细胞有双核,菌丝初无色,宽3m9m,无锁状连接,老熟后呈褐色,在分枝处去益缩。在培养基上,很少产生菌核,菌核表面粗糙,褐色至黑色,表里颜色相同,菌核之间有丝状体相连,不产生无性于包子,可产生大量的念珠形于包子链O担子果(子实体)平展、薄、白色O担子为椭球状至近似棒状,(9m14 JJ.m) X (8m12 JJ.m),有4个子包子梗。担子包子为椭球状和近似纺锤状,(6mllm) X (4 JJ.m6 JJ.m) (参见附录DL9 结果判定根据草莓花枯病菌的鉴定特征对分离物进行综合判定,如病菌的形态学特征与第8章中描述的鉴2 SN/T 3
9、675-2013 定指标相符,则可鉴定为草莓花枯病菌。7.5巾描述的分子生物学鉴定作为病菌形态学鉴定的辅助判定特征。10 样品保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存。对检出草莓花枯病菌的样品保存于一20oc冰箱巾6个月,以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。门菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为莓花枯病菌的菌株,纯分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人;菌株在含30%甘泊的冻存管中于80 oc保存,或将菌株转接在PDA斜面上培养,待菌丝体长满斜面后,置于4oc下保存,并定期(180d)转管O病菌基因组DNA样品于20 oc下保存O对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处
10、理O12 实验记录与保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。3 SN/T 3675-2013 附录A(资料性附录)草莓花枯病菌其他相关信息.1 症状特征.1.1 根系症状感染病害的根系症状最为明显O整个根系比健康植株的明显小,侧根数量减少,白色肉质根上分布有不规则的黑色块状,根内为黄色到白色。严重感染时,这些黑色区域连成片,使整个白色肉质根变黑。感染的木质根初期外部变为黑色,后来根内也完全变黑,横切木质根时根内完全变黑,主根全部或部分(特别是根尖部分)死亡。.1.2 花症状病菌主要侵染未开
11、放的花蕾O花初开时,花药暗褐色,雌志区域光滑,雌在缺失O侵染发生在花冠出现之前,或者之后的短时间内,在花营开放后很快结束。被严重侵染的花,在开花前花药和雌血都被破坏,当花吉隆起花瓣可见时,花瓣外可见褐色的损伤,花瓣区域呈粉红色。颜色逐渐变深为黑色,花心变黑,类似于冻害症状。果实表现不同程度的畸形。.1.3 果实症状侵染初期发病果实病部变褐,变硬。成熟果实变软,表面有白色稀疏菌丝体。.1.4 植株症状植株长势较差、矮化,产果小且少o叶片面积变小,单片或多片叶可能萎焉、褪色甚至死亡Q严重时,整个植株死亡。.2 寄主范围在自然条件下,只侵染昔薇科草莓属Fragari植物。.3 分布4 主要分布在美洲
12、、欧洲、亚洲o美洲:美同、加拿大、海地、牙买加、墨西哥、巴西。欧洲:法同、意大利、波兰、西班牙、荷兰、比利时、俄罗斯、罗马尼亚、英同。亚洲:日本。图B.1草莓叶片症状图B.3侵染植株症状SN/T 3675-2013 附录B(资料性附录)草莓花枯病菌病害症状特征图图B.2草莓果实症状图B.4侵染植株后期症状d SN/T 3675-2013 图B.5侵染根系症状图B.6侵染根系后期症状注:图片来自http:www.omafra.gov.oll.ca/ 6 SN/T 3675-2013 附录C(资料性附录)草莓花枯病菌分子生物学鉴定C.1 DNA提取一-CTAB提取法在PDA培养基巾接种活化的供试分
13、离物,在25oc条件下培养3d5 d,应用滤纸过滤收集菌丝,于20 oc下储存备用O菌丝采取CTAB法,具体操作如下:收集培养的菌丝于研钵巾,加入液氮和少许石英砂研磨成菌丝粉,取0.2g菌丝粉于2mL离心管内,加入细胞裂解缓冲液(1% CTAB; 50 mmol/L Tr时CL,pH8.0;10 mmol/L EDTA,pH 8.0)1 mL,20 mg/mL蛋白酶K5 ,uL,于涡旋器上充分混合后,55oc水浴1h3 h;将离心管于12000 r/min,离心10min;取上清液800L,加人等体积的苯盼:气氯甲皖:异戊醇(25: 24 : 1),轻轻颠倒混匀,12000 r/min,离心1
14、0min;取上层水相600L,加入等体积的气氯甲皖:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,12000 r/min,离心1凹omi且川;取上层水相400,uL.力加H人2倍体积的冰元水乙醇和1盯/1川O体积的3mol/I气/L乙酸铀置于2剖oOC沉冗淀1h3 h;刊;将离J心b管于12000 r/厅/离心1川omin口川;弃上i清青液沉淀用70%乙醇洗涤一次;干燥后用100LL双蒸水榕解,加人RNas于37oc 消解1h后,-20oc下保存备用。C.2 PCR扩增及PCR产物检测分析应用通用引物又才ITS4(5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 )和ITS5( 5 -GGAAGTA-A
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