超声辅助酶法提取黄刺浆果总黄酮的工艺优化及其生物活性研究.pdf

2023年第36 卷第9 期超声辅助酶法提取黄刺浆果总黄酮的工艺优化及其生物活性研究邓永蓉，马贺，韩丽娟，院珍珍，岳庆明（1.青海大学农牧学院，青海西宁8 10 0 16；2.青海大学省部共建三江源生态与高原农业国家重点实验室，青海西宁8 10 0 16)摘要：采用超声辅助酶法提取黄刺浆果总黄酮。在单因素试验的基础上,通过响应面法优化黄刺浆果总黄酮的提取工艺,并评价总黄酮对DPPH自由基的清除能力、对-淀粉酶活性和-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。结果表明：最佳提取工艺为纤维素酶添加量6%（以黄刺浆果质量计）、酶解温度41、超声时间2 5min、甲醇体积分数7 0%、料液比1:2 5（g/mL）。在此条件下，黄刺浆果总黄酮得率为(2 2.530.18)mg/g。黄刺浆果总黄酮对DPPH自由基的ICso为1.9 0 mg/mL、对-淀粉酶活性和-葡萄糖苷酶活性的ICso分别为11.0 0、10.0 9 mg/mL,表明黄刺浆果总黄酮具有较强的生物活性。关键词：黄刺浆果；总黄酮;提取工艺；生物活性Study on the optimization of ultrasound-assisted enzymaticextraction process of total flavonoids from berry ofBerberis dasystachya and its bioactivityDENG Yong-rong,MA He,HAN Li-juan-,YUAN Zhen-zhen,YUE Qing-ming(1.College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining 810016,Qinghai,China;2.Provincial-Ministry Jointly Established State Key Laboratory of Sanjiangyuan Ecology andPlateau Agriculture Jointly Built by Qinghai University,Xining 810016,Qinghai,China)Abstract:Total flavonoids from berry of Berberis dasystachya was extracted by ultrasound-assisted enzy-matic method.The extraction process of total flavonoids from berry of Berberis dasystachya was optimizeby response surface methodology on the basis of single factor experiments,and the scavenging ability oftotal flavonoids on DPPH free radicals and the inhibitory effect on-amylase activity and-glucosidaseactivity were evaluated.The results showed that the optimal process was as follows:cellulase addition 6%(based on the mass of berry of Berberis dasystachya),enzymatic hydrolysis temperature 41,u l t r a s o u n dtime 25 min,methanol volume fraction 70%,and solid-liquid ratio 1:25(g/mL).Under these condi-tions,the yield of total flavonoids from berry of Berberis dasystachya was(22.53 0.18)mg/g.The ICsoof total flavonoids from berry of Berberis dasystachya on DPPH free radical was 1.90 mg/mL,and theICsoof it on-amylase activities and-glucosidase activities were 11.00 and 10.09 mg/mL,respective-ly,indicating the total flavonoids from berry of Berberis dasystachya had strong biological activity.Key words:berry of Berberis dasystachya;total flavonoids;extraction process;bioactivity中图分类号：TS201.1黄刺又名直穗小檗，属于小檗科小檗属落叶灌粮食与油脂文献标志码：A文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)0 9-0 10 5-0 6木 ,其根茎中含有小檗碱,果实为红色且呈椭圆105收稿日期：2 0 2 2-0 4-16基金项目：国家自然科学基金项目（319 6 0 0 8 8）作者简介：邓永蓉（19 9 8 一），女，硕士，研究方向为青藏高原特色生物资源及功能性食品研发。通信作者：韩丽娟（19 8 8 一），女，博士，副教授，研究方向为青藏高原特色生物资源及功能性食品研发。106形。作为青藏高原独特的药食同源浆果，黄刺果实富含黄酮、多糖、植物笛醇、有机酸、多酚等多种活性物质2-3。酶解法是1种新型、绿色的提取方法,具有快速高效、反应温和、无副产物等优点。本研究采用超声辅助酶法提取黄刺浆果中的总黄酮,利用响应面法优化提取条件，同时评价总黄酮对DPPH自由基清除能力及对-淀粉酶活性和-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,以期为黄刺浆果的综合利用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂黄刺浆果，采自青海大通；芦丁，金客隆北京生物技术有限公司;-淀粉酶（350 万U/mg）、纤维素酶（35 U/mg）、-葡萄糖苷酶（50 U/mg）,南京都莱生物技术有限公司;DPPH,梯希爱上海化成工业发展有限公司；阿卡波糖，天津市化学试剂批发公司;对硝基苯-D-葡萄糖苷（PNPG）,天津市天力化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。1.2仪器与设备PPT-A200电子天平，华志（福建）电子科技有限公司;S-3CpH计，上海佑科仪器仪表有限公司；HHS4S恒温水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂;KQ-300E台式超声波清洗器，东莞市科桥超声波设备有限公司;R-1001VN旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司;UV-1780紫外可见分光光度计，岛津仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1黄刺浆果总黄酮提取工艺将黄刺浆果去籽冷冻干燥后粉碎过0.42 0 mm筛,得黄刺浆果粉，于4保存备用。称取1g黄刺浆果粉，添加纤维素酶5%（以黄刺浆果质量计），按一定料液比加人体积分数7 0%甲醇溶液，用乙酸钠-乙酸缓冲溶液调节pH至4.7,并在50 下酶解1h,酶解完成后沸水浴5min进行灭酶处理。待其冷却至室温后加人体积分数7 0%甲醇，在40 条件下超声提取45min。抽滤得到的提取液用旋转蒸发仪在45条件下减压浓缩。浓缩后的提取液用体积分数7 0%甲醇定容至50 mL,即得黄刺浆果总黄酮提取液。1.3.2总黄酮含量的测定1.3.2.1芦丁标准曲线参考文献4-5 的方法，于波长510 nm处分别测粮食与油脂定吸光度,得到芦丁质量浓度（X,mg/mL）与吸光度（Y)的标准曲线方程为Y=10.09256X+0.004469，(R=0.999 5)。1.3.2.2总黄酮得率测定用1mL总黄酮提取液代替芦丁标准液,其他与1.3.2.1步骤相同。于波长510 nm处测定吸光度，代入芦丁标准曲线，总黄酮得率计算见式（1）。R=P xNxVm式中:R为黄刺浆果总黄酮得率,mg/g;p为黄刺浆果总黄酮的质量浓度,mg/mL;N为稀释倍数；V为黄刺浆果总黄酮提取液的体积,mL;m为黄刺浆果粉质量，%。1.3.3单因素试验在纤维素酶添加量5%（以黄刺浆果质量计）、酶解温度50、超声时间45min、甲醇体积分数70%、料液比1：2 5（g/mL）的条件下，进行单因素试验，分别考察纤维素酶添加量、酶解温度、超声时间、甲醇体积分数、料液比对黄刺浆果总黄酮得率的影响。1.3.4响应面试验在单因素试验的基础上，以纤维素酶添加量（A）、酶解温度（B）、超声时间（C)和甲醇体积分数(D)为自变量,以黄刺浆果总黄酮得率(Y)为响应值进行响应面试验设计。因素水平见表1。表1响应面试验因素水平表因素水平A纤维素酶添加量/%-1405161.3.5生物活性测定1.3.5.1黄刺浆果总黄酮对DPPH自由基清除能力的测定参考王杰等6 的方法,并作部分修改。将提取的总黄酮溶液浓缩并放入烘箱进行干燥，得到总黄酮粗品。移取不同质量浓度黄刺浆果总黄酮溶液2mL,再加人2 mL0.05mg/mLDPPH溶液,避光反应30 min后，以甲醇作参比，于波长517 nm处测定吸光度，以相同质量浓度的抗坏血酸为阳性对照进行上述操作。DPPH自由基清除率计算见式(2）。DPPH 自由基清除率=(1-(2)Ao2023年第36 卷第9 期(1)B酶解C超声D甲醇体积温度/时间/min305401550251 _ A,-A2)100%分数/%5060702023年第36 卷第9 期式中:A。为DPPH+甲醇的吸光度;A,为DPPH+总黄酮的吸光度;A2为甲醇+总黄酮的吸光度。1.3.5.2黄刺浆果总黄酮对-淀粉酶活性抑制能力的测定参考程艳刚等7 的方法，并作部分修改。用0.1mol/LpH6.8磷酸缓冲溶液将黄刺浆果总黄酮粗品配制成不同质量浓度的样品溶液，取样品溶液与3.7 5U/mL-淀粉酶溶液各2 5L,于37 反应30min，加入质量分数0.5%淀粉溶液2 5L，于37反应10 min后,加入3,5-二硝基水杨酸溶液(DNS)125L,沸水浴5min,冷却至室温后于波长540nm处测定吸光度。以相同质量浓度的阿卡波糖作为阳性对照，-淀粉酶抑制率计算见式(3）。-淀粉酶抑制率=100%(3)A2式中：A为样品组吸光度；A。为空白组（相同体积的磷酸缓冲溶液代替样品）吸光度;A2为对照组（相同体积的磷酸缓冲溶液代替-淀粉酶)吸光度。1.3.5.3黄刺浆果总黄酮对-葡萄糖苷酶活性抑制能力的测定参考文献8 的方法，并作部分修改。将试验分为空白组、阴性对照组、样品空白组和样品组。用0.1mol/LpH6.8磷酸缓冲溶液将黄刺浆果总黄酮粗品配制成不同质量浓度的样品溶液，在9 6 孔板中加人不同质量浓度样品和0.2 U/mL-葡萄糖苷酶溶液各2 0 L，于37 孵化15min，再加人2.5mmol/L PNPG溶液2 0 L,于37 反应10 min,之后加人1.5mol/LNa,CO，终止液8 0 L,于波长405nm处测定吸光度。以相同质量浓度的阿卡波糖作为阳性对照,样品溶液对-葡萄糖苷酶活性抑制率计算见式（4）。-葡萄糖苷酶抑制率=(式中：A为空白组（相同体积磷酸缓冲溶液代替-葡萄糖苷酶和样品）吸光度;A为阴性对照组（相同体积磷酸缓冲溶液代替样品溶液）吸光度；A为样品空白组（相同体积磷酸缓冲溶液代替-葡萄糖苷酶)吸光度;A4为样品组吸光度。1.4数据处理试验平行测定3次,结果以平均值标准差表示；采用Design-Expert.V8.0.6软件进行Box-Be-hnken响应面试验设计及方差分析；采用Origin2018绘制图像并进行统计分析。粮食与油脂2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1纤维素酶添加量对黄刺浆果总黄酮得率的影响由图1可知：随着纤维素酶添加量的增加,黄刺浆果总黄酮得率先上升后下降，在纤维素酶添加量为5%时,黄刺浆果总黄酮得率最大，为（19.8 50.75)mg/g。当纤维素酶添加量较少时,由于酶浓度低而反应底物较多，酶解反应还未达到饱和状态,反应速率会随纤维素酶添加量的增加而加快；但纤维素酶添加量过多会抑制反应进行，从而使总黄酮得率下降。因此,确定最佳纤维素酶添加量为5%。A-(A-A)21r20F1918F171615-3图1纤维素酶添加量对总黄酮得率的影响2.1.2酶解温度对黄刺浆果总黄酮得率的影响由图2 可知:随着酶解温度的升高,黄刺浆果总黄酮得率先上升后下降,在酶解温度为40 时，黄刺浆果总黄酮得率最大，为（2 1.36 0.6 6）mg/g。这是因为随着酶解温度的升高，酶解速率加快，总黄酮得率上升；但酶解温度过高，可能会引起酶部分失活或完全失活，使反应速率下降，最终导致总黄A4-A100%(4)A2-A10745纤维素酶添加量/%22r20F1816141230图2 酉酶解温度对总黄酮得率的影响64050酶解温度/76070880108酮得率下降。因此,确定最佳酶解温度为40。2.1.3超声时间对黄刺浆果总黄酮得率的影响由图3可知：随着超声时间的延长，黄刺浆果总黄酮得率先上升后总体下降，在超声时间为15min时，黄刺浆果总黄酮得率最大，为（2 0.2 8 0.77)mg/g。在超声15 min 后,黄刺浆果总黄酮得率总体下降，可能是因为长时间超声波影响会破坏总黄酮成分。因此,确定最佳超声时间为15min。22斤201816F工14F12F100图3超声时间对总黄酮得率的影响2.1.4甲醇体积分数对黄刺浆果总黄酮得率的影响由图4可知：随着甲醇体积分数的增加，黄刺浆果总黄酮得率先上升后下降，在甲醇体积分数为60%时，黄刺浆果总黄酮得率最大，为（19.0 9 0.99)mg/g。当甲醇体积分数较低时，甲醇溶剂的极性较大,黄酮易溶于甲醇溶剂里,同时由于酶解的作用使总黄酮的得率逐渐增加；当甲醇体积分数大于6 0%时,抑制酶的作用从而减少了黄刺浆果中黄酮类化合物的溶出。因此，确定最佳甲醇体积分数为 6 0%。2120(3/)/率醒巢1918171615141340图4甲醇体积分数对总黄酮得率的影响粮食与油脂2.1.5料液比对黄刺浆果总黄酮得率的影响由图5可知：随着溶剂用量的增加,黄刺浆果总黄酮得率先上升后总体下降，在料液比为1：25（g/m L)时,黄刺浆果总黄酮得率最大,为(16.8 8 0.72)mg/g。当溶剂用量较少时,黄刺浆果中黄酮类物质未充分溶解于甲醇；但当溶剂用量过多时，在提取过程中形成的空化泡会吸收超声波能量而降低超声作用，不利于黄酮类物质溶出，同时也造成溶剂浪费,增加成本。与其他单因素相比，料液比对总黄酮得率的影响较小。因此,在后续响应面试验中,固定料液比为1:2 5（g/mL）。18r17(8/u)/率醒巢贸1615141020超声时间/min5060甲醇体积分数/%2023年第36 卷第9 期3040705080609013121:10图5料液比对总黄酮得率的影响2.2响应面试验结果响应面试验设计及结果见表2,方差分析结果见表3。表2响应面试验设计及结果试验号A1-12-13-140506170809010011012-11301401501611:20料液比/(g/mL)BC0000-1010000-10-111-10-10100-100-1-100101:25D总黄酮得率/(mg/g)-119.08 0.28120.43 0.30017.29 0.14-116.35 0.37019.58 0.19020.01 0.15-118.86 0.11016.55 0.47117.72 0.26-115.41 0.36117.42 0.62020.30 0.48019.72 0.98015.98 0.50018.66 0.50017.99 0.661:301:401:502023年第36 卷第9 期试验号A17-118119020021122123-1240250260270280291表3响应面试验方差分析方差来源平方和均方自由度F值P值显著性模型106.177.58A1.03B0.320.32C3.33D5.545.54AB1.531.53AC0.750.75AD0.002 5 0.002 5BC0.32 0.32BD0.380.38CD0.0160.016A22.922.92B274.65 74.65粮食与油脂续表极显著；失拟项P0.05,不显著,说明该模型的拟BC10010-100-1000011-1-1101010000141.03113.33111110.006 50910.8511.0010.04117.611194.350.001 0109D总黄酮得率/(mg/g)016.26 0.30022.03 0.68119.97 0.46019.72 0.43016.55 0.64121.17 0.77020.59 0.47015.87 0.68015.52 0.43121.74 0.37-120.88 0.57020.01 0.66-119.72 0.6319.74CAB,即甲醇体积分数 超声时间纤维素酶添加量 酶解温度。黄刺浆果总黄酮最佳提取工艺条件为纤维素酶添加量6%、酶解温度41.10、超声时间2 5min、甲醇体积分数7 0%，此时黄刺浆果总黄酮得率理论值为2 2.7 6 mg/g。考虑到实际操作,调整最佳提取条件为纤维素酶添加量6%、酶解温度41、超声时间2 5min、甲醇体积分数7 0%，在此条件下进行验证实验，得到黄刺浆果总黄酮得率为（2 2.530.18)mg/g,与预测值接近,说明该回归模型准确可靠。2.3黄刺总黄酮生物活性研究2.3.1黄刺浆果总黄酮对DPPH自由基清除能力由图6 可知：随着黄刺浆果总黄酮质量浓度的*增大,黄刺浆果总黄酮对DPPH自由基的清除率逐渐增加,当质量浓度为4mg/mL时，黄刺浆果总黄酮对DPPH自由基的清除率为8 8.36%2.40%，*之后清除率增加平缓。黄刺浆果总黄酮对DPPH 自*由基的ICso为1.9 0 mg/mL,说明黄刺浆果总黄酮溶液对DPPH自由基具有较强的清除能力,但低于抗坏血酸对 DPPH 自由基的清除能力。10080*60*上C2D2残差5.380.38失拟项4.320.43纯误差1.060.27总和111.55R20.951 8RAd0.903 6注：*表示差异显著（P0.05）；*表示差异极显著（P0.01)。根据软件分析得到以黄刺浆果总黄酮得率为目标函数的二次回归模型方程：Y=19.54+0.29A+0.16B+0.53C+0.68D+0.62AB+0.43AC+0.025AD+0.29BC-0.31BD-0.062CD+0.67A-3.39B2+0.28C+0.34D。由表3可知：模型P0.0001,说明该回归模型0.510.510.740.741114104281.341.931.630.266 80.186 90.338 440200图6不同质量浓度黄刺浆果总黄酮对DPPH自由基的清除率2.3.2-淀粉酶活性的抑制作用由图7 可知：随着黄刺浆果总黄酮质量浓度的增大,黄刺浆果总黄酮对-淀粉酶活性的抑制率明显增加。黄刺浆果总黄酮和阿卡波糖对-淀粉酶活性的ICso分别为11.0 0.0.33mg/mL,说明黄刺浆果总黄酮对-淀粉酶活性具有一定的抑制作用,但其抑制作用低于阿卡波糖。一一维生素C一黄刺浆果总黄酮12质量浓度/(mg/mL)3456110%率-0图7 黄刺浆果总黄酮对-淀粉酶活性的抑制作用2.3.3-葡萄糖苷酶活性的抑制作用由图8 可知：随着黄刺浆果总黄酮质量浓度的增大,黄刺浆果总黄酮对-葡萄糖苷酶活性的抑制率随着质量浓度的增大而提高。黄刺浆果总黄酮和阿卡波糖对-葡萄糖苷酶活性的ICso分别为10.09、1.9 5m g/m L,表明黄刺浆果总黄酮对-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用,但其抑制作用低于阿卡波糖。100r80F6040200图8 黄刺浆果总黄酮对-葡萄糖苷酶活性的抑制作用3结论本试验采用超声辅助酶法提取黄刺浆果总黄酮。在单因素试验的基础上，通过响应面法优化黄刺浆果总黄酮的提取工艺,并评价总黄酮对DPPH自由基的清除能力、对-淀粉酶活性和-葡萄糖苷粮食与油脂100酶活性的抑制作用。结果表明：最佳提取工艺为纤维素酶添加量6%（以黄刺浆果质量计）、酶解温度8041、超声时间2 5min、甲醇体积分数7 0%、料液60人40F2002023年第36 卷第9 期比1：2 5（g/mL）。在此条件下,黄刺浆果总黄酮得率为(2 2.530.18)mg/g。黄刺浆果总黄酮对DP-PH自由基的ICso为1.9 0 mg/mL、对-淀粉酶活性阿卡波糖-黄刺浆果总黄酮24681012141618质量浓度/mg/mL)二一阿卡波糖黄刺浆果总黄酮246810121416质量浓度/(mg/mL)和-葡萄糖苷酶活性的ICso分别为11.0 0、10.09mg/mL,表明黄刺浆果总黄酮具有较强的生物活性。本研究可为黄刺浆果黄酮类化合物的研究提供理论依据。参考文献【1向前胜，陈晓远，王宁，等青海省不同地区不同时期3种小檗根部小檗碱含量的比较J江西农业，2 0 17(13):75 77.2 HAN LJ,HAN QQ,YANG YJ,et al.Characterizationand biological activities of seed oil extracted from Berberisdasystachya Maxim.by the supercritical carbon dioxideextraction methodJ.Molecules,2020,25(8):1836.【3】向前胜，王宁，赵越，等.青海省不同纬度小檗属3种植物不同部位小檗碱变化规律研究J西部林业科学,2 0 15,44(2):136-140.【4缪园欣，廖明星，孙爱红，等超声-乙醇法提取铁皮石斛花总黄酮及其体外抗氧化性的研究J中国酿造，2 0 19,38(4)：155-159.【5】傅新凯，周子轩，史小琴，等.响应面法优化超声辅助提取黑种草子抗氧化活性成分J.粮食与油脂，2 0 2 2,35(1):82 86.【6 王杰，王瑞芳，王园，等响应面优化马齿黄酮水提工艺及其抗氧化活性评价J食品与发酵工业,2020,46(19):197-204.7程艳刚，李国艳，谭金燕，等.分心木总黄酮体外抗氧化活性及对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用研究J辽宁中医药大学学报，2 0 18，2 0(8)：2 2-2 5.【8 杨晓绒，张相锋，焦子伟超声辅助纤维素酶解提取大叶驼蹄瓣总黄酮工艺优化及其抑制-葡萄糖苷酶活性研究J伊犁师范学院学报（自然科学版)，2019,13(2):41-49.