沉默lncRNA NEAT1通过抑制NF-κB通路减轻LPS诱导的支气管上皮细胞炎症反应.pdf
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1、王静,邵小美,盛娜,等.沉默 lncRNA NEAT1 通过抑制 NF-B 通路减轻 LPS 诱导的支气管上皮细胞炎症反应J.中南医学科学杂志,2023,51(5):655-659.收稿日期 2022-12-23修回日期 2023-07-29基金项目 南京市卫生科技发展专项资金项目(ykk18240)作者简介 王静,主治医师,研究方向为呼吸与危重症,E-mail 为 。通信作者盛娜,副主任医师,研究方向为呼吸与危重症,E-mail 为 jiahexin0101 。DOI:10.15972/ki.43-1509/r.2023.05.007基础医学沉默 lncRNA NEAT1 通过抑制 NF-B
2、 通路减轻 LPS 诱导的支气管上皮细胞炎症反应王静1,邵小美1,盛娜1,杨震2南京江北医院 1.呼吸与危重症科,2.呼吸科,江苏南京 210000摘 要 目的 探究沉默长链非编码 RNA(lncRNA)NEAT1 对脂多糖(LPS)诱导的人支气管上皮(HBE)细胞(16HBE)炎症反应的影响及机制。方法 16HBE 细胞分为 Control 组、LPS 组、LPS+si-NC 组和 LPS+si-NEAT1 组。实时荧光定量 PCR 检测各组 lncRNA NEAT1、白细胞介素(IL)-1、IL-6 及肿瘤坏死因子-(TNF-)的 mRNA 表达水平;MTT 法检测细胞增殖活力;流式细胞仪
3、检测细胞凋亡率;Western blotting 检测各组炎症因子水平及增殖细胞核抗原(PCNA)、p53、核因子 B 抑制蛋白(IB)、核因子-B(NF-B)p65 蛋白表达水平。结果沉默 lncRNANEAT1 后,IL-1、IL-6、TNF-及其 mRNA 表达水平、细胞凋亡率及 p53、p-IB、p-NF-B p65 蛋白水平均明显降低,细胞增殖活力及 PCNA 蛋白水平均明显升高(P0.05),细胞中 p-NF-B p65 相对荧光强度(细胞核/细胞质)降低(P0.05)。结论 沉默 lncRNA NEAT1 表达抑制16HBE 细胞炎症反应,其机制可能与抑制 NF-B 通路的激活有
4、关。关键词 长链非编码 RNA;核因子-B 通路;脂多糖;支气管上皮细胞;炎症反应中图分类号 R56文献标识码 ASilencing lncRNA NEAT1 alleviates LPS-induced inflammation of bronchial epithelialcells by inhibiting NF-B pathwayWANG Jing1,SHAO Xiaomei1,SHENG Na1,YANG Zhen21.Department of Respiratory and Critical Diseases,2.Department of Respiratory,Nanjin
5、g Jiangbei Hospital,Nanjing210000,Jiangsu,ChinaABSTRACT Aim To study the effect of silencing long non-coding RNA(lncRNA)NEAT1 on lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammatory response in human bronchial epithelial cells(16HBE)and to discuss its underlying mecha-nism.Methods 16HBE cells were divided i
6、nto Control group,LPS group,LPS+si-NC group,and LPS+si-NEAT1group.Quantitative real-time PCR was used to detect the mRNA expression levels of lncRNA NEAT1,interleukin-1(IL-1),IL-6 and tumor necrosis factor-(TNF-)in each group of 16HBE cells;MTT assay was used to detect cellproliferation activity;Flo
7、w cytometry was used to detect cell apoptosis rate;Western blotting was used to detect the levels ofinflammatory factors,protein expression levels of proliferating cell nuclear antigen(PCNA),apoptosis regulatory genep53,inhibitor of nuclear factor B(IB)and nuclear factor-B(NF-B)p65 in each group of
8、16HBE cells.Re-sults After silencing the expression level of lncRNA NEAT1,the mRNA expression levels and proteins of IL-1,IL-6,andTNF-,as well as the apoptosis rate and the protein levels of p53,p-IB,p-NF-B p65 in 16HBE cells were significantlyreduced.The cell proliferation activity and PCNA protein
9、 level were significantly increased(P0.05).The relative fluo-rescence intensity(nucleus/cytoplasm)of p-NF-B p65 was decreased(P0.05).ConclusionDown-regulating theexpression of lncRNA NEAT1 can reduce the inflammatory response and inhibit the activation of the NF-B pathway.KEY WORDS lncRNA;NF-B;LPS;b
10、ronchial epithelial cells;inflammatory response人支气管上皮(human bronchial epithelium,HBE)在维持呼吸系统稳态方面发挥重要作用1。炎症细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-8 及肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,556CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期TNF-)等在多种刺激下均可在 HBE 细胞中上调2。长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与多种生理和病理过程,包括炎症反应
11、。在脓毒症中,抑制 lncRNA NEAT1 的表达可阻碍脓毒症的发展和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的细胞损伤及炎症反应3。核因子-B(nuclear factor-B,NF-B)与细胞炎症反应密切相关4。香烟烟雾提取物通过激活16HBE 细胞中 NF-B 通路促进细胞的氧化应激和炎症反应5。本文采用 LPS 建立气道炎症模型,分析 lncRNA NEAT1 在 LPS 诱导的 HBE 细胞炎症中的作用以及 NF-B 信号通路所发挥的作用。1 材料和方法1.1 细胞、试剂及仪器人 16HBE 细胞购于深圳 Otwo Biotech 公司。胎牛血清购于兰州荣晔生物科
12、技有限责任公司;DEME 培养基、胰蛋白酶购于上海联迈生物工程有限公司;LPS 购于上海碧云天生物技术有限公司;Lipofectamine2000 转染试剂、SuperScript 反转录试剂盒购于美国英杰生命技术有限公司;Total RNA提取试剂盒购于福州飞净生物科技有限公司;SYBRGreen qPCR Master Mix 购于美国 Med Chem Express(MCE)生物科技公司;人 IL-1、IL-6 及 TNF-的ELISA 试剂盒均购于武汉菲恩生物科技有限公司;MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋
13、亡检测试剂盒、高敏型 ECL 化学发光检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司;蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物购于上海雅吉生物科技有限公司;RIPA 裂解缓冲液购于美国 AMRESCO 公司;一抗 PCNA、p53、NF-B 抑制蛋白(IB)、磷酸化-IB(p-IB)、NF-B p65、p-NF-B p65 及内参-tubulin 均购于英国 Abcam 公司;异硫氰酸荧光素标记 IgG(FITC-IgG)购于上海阿拉丁试剂有限公司;引物及针对 lncRNA NEAT1 特定的小干扰 RNA(si-NEAT1)及 siRNA 干扰对照(si-NC)均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。Ap
14、plied Bio-systems ABI 7500 型荧光定量 PCR 仪购自美国应用生物系统公司;Multlskan Mk3 酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司;BD Accuri C6 流式细胞仪购自美国 BD 公司;FV1000 激光共聚焦显微镜购自日本奥林巴斯株式会社。1.2 细胞培养及分组采用 含 10%胎 牛 血 清 的 DEME 培 养 基 于37、5%CO2培养箱中培养16HBE 细胞,待其生长铺满培养皿 85%时,去除培养基,使用 PBS 清洗后添加胰蛋白酶消化,显微镜观察到细胞回缩,间隙变大后终止消化,去除消化液后添加新的培养基,按照 1 3 的比例进行传代培养。选取培养的
15、16HBE 细胞接种于 6 孔细胞培养板中(1106个/孔),当细胞生长至培养板 75%时,向每孔中添加50 mg/L LPS6,再继续将培养板置于 37、5%CO2培养箱中培养 24 h,收集细胞进行后续研究。16HBE 细胞分为 Control 组(等体积生理盐水培养)、LPS 组(50 mg/L LPS 处理24 h)、LPS+si-NC组(si-NC 转染 24 h 后添加50 mg/L LPS 处理24 h)和 LPS+si-NEAT1 组(si-NEAT1 转染 24 h 后添加50 mg/L LPS 处理24 h)。参照 Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行瞬
16、时转染。1.3 lncRNA NEAT1 及炎症细胞因子水平检测使用 Total RNA 提取试剂盒依次从各组培养的16HBE 细胞中提取总 RNA,使用 SuperScript 反转录试剂盒进行反转录,随后使用 SYBR Green qPCRMaster Mix 配制反应体系在荧光定量 PCR 仪中对mRNA 进行定量分析。以-actin 为内参,2-Ct法计算。实时荧光定量 PCR 反应程序:95 10 min,95 15 s,60 1 min,共 40 个循环。ELISA 法检测各组细胞培养液中 IL-1、IL-6 及 TNF-的含量,所有操作流程均根据试剂盒说明书进行。lncRNA N
17、EAT1:F-5-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3,R-5-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3;IL-6:F-5-CCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTA-3,R-5-CGTCGAGGATGTACCGAATTT-3;IL-1:F-5-CTCTCACCTCTCCTACTCACTT-3,R-5-TCAGAATGTGGGAGCGAATG-3;TNF-:F-5-GGATGGATGGAGGTGAAAGTAG-3,R-5-TGATCCTGAAGAGGAGAGAGAA-3;-actin:F-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3,R-5-AT
18、AGCACAGCCTGGATAGCAA-3。1.4 MTT 法检测细胞增殖活力取各组16HBE 细胞,以2103个/孔接种于96 孔培养板中培养24 h 后,向每孔中添加100 L DEME 培养基(含 10%MTT 溶液)后置于培养箱中继续培养4 h,添加 100 L Formanzan 溶解液继续培养细胞约4 h,直至观察 Formazan 被完全溶解,使用37 预热的酶标仪于 570 nm 处读取各孔光密度值(OD)。1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率取各组 16HBE 细胞,以 1106个/孔接种于 6孔培养板中,培养 24 h,去除上清,收集细胞,使用培养基稀释细胞为1105个/mL,
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