餐厨固废不同温度发酵时段细菌群落结构特征.pdf
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1、宁夏农林科技,Ningxia Journal of Agri.and Fores.Sci.&Tech.2023,64(05):48-54基金项目:宁夏回族自治区重点研发项目“餐厨垃圾资源化利用关键技术研究与工程示范”(2020BFG02001)。作者简介:毛瑞璠(1998),女,河北邢台人,硕士研究生,主要从事农业资源利用研究。*通信作者:毕江涛(1964),男,宁夏中宁人,博士研究生,研究员,主要从事环境微生物研究。收稿日期:2022-05-17修回日期:2022-12-21餐厨固废不同温度发酵时段细菌群落结构特征毛瑞璠1,魏 欣2,朱建伟1,贾渊超1,毕江涛2*1.宁夏大学农学院,宁夏 银
2、川750021;2.宁夏大学生态环境学院,宁夏 银川750021摘要:利用 Illumina NovaSeq PE250 测序平台,通过扩增子测序技术分析餐厨固废细菌群落结构动态变化特征,以期为餐厨垃圾高温快速好氧发酵条件优化提供微生物学依据。将餐厨垃圾固液分离后的固相物料置入高温好氧发酵罐,分别设置不同发酵温度时段,即餐厨垃圾起始发酵阶段(38)、高温发酵阶段(50)、超高温初始阶段(68)、超高温终止阶段(68)和降温阶段(38),并添加一定量的稻壳粉和脱硫石膏等辅料使餐厨固废进行发酵。结果表明,不同发酵阶段细菌群落物种组成在门水平上均以厚壁菌门相对丰度最大,为优势菌门;在属水平上起始发酵
3、阶段至超高温初始阶段以乳酸杆菌属(Lactobacillus)为优势菌属,超高温终止阶段至降温阶段以新生芽孢杆菌属(Novibacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。细菌群落物种多样性分析显示,起始发酵阶段细菌群落丰富度和物种多样性最低,超高温初始阶段和降温阶段细菌群落丰富度和物种多样性分别达到最高;不同发酵阶段细菌群落物种差异分析显示,在细菌门水平上厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroideta)为极显著差异物种(P0.01),在属水平上马杜拉放线菌属(Actino原madura)、罗姆布茨菌属(Rombou
4、tsia)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)为极显著差异物种(P0.01)。不同温度阶段细菌群落物种多样性和物种变化特征可以为餐厨固废高温快速好氧发酵提供重要参考依据。关键词:餐厨固体废弃物;餐厨垃圾;好氧发酵;细菌群落结构;物种多样性中图分类号:X712文献标识码:A文章编号:1002-204X(2023)05-0048-07doi:10.3969/j.issn.1002-204x.2023.05.010Characteristics of Bacterial Community Structurein Different Temperature Stages of Food
5、and Kitchen Solid Waste FermentationMao Ruifan1,Wei Xin2,Zhu Jianwei1,Jia Yuanchao1,Bi Jiangtao2*(1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan,Ningxia 750021;2.School of Ecology and Environment,Ningxia University,Yinchuan,Ningxia 750021)Abstract In this study,the dynamic changes in bacterial
6、community structure in food and kitchen solid wastewere analyzed using Illumina NovaSeq PE250 sequencing platform and amplicon sequencing technology.Theaim was to provide microbial basis for optimizing the high-temperature rapid aerobic fermentation conditions offood and kitchenwaste.Thesolidmateria
7、lsseparatedfromfoodandkitchenwastewereplacedinahigh-temperature aerobic fermentation tank.Different fermentation temperature stages were set,including theinitial fermentation stage(38),high-temperature fermentation stage(50),super-high temperature initialstage(68),super-high temperature termination
8、stage(68)and cooling stage(38).Rice bran powderand desulfurized gypsum were added as additives for waste fermentation.The results showed that the bacterialcommunity composition at the phylum level was dominated by Firmicutes,which had the highest relativeabundance in all fermentation stages.At the g
9、enus level,Lactobacillus was the dominant genus from the initial4864 卷 05 期fermentation stage to the super-high temperature initial stage,while Novibacillus and Bacillus were dominantgenera from the super-high temperature termination stage to the cooling stage.Analysis of bacterial communitydiversit
10、y showed that the initial fermentation stage had the lowest richness and species diversity,while thesuper-hightemperatureinitialstageandcoolingstagehadthehighestrichnessandspeciesdiversity,respectively.Analysis of species differences in bacterial communities at different fermentation stages showed t
11、hatFirmicutes,Proteobacteria,and Bacteroidetes were significantly different at the phylum level(P0.01),whileActinomadura,Romboutsia and Oceanobacillus were significantly different at the genus level(P0.01).Thespecies diversity of bacterial community and changes in specific species during different t
12、emperature stagesprovide essential references for the high-temperature rapid aerobic fermentation of food and kitchen solid waste.Key words Food and kitchen solid waste;Food waste;Aerobic fermentation;Bacterial community structure;Species diversity表 1餐厨固废物料不同温度时段处理处理发酵阶段温度/发酵时长/hFWT1起始发酵阶段38.00FWT2高
13、温发酵阶段50.002FWT3超高温初始阶段68.026FWT4超高温终止阶段68.0630FWT5降温阶段38.03036餐厨垃圾作为一种有机废弃物,含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类和纤维素,具有较高的资源化利用价值。餐厨垃圾资源化处理起步较晚,产业发展进度缓慢1。经过传统的填埋或焚烧处理后会对当地环境产生较大危害,餐厨固体废弃物未能得到有效利用,使餐厨垃圾中的可利用资源被严重浪费2。餐厨垃圾发酵技术可分为好氧发酵和厌氧发酵两大类。餐厨垃圾好氧发酵指好氧微生物在氧气充裕的条件下对餐厨垃圾的生物降解过程,是一种可以使餐厨垃圾在较短周期内完成物料堆肥熟化的方法3。王秀红等4通过好氧堆肥发酵发现不同温
14、度时段细菌群落有所不同,高温发酵阶段优势菌属以嗜热芽孢杆菌属(Thermobacillus)和乳酸杆菌属(Lactobacilli)为主。李磊等5研究发现枝条堆肥发酵过程中生存能力更强的植物促生功能菌芽孢杆菌和放线菌成为优势菌群,可显著促进堆肥枝条肥效释放。目前餐厨垃圾存在腐熟度较低、资源化产品利用不足等问题,研究高温好氧发酵过程中不同温度条件下优势菌种的变化情况对餐厨垃圾养分资源利用及腐熟度的提高具有重要意义。笔者以餐厨垃圾固液分离后的餐厨固废为研究对象,探讨餐厨垃圾高温快速好氧发酵过程中细菌群落结构变化特征,以期为餐厨垃圾高温快速好氧发酵条件优化提供微生物学依据。1材料与方法1.1仪器与试
15、剂高保真 PCR 混合液(PhusionHigh-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer)和高效高保真酶购自New England Biolabs 公司,胶回收试剂盒购自 qiagen公司,文库建库试剂盒(TruSeqDNA PCR-FreeSample Preparation Kit)购自 Illumina 公司,rRNA 去除试剂盒(epicentre Ribo-ZeroTM)购自 Epicentre 公司,脱硫石膏(CaSO4)购自中国国电集团公司大武口发电厂。1.2试验材料将固液分离后的固相餐厨垃圾置入高温好氧发酵装置后,与一定量的稻壳粉及脱硫石膏混
16、合均匀,并通过外源加热发酵装置,发酵过程中控制高温发酵时长为 3648 h。发酵共分为 5 个阶段(表 1),对各发酵阶段的餐厨发酵固废分别采样,每个阶段重复 3次,共计取样 15 份并装入 50 mL 无菌离心管中。1.3试验方法采用 CTAB 方法对样品基因组 DNA 进行提取,琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 浓度和纯度,取适量样本于离心管中,用无菌水稀释至 1 ng/L,得到样品总DNA,以稀释后的基因组 DNA 为模板,选用 341-F(5-CCTAYGGGRBGCASCAG-3)和 806-R(5-GGACTACHVGGGTGCA-3)通用引物,对细菌 16SrDNAV3-V4 可变区进
17、行扩增,使用带 Barcode 的特异引物并用高效和高保真酶进行 PCR 扩增。1.4数据处理与分析利用 QIIME 软件对所得 OTUs 进行分析,得出其RR毛瑞璠,等餐厨固废不同温度发酵时段细菌群落结构特征4964 卷 05 期毛瑞璠,等餐厨固废不同温度发酵时段细菌群落结构特征(b)不同发酵阶段 OTUs 分布图 1数据质控及 OTUs 分布(b)属水平物种相对丰度图 2细菌在门和属水平上相对丰度排名前 10 位的分布情况丰度值和差异性指标;数据处理利用 SPSS 2.6.0 和Excel 2010。2结果与分析2.1数据质控及 OTUs 分布本试验采集的 15 个样品质控之后的高质量序列
18、(Clean Tags)数据分布在 96 901100 931 之间;Clean Tags 经过嵌合体过滤,得到的有效序列(Effec-tive Tags)分布在 69 05360 003 之间。由图 1(a)可知,全部序列(Total Tags)平均有数据 63 882 个。对原始数据拼接,利用 97%的相似性进行聚类,得出不同发酵时期的共同 OTUs 和特有 OTUs6,见图 1(b)。样品不同发酵阶段共同 OTUs 为 282 个,起始发酵阶段(FWT1)中特有 OTUs 为 62 个,高温发酵阶段(FWT2)为 128 个,超高温初始阶段(FWT3)为 179个,超高温终止阶段(FWT
19、4)为 77 个,降温阶段(FWT5)为 198个,不同发酵阶段特有 OTUs 存在较大差异。2.2不同发酵阶段细菌在不同分类水平上的相对丰度餐厨垃圾不同发酵阶段细菌在门水平上的相对丰度排布情况详见图 2(a)。从图 2(a)可知相对丰度排名前 10 位的菌门分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、未知菌门(Unidentified-Bacteri-a)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacte-ria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、盐厌氧菌门(Halanaer-obiaeota)、绿弯菌门(Chlorofle
20、xi)、嗜盐菌门(Halobac-terota)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcota);其中:厚壁菌门在不同发酵阶段相对丰度均达到 75%以上,为优势菌门。由图 2(b)可知,不同处理优势菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、新生芽孢杆菌属(novibacillus)、未知菌属(Unidentified-Marinococcaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克罗彭施泰特氏菌属(Kroppenstedtia)、普氏菌属(Prevotella)、狡诈菌属(Dolosigranulum)、热微菌属(Tepidimicrobium)、迈勒吉尔霉菌属(Melghir原im
21、yces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)。在整个发酵阶段,乳酸杆菌属呈下降的趋势,新生芽孢杆菌属和芽孢杆菌属等相对丰度呈增加趋势。2.3不同发酵阶段细菌群落物种多样性Alpha 多样性是反映局部均匀生境下的物种在丰富度、多样性和均匀度等方面的指标7。群落多样性越高,说明物种分布越均匀。本研究以 Shannon 多(a)原始序列、高质量序列和有效序列数据范围(a)门水平物种相对丰度5064 卷 05 期毛瑞璠,等餐厨固废不同温度发酵时段细菌群落结构特征图 3细菌群落在门水平上的物种差异图 4细菌群落在属水平上的物种差异表 2不同发酵阶段样品 alpha 多样性分析阶段GCShann
22、onSimpsonChao1ACEFWT10.990.00ab1.880.23d0.390.06d544.6935.78c554.9519.5cFWT20.990.00ab3.250.25c0.590.05c806.7144.67b821.0535.22bFWT30.990.00b4.560.09b0.770.02b1005.0526.94a1009.9326.29aFWT40.990.00ab5.800.23a0.960.01a578.55148.84c607.09167.04cFWT50.990.00ab6.040.30a0.960.01a685.2332.83bc691.1642.60b
23、c注:表中同列数字肩标小写字母不同,表示差异显著(P0.05)。样性指数、样本 OTUs 数目指数(Chao1)、Simpson 多样性指数、样本丰富度和均匀度指数(ACE)和测序深度指数(GC)对不同发酵阶段细菌群落物种组成的丰富度和多样性进行的综合评价,结果如表 2 所示8。由表 2 可知,不同温度时段 Shannon 指数和Simpson 指数均以超高温终止阶段和降温阶段最高(P0.05),Chao1 指数与 ACE 指数均以超高温初始阶段最高(P0.05),Shannon 指数、Chao1 指数、Simpson 指数和 ACE 指数均以起始发酵阶段最低(P0.05)。2.4不同发酵阶段
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