成年斑马鱼体肾的微细结构及其外泌体的分布鉴定.pdf
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1、DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2023.070实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)林金杏,浙江大学动物遗传育种与繁殖学博士,现为上海实验动物研究中心研究员,长期从事实验动物质量检测及相关科研工作。目前主要聚焦斑马鱼等新型实验动物生理功能及标准化研究,内容涉及水生实验动物标准化、水生实验动物资源开发与应用、组织和细胞形态学、器官三维重建、生理功能挖掘、疾病模型建立、饲养管理规范、病原体和遗传质量控制等方面。共主持上海市科委项目7项,并多次参加国家级项目的申报和研究工作,获
2、计算机软件著作权3项,出版专著斑马鱼组织细胞学彩色图谱和Color Atlas of Zebrafish Histology and Cytology,以第一作者或通信作者身份在学术期刊上发表实验动物相关论文30余篇,参与起草国家标准和上海市地方标准各1项,获上海市科学技术进步三等奖(第一完成人)1项。陈秋生,南京农业大学教授,博士生导师。中国畜牧兽医学会动物解剖学与组织胚胎学分会常务理事,中国动物学会动物生理生态学分会常务理事,法国科学院博士后,英国皇家兽医学院高级研究员。主要从事动物细胞生物学、实验动物形态生理学和中医经络与针灸机制的研究工作,先后发现并报道了禽类血-脾屏障、洋葱样线粒体与
3、中华鳖精子长期储存机制、中医经络实质的潜在细胞及针灸治疗机制。主持完成国家自然科学基金项目8项,发表SCI论文110篇,部分研究成果以封面论文形式发表并受到国际主流期刊专评,部分成果内容被编入本科教材,出版专著兽医比较组织学等,主编国家规划教材动物组织学与胚胎学,培养博士26名(包括8名留学生)、硕士35名。成年斑马鱼体肾的微细结构及其外泌体的分布鉴定林金杏1,王新栋2,3,白雪兵2,冯丽萍1,谢淑武1,陈秋生2(1.上海实验动物研究中心,上海 201203;2.南京农业大学动物医学院,南京 210095;3.枝江市畜牧兽医服务中心,宜昌 443200)摘要 目的观察和分析斑马鱼体肾的微细结构
4、,并对其分泌的外泌体进行分离鉴定。方法应用光学显微镜和电子显微镜技术系统观察斑马鱼体肾的显微结构和超微结构,用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术检测外泌体粒径大小。结果斑马鱼体肾紧贴并平行于脊椎,肾单位由肾小管和肾小体组成,其中肾小管可细分为近曲小管、远曲小管及颈段 3 种类型,肾小体由肾小球和肾小囊构成;经高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色后,可见近曲小管富含糖原颗粒,其游离面有明显的刷状缘结构。透射电子显微镜下,在肾小管的管腔观察到外泌体分布,上皮细胞游离面的胞质有少量多囊泡体和大量的晚期内涵体分布
5、,肾小管的顶端和肾小球足细胞中亦观察到少量多囊泡体分布。通过CD9、CD63和TSG101免疫组织化学和免疫荧光检测显示,多囊泡体及其外泌体在肾小管管腔的游离面高表达,在肾小体和管腔内表达较弱。NTA和透射电子显微镜观察结果显示,分离获得的斑马鱼体肾外泌体呈茶托状,粒径众数为144.4 nm,符合外泌体形态和直径大小特征。结论斑马鱼体肾具有哺乳动物肾脏的典型结构,为体内的泌尿器官。肾小管具有分泌外泌体的能力,其形成是多囊泡体向细胞游离面释放到胞外的过程。本研究结果为水生实验动物泌尿器官的功能研究及相关模型的开发应用奠定了形态学基础。关键词 斑马鱼;体肾;外泌体;多囊泡体中图分类号 Q95-33
6、;Q174 文献标志码 A 文章编号 1674-5817(2023)05-0531-10 研究报告 Research Reports基金项目 上海市科技计划项目“上海市水生实验动物专业技术服务平台”(22DZ2291200);上海市科研计划项目“斑马鱼器官形态参数完善与立体重构整合”(16140904300)第一作者 林金杏(1983),女,博士,研究员,研究方向:水生实验动物生理功能及标准化研究。E-mail:。ORCID:0000-0002-7649-9552;通信作者 陈秋生(1963),男,博士,教授,研究方向:动物组织细胞形态及功能研究。E-mail:。ORCID:0000-0002
7、-6087-7029531实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)Fine Structure of the Trunk Kidney and Distribution of Its Secreted Exosomes in the Adult ZebrafishLIN Jinxing1,WANG Xindong2,3,BAI Xuebing2,FENG Liping1,XIE Shuwu1,CHEN Qiusheng2(1.Shanghai Laboratory Animal Research Cen
8、ter,Shanghai 201203,China;2.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;3.Zhijiang Animal Husbandry and Veterinary Service Center,Yichang 443200,China)Correspondence to:LIN Jinxing(ORCID:0000-0002-7649-9552),E-mail:;CHEN Qiusheng(ORCID:0000-0002-6087-7029),E-m
9、ail:ABSTRACT Objective To observe the fine structure of the trunk kidney in zebrafish,and to identify its secreted exosomes.Methods The microstructure and ultrastructure of the trunk kidney in zebrafish were observed by light microscopy and electron microscopy,and the particle size of exosomes was d
10、etected by nanoparticle tracking analysis(NTA).Results The trunk kidney was close and parallel to the spine in adult zebrafish.The nephron consisted of renal tubules and renal corpuscles.The renal tubules could be further divided into three types:proximal convoluted tubules,distal convoluted tubules
11、,and cervical segments.The renal corpuscles were composed of glomerulus and renal capsules.The periodic acid-Schiff(PAS)staining results revealed that there were abundant glycogen granules in the proximal convoluted tubules,with brush-like outline in the apical surface of epithelial cells.Under tran
12、smission electron microscopy(TEM),there were exosomes distributed in the lumen of renal tubules,with numerous late endosomes and few number of multivesicular bodies(MVBs)in the cytoplasm of the epithelial cells concentrating on the apical side.Meanwhile,MVBs were also distributed in the apical regio
13、ns of the renal tubules and the podocytes of the renal glomeruli.Immunohistochemical staining results showed that CD9,CD63 and TSG101 were strongly expressed in the lumen surface of the renal tubules,but weakly expressed in the corpuscles and lumen.NTA and TEM results showed that the exosomes isolat
14、ed from zebrafish trunk kidney were saucer-like outline,and the particle size mode was 144.4 nm,which was consistent with the characteristics of morphological futures of exosome.Conclusion The zebrafish somatic kidney has the typical structure of the mammalian kidney and is the urinary organ in the
15、body.The renal tubules have the ability to secrete exosomes,and their formation is a process of releasing poly-vesicles to the free surface of epithelial cells into the extracellular space.This study laid a morphological foundation for further study of exosomes in urinary function in aquatic experim
16、ental animals as well as the development and application of related models.Key words Zebrafish;Trunk kidney;Exosome;Multivesicular body21 世纪初期,斑马鱼被美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)列为继小鼠和大鼠之后第三大常用的实验动物,并倡导斑马鱼作为研究脊椎动物发育、生理学和疾病的模式生物1。斑马鱼素有“水中小白鼠”之称,具有快速发育、胚胎透明、适用于高通量筛选、易于显微操作等优势和特点,被广泛用于发育生物
17、学和新药开发的研究2-3。近30年来,国内外斑马鱼的研究得到了飞速发展,截至2023年 9 月,在国际斑马鱼模式生物数据库(zebrafish information network,ZFIN)中注册的实验室已逾1 600个。我国已成为继美国之后的第二大斑马鱼研究大国,在发育调控、疾病模型、药物筛选、环境监测等方面开展了卓有成效的研究工作4。2020年发布实施的国家标准 实验动物 实验鱼质量控制(GB/T 396492020)规定了适用于斑马鱼、剑尾鱼和诸氏鲻虾虎鱼的种质、遗传、微生物和寄生虫、饲料、环境设施的质量控制及其监测方法5,进一步推进了以斑马鱼为代表的水生实验动物的标准化发展和应用开
18、发进程。作为一种新兴的实验动物资源,与常用的啮齿类实验动物相比,斑马鱼体内组织器官微细结构的系统性资料尚不完整。肾脏是脊椎动物体内重要的器官,它不仅能排泄体内产生的代谢废物,还能调节血液中532实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)钠、钾、钙、氯等离子及物质的浓度,维持机体正常酸碱平衡和渗透压稳定6。与大多数脊椎动物一样,斑马鱼的肾脏起源于中胚层,其发育经历前肾(又称头肾)和中肾两个阶段。在斑马鱼的胚胎和幼鱼阶段,头肾是具有排泄功能的功能性泌尿器官;斑马鱼成年后,头肾转变为具有造血和免疫功能的免疫器官
19、,与肾脏的中后段界限分明。肾脏的中段和后段合称为体肾,为具有排泄功能的泌尿器官7。目前对成年斑马鱼体肾的微细结构还鲜有报道。外泌体(exosome)具有脂质双分子层结构,直径约30150 nm,呈杯形或双凹碟形,广泛存在于乳汁、精液、汗液、尿液等体液中,可携带众多的生物信号分子,在机体生理和病理过程中均发挥重要作用8-9。本课题组前期研究结果表明,斑马鱼的肠道吸收细胞、杯状细胞、淋巴细胞和高内皮细胞中均有外泌体分布,提示斑马鱼是开展肠道外泌体研究的理想模型10-11。近年来,外泌体研究领域正在迅速扩大,其内容和功能取决于起源细胞以及它们产生的条件12。近期研究显示,外泌体参与急性肾损伤、肾间质
20、纤维化、多囊肾病、糖尿病肾病、肾脏细胞癌等多种肾脏相关疾病的发生发展进程,既是关键的信号介质,也是潜在的生物标志物,在疾病诊断与治疗方面显示出独特优势13-14。但关于外泌体在肾脏中的生物发生、释放机制及生物学功能尚处于初步研究阶段,亟需一种典型的动物模型来揭秘其中的科学内涵。本研究选用斑马鱼为实验动物,首先通过光镜和透射电子显微镜解析体肾的微细结构,免疫组织化学(immunohistochemistry)和免疫荧光(immunofluorescence)法观察体肾外泌体的分泌情况,并通过纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)和透射电子显微
21、镜鉴定体肾外泌体,为推进以斑马鱼为代表的水生实验动物替代高等哺乳动物进行相关生命科学研究提供科学依据,也为其他动物泌尿系统的科学研究提供组织细胞学参照。1材料与方法1.1实验动物选用612月龄成年AB系野生型斑马鱼(Danio rerio),雌、雄各半。实验用斑马鱼来源于上海实验动物研究中心,饲养于独立水生动物养殖系统 SYXK(沪)2019-0004,饲养温度(280.5),室内光照明暗周期为 14 h10 h,NaHCO3调节水体 pH 7.07.5,电导率500550 S/cm,每日上、下午各喂食一次。取材前12 h禁食,使用160 mg/L MS-222(美国Sigma公司)浸浴麻醉斑
22、马鱼,鳃动完全停止约1 min即确认麻醉后取样。所有实验方案均经上海实验动物研究中心实验动物管理和伦理委员会(IACUC)审查批准(批准号:160812002)。1.2主要试剂和仪器主要试剂包括CD9、CD63和TSG101兔多克隆抗体购自南京华安生物有限公司,即用型羊抗兔二抗、BSA封闭液和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,荧光羊抗兔二抗购自英国Abcam公司,外泌体提取纯化试剂盒(UR52141)购自上海宇玫博生物科技有限公司,DAPI染液购自上海碧云天生物技术有限公司。此外,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)试剂、多聚甲醛、乙醇、二甲
23、苯、丙酮、过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)试剂、PBS、枸橼酸、H2O2、戊二醛、锇酸、柠檬酸铅、醋酸铀和草酸双氧铀等化学试剂购自国药集团。主要仪器包括体视显微镜(Stemi 508,德国Zeiss公司)、切片机(RM2015,德国Leica公司)、光学显微镜(BH-2,日 本 Olympus 公 司)、病 理 切 片 扫 描 成 像 系 统(ScanScope,美国Aperio公司)、透射电子显微镜(H-7650,日本 Hitachi 公司)、纳米颗粒跟踪分析仪(NanoSight NS300,英国Malvern Panalytical公司)。1.3光镜样品制
24、备与观察将斑马鱼用MS-222麻醉后,迅速取出肾脏并分离体肾。体肾经生理盐水(即0.65%NaCl溶液)漂洗后,放入质量分数4%的多聚甲醛溶液固定48 h,梯度乙醇脱水,石蜡包埋,用切片机进行5 m切片,然后进行常规HE染色或PAS糖原染色,中性树脂封片后观察并拍照。1.4电子显微镜样品制备与观察将剥离的斑马鱼体肾置于4 预冷的2.5%戊二醛溶液中固定24 h,PBS清洗后,1%锇酸后固定1 h,梯度乙醇脱水,丙酮置换乙醇后环氧树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀及柠檬酸铅双重染色,透射电子显微镜观察体肾超微结构并拍照。1.5免疫组织化学和免疫荧光染色将斑马鱼体肾石蜡切片经二甲苯脱蜡后,梯度乙醇脱
25、水,0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)97 水浴修复,5%BSA封闭,一抗(PBS稀释为1501100)孵育(4 过夜),阴性对照以PBS代替一抗,PBS清533实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineOct.2023,43(5)洗。进行免疫组织化学染色的切片用二抗孵育后PBS清洗,DAB显色,苏木精对比染色细胞核后常规水洗、脱水、透明、封片。进行免疫荧光的切片则用荧光素标记的二抗避光孵育后PBS 清洗,DAPI 染色后避光拍照。1.6外泌体提取纯化剥离20尾斑马鱼的体肾至预冷的PBS中,研磨后将样品转移至离心管中,
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