沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌细胞活力和凋亡的影响及机制研究.pdf
《沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌细胞活力和凋亡的影响及机制研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌细胞活力和凋亡的影响及机制研究.pdf(4页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、段进进等 沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌细胞活力和凋亡的影响及机制研究 第 8 期沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌细胞活力和凋亡的影响及机制研究段进进 尚立群 王莉 吴桦 苗毅 董玉(陕西省人民医院呼吸科,西安 710068)中图分类号 R734.2 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2023)08-1683-04摘要 目的:研究沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌(NSCLC)细胞活力和凋亡的影响,并探索其作用机制。方法:体外培养非小细胞肺腺癌细胞A549和顺铂耐药的A549细胞(A549/DDP)。转染Rheb-siRNA(si-Rheb)至A549和A549/DDP
2、细胞。采用CCK-8法、Annexin-V/PI双染,qPCR和Western blotting方法检测si-Rheb对细胞活力和凋亡的影响。结果:Rheb在A549/DDP细胞中高表达(P0.05)。转染si-Rheb可有效抑制A549和A549/DDP细胞中Rheb的表达,显著降低A549和A549/DDP细胞活力,诱导细胞凋亡,促进A549/DDP对DDP的敏感性(P0.05)。此外,转染si-Rheb显著影响了凋亡相关蛋白,如细胞色素C、RARP和Caspase-3表达,并抑制了mTOR-S6信号通路的过度激活(P0.05)。结论:Rheb通过mTOR-S6信号通路调控DDP耐药A54
3、9细胞对DDP的敏感性。关键词 Rheb;非小细胞肺癌;耐药性;mTOR-S6信号通路;凋亡Effect and mechanism of si-Rheb on viability and apoptosis of DDP-resistant nun-small cell lung cancer cellsDUAN Jinjin,SHANG Liqun,WANG Li,WU Hua,MIAO Yi,DONG Yu.Department of Respiratory Medicine,Shaanxi Provincial Peoples Hospital,Xian 710068,ChinaAbs
4、tract Objective:To explore the effects of Rheb knockdown on viability and apoptosis of DDP-resistant non-small cell lung cancer(NSCLC)cells and its possible mechanisms.Methods:Non-small cell lung adenocarcinoma cell A549 and DDP-resistant A549(A549/DDP)cells were cultured in vitro.Transfected Rheb-s
5、iRNA(si-Rheb)into A549 and A549/DDP cells.CCK-8 assay,Annexin-V/PI double stain kit,qPCR and Western blotting were used to investigate the effects of Rheb siRNA(si-Rheb)on viability and apoptosis of cells.Results:Rheb was upregulated in A549/DDP cells(P0.05).Transfection with si-Rheb into A549 and A
6、549/DDP cells significantly inhibited expression of Rheb,significantly suppressed cell viability,induced cell apoptosis,and promoted sensibility of A549/DDP to DDP(P0.05).In addition,si-Rheb markedly effected expressions of apoptosis related proteins,such as Cytochrome-C,RARP and Caspase-3,and suppr
7、essed overactivated of mTOR-S6 signal pathway(P0.05).Conclusion:Rheb promoted the sensitivity of A549/DDP cells to DDP may through regulating the mTOR-S6 signal pathway.Key words Rheb;Non-small cell lung cancer;Drug resistance;mTOR-S6 signal pathway;Apoptosis肺癌的发病率和病死率逐年上升,作为男性癌症患者死亡率的第一大原因,女性癌症患者死亡
8、率的第二大原因,严重威胁人类健康和生命1。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的85%。Rheb(ras homolog enriched in brain)是小GTP(guanosine triphosphate)酶超家族成员,是mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路的上游调控因子2。Rheb可通过调节mTORC1(mammalian target activity of rapamycin complex 1)参与细胞生长和周期的调节过程3。已经有研究表明Rheb 在 多 种 恶 性 肿 瘤 组
9、 织 中 高 表 达,包 括NSCLC4。抑制Rheb可抑制结直肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡5。然而,Rheb在耐药性NSCLC中的具体作用还不清楚。因此,本文旨在研究沉默Rheb对顺铂(DDP)耐药性及肺癌细胞活力和凋亡的影响及作用机制。1 材料与方法 1.1材料NSCLC 细胞 A549 细胞购自中国科学院上海细胞库。顺铂、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒均购自Sigma-Aldrich;高糖DMEM培养基、胎牛血清购自 Gibco;反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit(Code No.RR037A)购自大连 TaKaRa 公司;Rheb基因的siRNA
10、s靶序列、阴性对照siRNA-NCdoi:10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.021本文为陕西省重点研发项目(2018SF-062)。通信作者,E-mail:。西安市中心医院呼吸科,西安 710004。作者简介:段进进,女,主治医师,主要从事肺部肿瘤方面的研究。1683中国免疫学杂志2023 年第 39 卷购自上海生工生物工程有限责任公司;Lipofecta-mineTM3000试剂盒购自Life Technologies Corporation公司;Cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒购自日本Dojindo Laboratories;TRI
11、zol 试剂盒(Code No.1559 6026)购自 Thermo fisher Scientific 公司;Annexin-V/PI 流 式 双 染 试 剂 盒 购 自 美 国 BD Biosciences Pharmingen;Caspase-3 兔 多 克 隆 抗 体(ab13847)、Cytochrome C(Cyto-C)兔单克隆抗体(ab133504)、羊抗兔二抗(ab150077)购自英国 Abcam 公司;PARP兔 多 克 隆 抗 体(#9542)、mTOR 兔 多 克 隆 抗 体 (#2983)、p-mTOR(ser2448)兔多克隆抗体(#5536)、S6 兔多克隆抗
12、体(#2217)、p-S6(S235/236)(#4856)均购自Cell Signaling Technology公司。流式细胞分析仪(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)。1.2方法1.2.1细胞培养A549细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。通过向A549细胞中加入浓度不断增加的DDP,培养获得A549/DDP细胞。如果细胞在10 g/ml DDP中存活2个月,则判定其对DDP耐药。所获得的细胞采用高糖DMEM培养基+2 g/ml DDP+10%胎牛血清培养。所有细胞在37、5%CO2的细胞培养箱中培养。实验前1周采用不含DDP的培养基培养A549/DD
13、P细胞。1.2.2siRNA的合成与转染Rheb基因的 siRNA靶序列由上海生工生物工程有限责任公司合成。细胞转染采用LipofectamineTM 3000试剂盒,按照说明书操作进行,Rheb siRNA 和阴性对照 siRNA-NC转染浓度为 50 nmol/L。Rheb siRNA 正向引物:5-CAACCAUAGAGAACACGTT-3;反向引物:5-AACGUGUUCUCUAUGGUUG-3。siRNA-NC序列:5-UU-CUCCGAACGUGUCACG-3。1.2.3细胞活力检测细胞活力采用CCK-8试剂盒检测。取对数生长期细胞至 96微孔板,培养过夜,然后加入DDP处理24
14、h,或者转染Rheb siRNAs 48 h后加入10 l CCK-8试剂。将微孔板置于细胞培养箱中孵育13 h。酶标仪在450 nm下检测吸光度值。1.2.4mRNA 表达水平检测采用 qPCR 检测Rheb mRNA的表达水平。收集细胞,采用TRIzol试剂盒提取总 RNA,反转录试剂盒获得单链 cDNA。实验步骤参考文献 5。Rheb 正向引物:5-AAG-TCCCGGAAGATCGCCA-3,反向引物:5-GGTTGG-ATCGTAGGAATCAACAA-3;内参 GAPDH 正向引物:5-AGGCTGAGAACGGGAAGC-3,反 向 引 物:5-CCATGGTGGTGAAGACG
15、C-3。1.2.5蛋白表达量检测用细胞刮收集细胞后,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min。收集细胞裂解液,12 000 r/min、4 离心10 min。收集上清液,采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白样品浓度。使用10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离,然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。在使用5%脱脂牛奶封闭后,孵育一抗,4 过夜。PBS清洗3次,每次10 min。然后使用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h,PBS清洗3 次,每次 10 min。最后采用化学发光液显影,Image J 软件分析条带灰度值。1.2.6细胞凋亡检测采用Annexin-V/PI流式双染试剂盒检测细胞凋亡。弃掉培养液后加胰酶
16、消化,收集细胞至离心管中,室温1 000 r/min离心5 min,PBS清洗重悬后再离心。加入适量binding buffer后,按比例加入Annexin-V,室温黑暗条件下孵育20 min。加入5 l PI,采用流式细胞分析仪进行分析。1.3统计学处理所有数据均采用x s表示,多组间比较采用单因素方差分析One-Way ANOVA,两组比较采用paired-sample t检验。P0.05为差异有统计学意义。所有统计学分析利用Prism.5.0进行。2 结果 2.1Rheb在A549和A549/DDP细胞中的表达量差异如图1A所示,20 g/ml DDP对A549/DDP细胞活力无明显影响
17、,但对A549细胞具有明显毒性(P0.05)。DDP 对 A549 和 A549/DDP 细胞的 IC50值分别为(9.50.28)g/ml和(85.81.60)g/ml,差异有统计学意义(P0.01,图 1B)。Rheb mRNA 在A549/DDP 细胞中的表达量是在 A549 中表达量的 3倍左右(图 1C,P0.01)。Western blotting 结果显示Rheb蛋白在A549/DDP细胞中的表达量为A549细胞的(3.690.23)倍(P0.01,图1D)。2.2沉默Rheb对A549和A549/DDP细胞活力的影响Rheb siRNA转染A549和A549/DDP细胞,培养4
18、8 h后收集细胞,提取RNA和蛋白质,检测转染效率。如图2A、B显示,转染Rheb siRNA显著抑制了A549 和 A549/DDP 细胞中 Rheb mRNA 和蛋白质的表达,和阴性对照组(si-NC转染组)相比差异具有统计学意义(P0.01)。采用CCK-8法检测转染Rheb siRNA对A549和A549/DDP细胞活力的影响,发现沉默Rheb可抑制A549和A549/DDP的细胞活力,并促进 DDP(5 g/ml)对 A549 和 A549/DDP 细胞的毒性作用(P0.05,图2C、D)。1684段进进等 沉默Rheb对DDP耐药非小细胞肺癌细胞活力和凋亡的影响及机制研究 第 8
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 沉默 Rheb DDP 耐药 细胞 肺癌 活力 影响 机制 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。