超声辅助双水相提取蓝莓花色苷工艺优化及其抗肿瘤活性研究.pdf
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1、182023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏收稿日期:2022-10-12基金项目:山西省高等学校科技创新项目(2019L1012);山西药科职业学院教科研课题(2022101)。作者简介:杨兆艳(1981-),女,硕士研究生,研究方向:食品功能性活性成分。*通信作者:卢洪秀(1982-),男,硕士研究生,研究方向:农业环境保护。超声辅助双水相提取蓝莓花色苷工艺优化 及其抗肿瘤活性研究杨兆艳1,田艳花1,卢洪秀2,*(1.山西药科职业学院食品工程系,太原 030031;2.上海农林职业技术学院生物医药与健康系,上海 201600)摘 要:采用超声辅助双水
2、相提取蓝莓花色苷,通过单因素实验和正交实验确定最佳的提取工艺;采用MTT 法测定蓝莓花色苷提取物(Blueberry anthocyanins extracts,BAEs)对 HepG2 细胞存活率的影响;利用Hoechst 33342 对 HepG2 细胞进行染色,通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态;采用流式细胞分析仪测定不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡率和胞内 ROS 水平的影响。结果表明超声辅助双水相提取蓝莓花色苷最优工艺条件为:超声功率 300 W、乙醇体积分数 24%、硫酸铵质量分数 18%、料液比(130)g/mL 和提取时间 60 min。在此条件下,花色苷得率为(2.
3、140.05)mg/g。此外,BAEs 可显著抑制 HepG2 细胞存活率、提高细胞核的荧光强度、细胞凋亡率和胞内 ROS 水平,进而发挥较好的抗肿瘤活性。本研究结果为花色苷提取提供一种具有发展潜力的提取方式,并为天然抗肿瘤药物的开发提供重要的物质基础。关键词:超声辅助双水相提取;蓝莓;花色苷;工艺;抗肿瘤活性中图分类号:TS202.1 文献标识码:A 文章编号:1006-2513(2023)09-0018-09doi:10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.003Optimization of ultrasound assisted aqueous two-phas
4、e extraction of anthocyanins from blueberry and its antitumor activityYANG Zhaoyan1,TIAN Yanhua1,LU Hongxiu2,*(1.Food Engineering Department of Shanxi Pharmaceutical Vocational College,Taiyuan 030031;2.Department of Biomedicine and Health,Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry,Shang
5、hai 201600)Abstract:Anthocyanins from blueberry were extracted by ultrasound assisted aqueous two-phase extraction method.The single factor and orthogonal experiments were applied to optimize the extraction process.The MTT assay was used to evaluate the effect of blueberry anthocyanins extracts(BAEs
6、)on the survival rate of HepG2 cells.HepG2 cells were stained with Hoechst 33342 and observed by laser confocal microscope.The effects of different concentrations of BAEs on the apoptosis rate in HepG2 cells and ROS levels were determined by flow cytometry.It was found that the optimum extraction co
7、nditions were:ultrasound power 300 W,ethanol concentration 24%,ammonium sulfate mass fraction 18%,material to liquid ratio(130)g/mL,and extraction time 60 min.Under these conditions,the yield of 192023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏anthocyanins was(2.140.05)mg/g.In addition,BAEs could significa
8、ntly inhibit the survival rate of HepG2 cells,improve fluorescence intensity of the nucleus,the rate of apoptosis and the levels of intracellular ROS.Therefore,it had antitumor activity.The results provide a potential method for anthocyanin extraction and an important reference for the development o
9、f natural antitumor drugs.Key words:ultrasound assisted aqueous two-phase;blueberry;anthocyanins;process;antitumor activity蓝莓属于杜鹃花科的越桔属,呈现诱人的蓝色,具有较高的医学和营养价值,主要种植在美国、俄罗斯、意大利、日本和我国的东北及新疆地区1。大量研究表明蓝莓中富含花色苷、多酚、蛋白、多糖、维生素和各种氨基酸等活性成分,深受广大消费者的喜爱2-3。目前,蓝莓花色苷作为天然营养素被用于药品、保健品和化妆品等领域中。大量研究表明花色苷可以有效清除过量自由基,具有较好的
10、抗氧化活性,同时具有抑制肿瘤细胞凋亡和增殖;此外,花色苷还可以抑制促炎因子的分泌,并对心脑血管具有一定的预防和治疗作用4-6。因此,为深入开发和利用花色苷,快速高效提取蓝莓花色苷是至关重要的。目前,主要采用传统的溶剂提取法对天然花色苷进行提取,该方式无需特殊设备、提取成本低和操作便捷。但该方式萃取效率低、耗时长、溶剂消耗量大、挥发性的溶剂会造成环境污染,无法满足我们高效提取花色苷的需求7。为了提高花色苷得率,一些具有发展潜力的提取方式被提出,如超声提取、微波提取、酶提取和超临界CO2提取8。微波辅助提取效率高和过程易控制,但微波选择性加热会造成萃取体系产生局部高温,导致花色苷大量降解。因此,该
11、技术没有被广泛应用于工业上大规模提取花色苷9。超声辅助提取可有效破裂植物细胞壁,降低传质阻力和提高扩散系数,达到强化提取活性成分的目的10。该方式通常联合其它提取技术达到高效提取活性成分的目的。酶辅助提取是依据酶专一性的特点,有效降解植物细胞壁的成分,导致细胞壁被破坏,达到强化提取活性成分的效果。但是酶易受外界提取条件的影响,造成酶失活变性,失去原有的催化活性11。因此,该技术目前还处于实验室阶段。超临界 CO2辅助提取是利用超临界流体具有很强的溶解性,使更多的活性成分溶解在超临界流体中,实现强化提取活性成分的目的12。但该技术对设备要求高、提取成本大,不利于活性成分的大规模提取。随着科学技术
12、的不断发展,提取技术也有了新的突破。近年来双水相提取技术作为一种绿色高效的提取分离技术在天然产物领域中被广泛关注。该技术提取成本低、提取条件温和、提取体系易构建及可用于连续提取天然活性成分等优势13。因此,该技术已被广泛应用不同种类的天然产物的提取当中。但利用双水相提取蓝莓花色苷的报道相对较少。因此,本研究在超声辅助提取的技术上,再利用双水相作为提取溶剂快速提取蓝莓中的花色苷。此外,对利用超声辅助双水相提取后所得的蓝莓花色苷提取物的抗肿瘤活性的研究报道有限。因此,本文采用超声辅助双水相提取技术提取蓝莓中的花色苷。首先研究 5 个实验因素对花色苷得率的影响;在此基础上,通过正交实验优化蓝莓花色苷
13、的提取工艺;采用 MTT 法、激光共聚焦显微镜观察和流式分析法探究不同剂量的蓝莓花色苷提取物(Blueberry anthocyanins extracts,BAEs)对 HepG2 细胞的抗肿瘤活性的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂蓝莓:2021 年 8 月采摘于黑龙江小兴安岭;矢车菊-3-葡萄糖苷(Cyaniding-3-glucoside,C3G)标准品(纯度 99%):天津质保科技有限公司;人肝癌 HepG2 细胞:北京协和细胞库;DMEM 和 PBS:广东志明生物科技有限公司;MTT:武汉艾美捷科技有限公司;DMSO:中国医药生物科技有限公司;青霉素/链霉素:北京盖德生物科技有
14、限责任公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡:浙江顺达生物科技有限公司;盐酸、无水乙醇、硫酸铵和醋酸钠(分析纯):山东诺蓝环保科技有限公司。202023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏1.2 仪器与设备TL-650CT 超声提取仪:江苏天翎仪器有限公司;GBYS-7 CO2恒温培养箱:河北慧采科技有限公司;DR-200B 全自动酶标分析仪:无锡华卫德朗仪器有限公司 AXTG16G 高速离心机:盐城市安信实验仪器有限公司;ZQZY-78AV恒温培养振荡器:常州金坛良友仪器有限公司;RE-3000ABE 旋转蒸发仪:南北仪器有限公司;TF-SFD-
15、40E 冷冻干燥机:上海拓纷设备有限公司;HW-STORM 流式细胞分析仪:大连华微生命科技有限公司;4XB-3 倒置显微镜:济南方圆试验仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 样品前处理实验前首先将蓝莓除杂、清洗、打浆、然后将果浆置于真空冷冻干燥中直至冻干为止,随后将其粉碎,过 40 目筛,获得蓝莓果粉,在-18 冰箱中保存备用。1.3.2 蓝莓花色苷提取物的制备依据许丹妮等14制备乙醇-硫酸铵双水相体系。在预实验的基础上,准确称取 5 g 蓝莓果粉,然后加入制备好的双水相体系,将其充分混合,然后置于超声辅助提取仪中,通过仪器的控制面板设定超声功率和超声时间,提取结束后,待两相分配达到平衡后,
16、收集上相溶液,将其离心(8000 r/min,20 min),一部分取上清液用于测定蓝莓花色苷得率;另一部分上清液通过旋转蒸发仪除去多余溶剂,然后将其置于冷冻干燥机中冻干,制得蓝莓花色苷提取物(Blueberry anthocyanins extracts,BAEs)。1.3.3 花色苷含量测定采用 pH 示差法测定不同提取条件下花色苷得率,依据杨兆艳15的方法并稍作改动。依据式(1)计算样品中花色苷得率。mVDFMAAAAcwnmnmnmnm11000pHpH5.47005200.1700520 1001%/细胞存活率010AAA (1)1.3.4 单因素实验本研究选择超声辅助双水相提取法作
17、为蓝莓花色苷的提取方法,操作同 1.3.2。在前期预实验的基础上,本研究设定超声功率为 100、200、300、400、500 W 5 个水平;乙醇体积分数为18%、20%、22%、24%、26%5 个水平;硫酸铵质量分数为 16%、18%、20%、22%、24%5 个水平;料 液 比 为(110、120、130、140、150)g/mL 5 个水平;提取时间为 20、40、60、80、100 min 5 个水平,每个实验重复 3 次,结果用平均值 标准差表示。1.3.5 正交实验依据单因素实验,本研究选择超声功率(A)、乙醇体积分数(B)和硫酸铵质量分数(C)作为实验因素,以花色苷得率为目标
18、值。设计 L9(33)正交实验,正交实验设计及因素水平编码如表 1 所示。1.3.6 HepG2 细胞培养将 HepG2 细胞接种于 DMEM 培养基中,并加入含 10%FBS 和 1%双抗(青霉素/链霉素),然后放于 37、5%CO2恒温培养箱中培养。当细胞铺满培养皿底 70%80%时,将细胞传代,利用对数期 HepG2 细胞进行后续实验研究。1.3.7 HepG2 细胞活力测定将对数期 HepG2 细胞按照细胞密度为 5104个/孔接种于 96 孔板中,每孔 200 L,在恒温培养箱中培养 24 h,待细胞贴壁时,弃上清,然后加入含不同质量浓度 BAEs(在最优工艺条件下得到的 BAEs)
19、的 DMEM,分别培养 24、48、72 h,设置 BAEs 浓度分别为 0 g/mL(对照组)、低剂量组(25 g/mL)、中剂量组(50 g/mL)和高剂量组(100 g/mL),每个浓度设置 6 个复孔。依据表 1 超声辅助双水相提取蓝莓花色苷的 L9(33)正交实验因素及水平Table 1 L9(33)orthogonal experimental factors and levels of ultrasound assisted aqueous two-phase anthocyanins extraction from blueberry水平因素A 超声功率/WB 乙醇体积分数/%
20、C 硫酸铵质量分数/%130020162400221835002420212023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏MTT 法测定 HepG2 细胞存活率,操作步骤严格遵守试剂说明。最后利用酶标仪在 490 nm 处测定其吸光值,依据式(2)计算细胞存活率16。1001%/细胞存活率010AAA(2)式中:A0为空白组的吸光度;A1为样品处理组的吸光度。1.3.8 Hoechst 33342 染色细 胞 按 照 步 骤 1.3.7 进 行 处 理,然 后 向HepG2 细胞加入 1 mL 4%甲醛固定 10 min,随后加入 Hoechst 33342(1
21、 mL/孔),在避光条件下染色 20 min,染色结束后,利用 PBS 缓冲液洗涤 3次。最后采用激光扫描共聚焦显微镜观察 HepG2细胞核的染色情况。1.3.9 不同质量浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡率和胞内 ROS 水平的影响将对数期 HepG2 细胞(2105个/孔)接种于 6 孔板,2 mL/孔,在 37、5%CO2条件下培养 24 h,待细胞贴壁后,按照 1.3.7 给药方式加入 BAEs,在恒温培养箱中将其培养 48 h,收集细胞,然后用 PBS 洗涤 2 次。分别取 5104个 HepG2 细胞,其余步骤参考文献15,最后通过流式细胞分析仪检测 HepG2 细胞凋亡率。
22、采用同样的方式处理 HepG2 细胞,随后每孔加入终浓度 5 mol/L DCFH-DA 荧光探针,在避光条件下反应 20 min,吸取探针,利用 PBS 洗涤2 次处理后的细胞,然后采用胰蛋白酶将其消化,弃上清液,然后利用 PBS 重悬,最后通过流式细胞分析仪测定样品荧光强度。2 结果与分析2.1 单因素对蓝莓花色苷得率的影响双水相法提取蓝莓花色苷的单因素实验结果如图 1 所示。1002003004005000.60.81.01.21.41.61.82.0e花色苷得率/(mg/g)超声功率/WAabcd18202224260.60.81.01.21.41.61.82.0cb乙醇体积分数/%a
23、dd花色苷得率/(mg/g)B16182022240.60.81.01.21.41.61.82.0硫酸铵质量分数/%花色苷得率/(mg/g)Cabcde0.60.81.01.21.41.61.82.0aa1:501:401:301:20料液比/(g/mL)1:10abc花色苷得率/(mg/g)D204060801000.60.81.01.21.41.61.82.0提取时间/minaaabc花色苷得率/(mg/g)E图 1 提取因素对蓝莓花色苷得率的影响Figure 1 Effect of extraction factors on the yield of blueberry anthocya
24、nins222023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏由图 1A 可知,当超声功率低于 300 W 时,超声功率越大,花色苷的得率越高,当超声功率在300 W 时,花色苷得率取得最大值 (1.890.04)mg/g。这种现象归因于超声功率越大,将会加速蓝莓细胞壁破裂,强化花色苷提取,进而提高花色苷得率15。但过高的超声功率会破坏花色苷的结构,造成花色苷大量降解,不利于花色苷的提取。该结果与 Xue 等17在探究超声提取树莓酒渣花色苷的结果一致。综上本研究选择超声功率200、300、400 W 三个水平进行正交实验。由图 1B 可知,当乙醇体积分数在 18%
25、22%范围内,乙醇体积分数越高,花色苷得率越大。分析可能的原因是上相中乙醇体积分数越高,在有机相中花色苷具有较高的溶解度和扩散系数,从而提高花色苷得率18。但上相中乙醇体积分数过高,会造成过多的杂质被溶解,进而引起花色苷在有机相中的溶解度降低,最终导致花色苷得率降低19。该研究结果与许丹妮等14采用双水相提取葡萄皮渣花色苷的结果一致。综上本研究选择乙醇体积分数 20%、22%、24%三个水平进行正交实验。由图 1C 可知,硫酸铵质量分数低于 20%时,硫酸铵质量分数越高,花色苷得率越大,即硫酸铵质量分数与花色苷得率呈正相关。在硫酸铵质量分数为 20%时,花色苷得率取得最大值 (1.910.05
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