阿美替尼具有较好的抗神经母细胞瘤作用:基于下调MMP2和MMP9的表达.pdf
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1、神经母细胞瘤(NB)是一种儿童中最常见的颅外实体肿瘤,约占所有儿童肿瘤患者的8%,约90%的病例发生在5岁以下儿童中 1。神经母细胞瘤来源于胚胎神经嵴细胞,具有较强的侵袭转移性和致死性 2,3,约占所有儿童癌症死亡人数的15%4,NB起病隐匿,多数儿童患者在就诊时已经发生了多部位转移,预后较差 5,严重威胁儿童的生命健康与生活质量。人们在防治神经母细胞瘤进展方面收效甚微,目前以细胞毒类化疗药物为主 6,但化疗药物由于缺乏靶向性,常引起胃肠道等不良反应 7,其治疗效果令人沮丧。因此,临床上迫切需要寻找阿美替尼具阿美替尼具有较好的抗神经母细胞瘤作用有较好的抗神经母细胞瘤作用:基于下调基于下调MMP
2、MMP2 2和和MMPMMP9 9的表的表达达刘雪柔,杨玉梅,蔡 慧,张耀帅,范方田,李 娴,李姗姗蚌埠医学院药学院,安徽省生化药物工程技术研究中心,安徽 蚌埠 233030Aumolertinib inhibits proliferation,invasion and migration and promotes apoptosis ofneuroblastoma cells by downregulating MMP2 and MMP9 expressionLIU Xuerou,YANG Yumei,CAI Hui,ZHANG Yaoshuai,FAN Fangtian,LI Xian,L
3、I ShanshanSchool of Pharmacy,Bengbu Medical College,Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Biochemical Pharmaceuticals,Bengbu 233030,China摘要:目的 探究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂阿美替尼对神经母细胞瘤SH-SY5Y的作用。方法 CCK-8法、集落克隆法和流式细胞术检测不同浓度阿美替尼(0、2、4、8 mol/L)对SH-SY5Y细胞增殖、细胞存活和细胞凋亡的影响;透射电镜观察阿美替尼处理后SH-SY5Y细胞亚显
4、微结构;Transwell小室实验检测阿美替尼对SH-SY5Y细胞侵袭及迁移的作用;Westernblot实验检测阿美替尼对SH-SY5Y细胞凋亡和侵袭迁移相关蛋白Bax、Bcl-2、E-Cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9表达的影响;SH-SY5Y细胞注射到5周龄BALB/C裸鼠皮下,建立裸鼠皮下瘤动物模型,每组6只,设置空白对照组、阿美替尼处理组(15 mg/kg)、阳性药环磷酰胺处理组(20 mg/kg),测量裸鼠肿瘤体积及体质量变化,HE染色观察阿美替尼对荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾的毒副作用。结果 CCK-8结果表明,相比于对照组,阿美替尼能够抑制SH-SY5Y细胞增
5、殖(P0.05),其作用24、48、72 h的IC50分别为5.004、3.728、3.228 mol/L;集落克隆结果表明阿美替尼能够抑制SH-SY5Y细胞存活;流式细胞术结果表明阿美替尼诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡(P0.05),透射电镜下观察到阿美替尼处理后具有典型的细胞凋亡形态学特征;Transwell小室实验结果表明阿美替尼能够抑制SH-SY5Y细胞的侵袭迁移能力(P0.01);Western blot实验结果表明阿美替尼处理后SH-SY5Y细胞中E-Cadherin、Bax蛋白表达水平上调,Bcl-2、Vimentin、MMP2、MMP9蛋白表达水平下调(P0.05);动物实验结
6、果表明阿美替尼能够抑制神经母细胞瘤的生长,HE染色结果表明阿美替尼没有对小鼠脏器产生明显毒性。结论 阿美替尼能够抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖并诱导细胞发生凋亡,通过下调 MMP2、MMP9 蛋白表达,从而抑制神经母细胞瘤侵袭和迁移。关键词:神经母细胞瘤;阿美替尼;增殖;凋亡;侵袭迁移;上皮间质转化Abstract:Objective To investigate the effects of aumolertinib,an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor(EGFR-TKI),on biologica
7、l behaviors of neuroblastoma SH-SY5Y cells.Methods CCK-8 assay,colony-forming assay,Transwellassay and flow cytometry were used to assess the effects of 2,4 and 8 mol/L aumolertinib on proliferation,survival,migration,invasion and apoptosis of SH-SY5Y cells,and the changes in ultrastructure of the c
8、ells were observed usingtransmission electron microscopy.The protein expressions of Bax,Bcl-2,E-cadherin,vimentin,MMP2,and MMP9 in thetreated cells were detected using Western blotting.A nude mouse model bearing subcutaneous SH-SY5Y cell xenograft weretreated with aumolertinib(15 mg/kg)or cyclophosp
9、hamide(20 mg/kg),and the tumor volume and body mass changes wasmeasured.HE staining was used to observe adverse effects of the treatment on the heart,liver,spleen,lungs and kidneys.Results Aumolertinib significantly inhibited the proliferation and viability of SH-SY5Y cells(P0.05)with IC50of 5.004,3
10、.728and 3.228 mol/L at 24,48 and 72 h,respectively.Aumolertinib treatment induced obvious apoptosis of the cells,whichshowed characteristic morphological changes of apoptosis under transmission electron microscope.The treatment alsoinhibited the invasion and migration abilities of SH-SY5Y cells(P0.0
11、1),up-regulated the expression levels of E-cadherin andBax and lowered the expression levels of Bcl-2,vimentin,MMP2 and MMP9(P0.05).In the nude mouse models,treatmentwith aumolertinib effectively inhibited the growth of neuroblastoma without causing significant toxicity to the vital organs.Conclusio
12、n Aumolertinib inhibits proliferation,survival,invasion and migration and induces apoptosis in SH-SY5Y cells bydownregulating MMP2 and MMP9 expression.Keywords:neuroblastoma;aumolertinib;proliferation;apoptosis;invasion;migration;epithelial mesenchymal transition收稿日期:2023-02-23基金项目:安徽省重点研究与开发计划资助项目(
13、202104g01020017);安徽省优秀科研创新团队项目(2022AH010084);蚌埠医学院重大科技项目孵育计划(2020byfy001);安徽省大学生创新创业项目(S202110367026)作者简介:刘雪柔,硕士,E-mail:通信作者:李姗姗,讲师,E-mail:;李 娴,教授,E-mail:J South Med Univ,2023,43(9):1493-1499doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.09.061493新的治疗药物,以改善NB 的治疗效果和不良预后。PI3K/AKT/mTOR信号通路级联反应能够调控神经母细胞瘤的发生发展 8,此信
14、号通路在大多数NB中被激活,能够促进肿瘤的存活、耐药、增殖、侵袭转移等 9。此外,还有多种突变基因在神经母瘤细胞中被发现,间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变基因是神经母瘤复发和转移等不良预后的驱动因素,其与神经母瘤发生发展过程密切相关 6。有研究表明,ALK能够激活PI3K/AKT/mTOR信号通路 8,这可能与ALK突变促进NB细胞增殖、侵袭迁移等恶性进展相关。因此,干预PI3K/AKT/mTOR通路可能是治疗ALK突变NB的潜在策略。PI3K/AKT/mTOR信号通路是表皮生长因子受体(EGFR)下游信号通路之一,EGFR 能够阻断 PI3K/AKT/mTOR信号传导途径,在肿瘤细胞增殖、侵袭
15、和转移过程中具有重要作用 10-16。有研究表明阿美替尼能够通过抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路,抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖,诱导细胞发生自噬和凋亡 17。同时,有临床研究报道:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗ALK突变患者具有显著的临床获益 18。因此,EGFR-TKI可能是治疗神经母细胞瘤ALK突变患者的可行策略。阿美替尼是我国自主研发的第3代EGFR-TKI,目前尚无关于阿美替尼对神经母细胞瘤体内外作用的相关报道。本研究以神经母瘤细胞SH-SY5Y为研究对象,体外观察阿美替尼对SH-SY5Y细胞增殖、存活、凋亡、侵袭迁移的影响,通过构建裸鼠异种移
16、植瘤模型来评价阿美替尼体内抗肿瘤作用,旨在为临床治疗神经母细胞瘤提供更多的解决方案,为阿美替尼应用于临床治疗神经母细胞瘤提供相应的理论和实验依据。1 材料和方法1.1 细胞株与动物人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,购自上海中乔新舟生物科技有限公司。动物:SPF级BALB/C裸鼠,购自杭州子源实验动物科技有限公司,许可证号:SCXK(浙)2019-0004。1.2 试剂阿美替尼(江苏豪森药业有限公司)、环磷酰胺(MedChemExpress)、Bax抗体、Bcl-2抗体、MMP9抗体和-Actin抗体(Affinity)、E-cadherin抗体、Vimentin抗体和MMP2抗体(protei
17、ntech),RPMI 1640培养基、胎牛血清(Gibco)、CCK-8试剂(APE BIO),Annexin V-FITC/PI试剂盒(贝博生物),Transwell小室(Corning),胰酶消化液(新赛美),青霉素-链霉素溶液和BCA蛋白浓度测定试剂盒(biosharp),RIPA裂解液(碧云天生物)。1.3 细胞培养SH-SY5Y细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中,置于37、5%CO2的恒温培养箱中培养。1.4 CCK-8法检测细胞增殖SH-SY5Y 细胞按 6000/孔种于 96 孔板中,置于37、5%CO2培养箱中培养,待细胞密度达到60
18、%80%左右时吸出培养基,加入含有不同浓度阿美替尼的培养基,每组设置6个复孔,分别孵育24、48、72 h后,每孔加入10 L CCK-8溶液,培养箱中孵育30 min左右,酶标仪测定吸光度A值,细胞存活率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)100%,计算药物半数抑制浓度。1.5 集落克隆法检测细胞存活SH-SY5Y细胞按2000/孔种于6孔板中,细胞贴壁后吸除培养基,加入含有不同浓度阿美替尼的培养基,10 d后移除培养基,用PBS清洗2遍,4%多聚甲醛固定30min,结晶紫染色,室温放置干燥后拍照,实验重复3次。1.6 细胞形态学观察将SH-SY5Y细胞按2105/孔接种于6孔板
19、中,待细胞密度达到60%80%时吸除培养基,加入含有不同浓度阿美替尼的培养基,培养24 h后使用倒置显微镜拍照,实验重复3次。1.7 流式细胞术检测细胞凋亡将SH-SY5Y细胞按2105/孔种于6孔板中,待细胞密度达到60%80%时吸去培养基,加入含有不同浓度阿美替尼的培养基,培养24 h后收集细胞,加入Annexin V-FITC/PI双染试剂染色,纱布过滤后流式细胞仪上机检测,实验重复3次。1.8 电镜观察细胞凋亡将SH-SY5Y细胞种于100mm大皿中,待细胞密度达到60%80%时吸去培养基,加入含有4 mol/L阿美替尼的培养基作用24 h,900 g收集细胞,PBS洗两遍,加入2.5
20、%常温戊二醛固定液固定细胞,透射电子显微镜采集图片,实验重复3次。1.9 Transwell侵袭实验基质胶与无血清培养基按照1 8比例稀释,在Transwell小室上室内加入50 L基质胶,置于培养箱中60 min左右。收集SH-SY5Y细胞,使用无血清1640培养基配含有不同浓度阿美替尼的细胞悬液,取2104个细胞加入上室,下室加入600 L含有10%胎牛血清的培养基,培养24 h后取出上室,用PBS轻轻冲洗,加入4%多聚甲醛室温固定15 min,结晶紫染液室温染色20 min,PBS冲洗后室温晾干,倒置显微镜下观察拍照,实验重复3次。1.10 Transwell迁移实验J South Me
21、d Univ,2023,43(9):1493-1499http:/www.j-1494无需加入基质胶,其余步骤同1.9。1.11 Westernblot检测相关蛋白表达将SH-SY5Y细胞种于100 mm大皿中,待细胞密度达到60%80%时吸去培养基,加入含有不同浓度阿美替尼的培养基,培养24 h后刮取蛋白,BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度以定量。蛋白上样,电泳,转膜,封闭,相应一抗4孵育过夜,二抗于室温孵育1.5h,ECL试剂盒显影曝光,凝胶成像系统采集图像,Image J软件扫描条带灰度值,实验重复3次。1.12 体内实验收集SH-SY5Y细胞,将细胞重悬于PBS与基质胶悬液中,将混悬细胞
22、注射到5周BALB/C裸鼠皮下,待肿瘤体积长至100 mm3左右,随机分为3组给药:模型对照组、阿美替尼治疗组、阳性药物环磷酰胺治疗组,每组6只,分别灌胃给予生理盐水、灌胃给予阿美替尼15 mg/kg、腹腔注射给予环磷酰胺 20 mg/kg,给药剂量根据 药理实验方法学 折算 19,成人体质量按60 kg估算,成人与小鼠的用药换算系数为9.01,各给药组按0.1 mL/10 g折算给药体积,对照组给予等体积生理盐水,阿美替尼治疗组1 d给药1次,环磷酰胺治疗组2 d给药1次,治疗周期持续14 d。每3 d记录1次裸鼠体质量、肿瘤体积大小(瘤体积=长宽2/2)、治疗结束后取裸鼠心、肝、脾、肺、肾
23、组织行HE染色,称瘤质量。动物研究经蚌埠医学院实验动物教学与研究委员会批准(伦动科批字2022第177号)。1.13 统计学方法采用Graphpad Prism 7.0软件对实验结果进行分析,数据以均数标准差表示,采用单因素方差分析检验实验组间差异,P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 阿美替尼抑制SH-SY5Y细胞增殖和存活给予SH-SY5Y细胞不同浓度阿美替尼培养24、48、72 h后,每孔加入10 LCCK-8,结果显示随着药物浓度和给药时间的增加,SH-SY5Y细胞存活率下降,阿美替尼作用于SH-SY5Y细胞24、48、72 h的IC50分别为5.004、3.728、3.2
24、28 mol/L(图1A)。集落克隆结果显示阿美替尼能够抑制SH-SY5Y细胞集落形成(图1B);给予不同浓度阿美替尼处理24 h后,通过显微镜观察SH-SY5Y细胞形态与密度,与对照组相比,给药组细胞皱缩、细胞密度明显降低(图1C)。2.2 阿美替尼诱导SH-SY5Y细胞凋亡给予SH-SY5Y细胞不同浓度阿美替尼处理24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,结果表明:与对照组相比,随着阿美替尼给药浓度的增加,SH-SY5Y细胞凋亡率增加,差异具有显著性(P0.05,图2A、B);透射电镜结果表明:相比于对照组,阿美替尼处理后SH-SY5Y细胞内观察到染色质凝集于核膜周围,细胞发生凋亡A24 h4
25、8 h72 h100806040200Cell viability(%)00.125 0.250.5124816Aumolertinib(mol/L)*图1 阿美替尼抑制SH-SY5Y细胞增殖和存活Fig.1 Aumolertinib inhibits proliferation and survival of SH-SY5Y cells.A:CCK-8 assay.B:Colony-forming assay.C:MorphologicalchangesofSH-SY5Ycells.*P0.01vscontrol.BC0248Aumolertinib(mol/L)200 mhttp:/www
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