阿霉素白蛋白透明质酸纳米粒的制备及评价.pdf
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1、.921.文章编号:1001-8689(2023)08-0921-09收稿日期:2022-08-15作者简介:陶静,女,生于1977年,副研究员,研究方向为药物新制剂与新型给药系统研究,E-mail:*通信作者,E-mai:阿霉素白蛋白透明质酸纳米粒的制备及评价陶静 李黎 廖蓉惠 涂娜 沈雪*(抗生素研究与再评价四川省重点实验室,四川抗菌素工业研究所,药学院,成都大学,成都 610106)摘要:目的 制备以人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)和透明质酸(hyaluronic acid,HA)为载体,负载抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin,DOX)的纳米粒子,对纳
2、米粒制备处方进行优化,并对制剂进行质量评价,初步考察纳米粒的体外抗肿瘤效果。方法 采用去溶剂-交联法制备得到负载阿霉素的白蛋白透明质酸纳米粒子(DOX-HSA-HA NPs),并利用Box-Behnken Design响应面优化筛选最优处方,采用透射电镜、激光粒度仪对纳米粒的形貌和粒径进行考察,并考察纳米粒的体外释放效果及体外溶血情况,最后通过细胞毒性实验初步考察纳米粒的体外抗肿瘤效果。结果 按优化条件制得的DOX-HSA-HA NPs透射电镜下呈球形,分布均一,粒径为(213.390.79)nm,PDI值为0.0620.012,Zeta电位为-25.53 mV,包封率达88.85%,载药量达
3、2.06%;体外释放结果表明,在pH 6.8和pH 7.4条件下DOX-HSA-HA NPs具有缓释效果,加入透明质酸酶之后,DOX的释放量增加;溶血性实验表明,纳米载体材料HSA-HA NPs无溶血风险,可用于静脉注射给药;体外细胞实验表明,空白载体对细胞基本无毒性,相比于DOX-HSA NPs,DOX-HSA-HA NPs对小鼠乳腺癌4T1细胞的细胞毒性增强。结论 采用去溶剂-交联法制得的DOX-HSA-HA NPs分布均匀,包封率高,具有明显的缓释作用和增强的细胞毒性。关键词:人血清白蛋白;透明质酸;阿霉素;纳米粒;体外抗肿瘤中图分类号:R978.1 文献标志码:APreparation
4、 and evaluation of albumin and hyaluronic acid nanoparticles loaded with doxorubicinTao Jing,Li Li,Liao Ronghui,Tu Na,and Shen Xue(Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province,Sichuan Industrial Institute of Antibiotics,School of Pharmacy,Chengdu University,Chengdu 61010
5、6)Abstract Objective In order to improve the efficiency of cancer treatment,doxorubicin(DOX)-loaded Human Serum Albumin(HSA)and Hyaluronic acid(HA)nanoparticles(abbreviated as DOX-HSA-HA NPs)were prepared and optimized.Then,the drug properties and antitumor activity were evaluated.Methods The DOX-HS
6、A-HA NPs was prepared by the solvent removal and crosslinking method.Then,the Box-Behnken design response surface methodology was used to optimize the initial prescription.In addition,the morphology of the nanoparticles was investigated by transmission electron microscope(TEM),and the size distribut
7、ion of the nanoparticles was determined by ZetaPlus particle size and zeta potential analyzer.Moreover,the release behavior of the nanoparticles in vitro was investigated by dialysis,and the hemolysis in vitro was investigated using healthy rats.Finally,the anti-tumor effect of 中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期
8、.922.阿霉素白蛋白透明质酸纳米粒的制备及评价 陶静等阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种抗肿瘤类抗生素,抗瘤谱广,可用于乳腺癌、肝癌、膀胱癌等多种癌症的治疗1。然而,由于DOX对肿瘤细胞缺乏靶向性,其进入血液循环后非特异性分布的特点造成了许多不良反应,如心脏毒性、骨髓抑制、粘膜炎和脱发等限制了阿霉素的临床应用2-3。纳米载药系统是一种新型的载药体系,是一种具有特定功能的新物质4,在包载化疗药物、多肽和蛋白药物、基因药物等方面具有很大的潜力。采用纳米粒包载药物,能提高药物靶向性,减少毒副作用5-6。白蛋白(albumin)是一种天然蛋白,来源广泛,种类繁多,其中人血清白蛋白(hum
9、an serum albumin,HSA)是一种广泛应用的载体7,研究发现,将药物包载于HSA纳米粒中,能降低巨噬细胞对纳米粒的亲和力,避免药物被清除,延长药物体内循环8。HSA相对分子质量约为665000,HSA三级结构存在两个药物高亲和力结合位点,位点I和II分别位于白蛋白的疏水空腔,药物在该位点的结合主要通过疏水相互作用、静电相互作用和氢键作用实现9-10。因此,HSA作为一种天然载体可与多种药物结合,实现药物的高效负载。研究证实,多种肿瘤细胞过表达分泌蛋白SPARC,白蛋白首先通过肿瘤血管内皮细胞表达的gp60受体(一种分子量为60 kDa的糖蛋白)介导的内吞作用进入肿瘤间质,随后与肿
10、瘤细胞过表达的分泌蛋白SPARC结合,促使包载药物的白蛋白纳米粒富集在肿瘤细胞中,提高药物对肿瘤组织的靶向性11-12。因此可以利用细胞膜上白蛋白受体跨膜转运机制,将药物靶向运输到肿瘤组织部位。为了进一步提高纳米制剂的靶向肿瘤能力和肿瘤内部穿透能力,可将白蛋白与一些具有靶向能力以及能被特异性酶触发降解的物质结合来制备纳米制剂。透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为一种内源性大分子,具有相容性好、无免疫原性、生物可降解性等优点。HA可被肿瘤区域丰富的透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)降解,特别是在高转移性肿瘤内13-14。因此,利用透明质酸构建纳米颗粒,能够获得肿
11、瘤特异性透明质酸酶敏感的纳米粒,当纳米粒到达肿瘤部位,被透明质酸酶降解,使部分药物释放,同时大粒径的纳米粒结构改变,转变为小粒径的纳米粒,进一步深入渗透到肿瘤内部,使药物达到肿瘤深部穿透的效果。由于HA具有亲水性,因此在纳米粒子表面可以形成一亲水性层,从而保护纳米粒免受调理素的破坏,延长纳米粒的血液循环时间15。细胞表面受体CD44在肿瘤增殖和转移过程具有调节作用,其在多种肿瘤细胞上高表达,研究证明,HA可与CD44受体特异性结合,使基于透明质酸的纳米粒具有对肿瘤细胞主动靶向的能力16-17。因此,将透明质酸制备成纳米粒,可赋予纳米载体具有CD44介导的主动靶向能力、透明质酸酶触发的药物释放增
12、多、药物进一步渗透到肿瘤深处部位等优点,达到延长药物作用时间、提高治疗效果的目的。因此,本实验将HSA和HA联合构建纳米载体并负载抗肿瘤药物DOX,得到负载阿霉素的白蛋the nanoparticles in vitro was preliminarily investigated by cytotoxicity assays.Results The DOX-HSA-HA NPs prepared under the optimized conditions were spherical and uniformly distributed,with a particle size of(213
13、.39 0.79)nm,a PDI of 0.062 0.012,and a Zeta potential of-25.53 mV.The encapsulation rate and drug loading capacity of DOX were 88.85%and 2.06%.In vitro release results showed that DOX-HSA-HA NPs had a sustained release effect at pH 6.8 and pH 7.4,and the DOX release rate increased when treated with
14、hyaluronidase.The hemolytic test showed that the nanocarrier materials HSA-HA NPs were safe and non-toxic,and were suitable for intravenous administration.Cytotoxicity assay showed that HSA-HA NPs were nontoxic to 4T1 cells(mouse breast cancer cells),and DOX-HSA-HA NPs were more cytotoxic to 4T1 cel
15、ls than DOX-HSA NPs.Conclusion The DOX-HSA-HA NPs prepared by the solvent removal and crosslinking method exhibited uniform particle size and size distribution,high encapsulation efficiency,a sustained drug release behavior,and showed enhanced cytotoxicity.Key words Human serum albumin(HSA);Hyaluron
16、ic acid(HA);Doxorubicin(DOX);Nanoparticles(NPs);Anti-tumor in vitro.923.白透明质酸纳米粒子(DOX-HSA-HA NPs),以期增加DOX的靶向性,减少毒副作用,并增强抗肿瘤效果。1 仪器及试药1.1 药品与试剂阿霉素(批号MB1087-1,纯度98%)、透明质酸(批号MB3113-1,含量95%)购自大连美仑生物技术;人血清白蛋白(批号S20113010、浓度为25%)购自成都蓉生药业;戊二醛(纯度25%)、透明质酸酶购自上海泰坦科技;氢氧化钠购自成都科龙化工试剂;丙酮购自成都市科隆化学品;细胞培养基、胰酶购自Gibco
17、公司;CCK-8试剂盒、MTT试剂盒购自上海碧云天生物技术。1.2 仪器CPA225D型十万分之一电子天平(德国 Sartorius公司);DF-101S型磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);UV-2450紫外分光光度计(Kyoto Japan);ZEN3600纳米激光粒度仪(英国Malvern公司);TGL-22S型高速冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司);HT7700低压透射电镜(日本Hitachi公司);THZ-92A恒温振荡器(上海博讯实业有限公司);BPN-150CN(UV)二氧化碳培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);ELx800酶标仪(BioTek公司);SW-CJ-2D超净工作台
18、(济南森亚实验仪器有限公司);Axioscope 5荧光显微镜(上海卡尔蔡司)。1.3 细胞小鼠乳腺癌细胞4T1细胞:来源于四川抗菌素工业研究所。2 方法与结果2.1 DOX-HSA-HA NPs的制备本试验采用去溶剂化-交联法18制备DOX-HSA-HA NPs。精密量取20%的HSA(10 mg/50 mL)适量,取超纯水稀释,得到浓度为2%的HSA溶液,用0.1 mol/L氢氧化钠调节pH到8,另精密称取6 mg的DOX和25 mg的HA,溶于10 mL的HSA溶液中,充分搅拌0.5 h,使药物充分溶解混合,快速搅拌状态下以1 mL/min的速度滴加丙酮,至HSA溶液出现浑浊,停止滴加丙
19、酮,继续搅拌0.5 h,加入5%的戊二醛250 L交联2 h,最后真空旋转蒸发除去有机溶剂,离心纯化除去多余的戊二醛等,得到DOX-HSA-HA NPs。2.2 DOX分析方法的建立2.2.1 紫外检测方法精密称取一定量的DOX样品,超纯水溶解后定容,得到1 mg/mL的DOX储备液,4 避光保存。储备液用超纯水稀释,得到一定浓度的DOX溶液,紫外全波长扫描,记录其吸收图谱,在480 nm处出现吸收峰,作为DOX的测定波长。2.2.2 DOX标准曲线的绘制精密量取DOX储备液,用超纯水稀释,分别得到浓度为10、20、30、40、50和60 g/mL的一系列溶液,于波长480 nm处测定其吸光值
20、A,以吸光值A和浓度C作图,进行线性回归分析,得到回归方程为Y=0.0156X+0.0139(R2=0.9992、n=6),结果表明DOX在浓度1060 g/mL范围之间线性关系良好。2.2.3 专属性试验分别取对照储备液(1 mg/mL DOX)、供试品溶液(DOX-HSA-HA NPs)、空白纳米溶液(HSA-HA NPs),稀释到一定浓度,进行全波长扫描,记录其特征吸收峰。结果见图1,HSA和HA对DOX的测定无干扰,表明在波长480 nm下测定DOX专属性良好。2.2.4 精密度试验取10 mL容量瓶,加入一定量的DOX储备液,超纯水稀释定容,得到浓度为30 g/mL的DOX溶液,于波
21、长480 nm处连续测定吸收值,重复6次,计算RSD值,结果为0.95%,表明精密度良好。图1 紫外吸收波长专属性考察Fig.1 The UV-vis absorption spectra of free DOX、free HSA、free HA、HSA-HA NPs and DOX-HSA-HA NPsDOXHAHSAHSA-HA NPsDOX-HSA-HA NPs200 300 400 500 600 700 800Wavelength/nmAbsorbance6420中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.924.2.2.5 重复性试验精密吸取一定量的DOX-HSA-HA NPs于1
22、0 mL容量瓶中,加甲醇超声破乳,定容,得到浓度约为30 g/mL的DOX溶液,过0.22 m微孔滤膜,续滤液在紫外480 nm下测定吸收值,重复6次,计算RSD值,结果为0.37%,表明该方法重复性良好。2.2.6 DOX-HSA-HA NPs包封率和载药量的测定采用低温高速离心法测定包封率和载药量。精密吸取1 mL的DOX-HSA-HA NPs,在转速15000 r/min、温度4 条件下离心15 min,取上清液过0.22 m滤膜,续滤液于紫外480 nm下测定吸收值,计算游离药物的量。采用超声破乳法测定样品中总药物量,吸取1 mL的DOX-HSA-HA NPs,加入适量甲醇,420 W
23、的功率下超声30 min,紫外480 nm下测定吸收值,计算DOX-HSA-HA NPs中DOX药物的总量,包封率及载药量计算公式如下:包封率=(W总药-W游离)/W总药100%(1)载药量=(W总药-W游离)/(W总药-W游离+W载体)100%(2)其中W游离为游离药物的质量,W总药为总药物质量,W载体为空白载体的质量通过最优处方条件下制得纳米粒样品,根据低温高速离心法测得包封率为88.85%,载药量为2.06%。2.2.7 冷冻高速离心回收率实验取9个10 mL容量瓶,分别加入适量空白纳米载体,再分别吸取0.24、0.30和0.36 mL的DOX储备液,超纯水定容,分别得到低、中、高(80
24、%、100%、120%)3种浓度的DOX溶液,每个浓度平行3组。4、15000 r/min条件下离心15 min,取上层清液,紫外480 nm下测定吸收值,计算回收率及RSD值,结果表明,3种浓度的DOX的回收率均在98%102%之间,并且RSD值均小于2%,表明冷冻高速离心方法的回收率良好,该方法可用于包封率和载药量的测定。2.3 纳米粒处方的优化2.3.1 BOX-Behnken Design 优化处方通过前期单因素实验,优化纳米粒的处方工艺,选择HA浓度(A)、HSA浓度(B)、HSA的pH值(C)3个因素,设计3个水平,以包封率作为响应值,使用Box-Behnken Design对纳米
25、粒制备处方进行响应面优化分析,筛选最优处方,设计因素水平见表1。通过表1进行试验设计,结果见表2。表1 响应面因素水平设计表Tab.1 The Design of factor and levels by response surface methodologyFactorLevel101A/(mg/mL)1.522.5B/%22.53C(1)789表2 BOX-Behnken Design试验设计与结果Tab.2 Experimental design and results by BOX-BehnkenStdRunFactorsResponseABCEE/%3122.5842.387222
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