NK细胞培养及杀伤前列腺癌细胞效率的研究.pdf

论著N K细胞培养及杀伤前列腺癌细胞效率的研究*王丙萍1 刘彩云2 高艳伟3 高维实3 陆相吉4(1.内蒙古自治区人民医院肿瘤研究所,内蒙古 呼和浩特 0 1 0 0 1 7;2.北京亦科诺生物科技有限公司,北京 1 0 0 1 7 6;3.内蒙古自治区人民医院腹部肿瘤外科,内蒙古 呼和浩特 0 1 0 0 1 7;4.武警内蒙古自治区总队医院普外科,内蒙古 呼和浩特 0 1 0 0 1 0)【摘要】目的 建立一种高效的NK细胞体外扩增培养方法;通过检测NK细胞杀伤3种前列腺癌(P C a)细胞株的效率,鉴定其用于后期治疗P C a的可行性,为应用NK细胞过继回输治疗P C a的研究奠定基础。方法 通过细胞因子对外周血单个核细胞(P BMC s)的诱导扩增,培养出NK细胞并用流式细胞术检测NK细胞所占比例以及扩增倍数;通过C C K 8法检测NK细胞杀伤3种P C a细胞株P C 3、L N C a P、D U 1 4 5的效率及效靶比。结果 NK细胞诱导扩增成功,P BMC s诱导扩增后,NK细胞由最初的(1 0.9 73.2 8)%,扩增到占比(8 3.2 08.5 4)%以上,细胞总数扩增倍数为(2 5 1.6 61 9.0 5)倍,NK细胞扩增倍数为(1 9 4 0.1 74 0 2.2 2)倍。NK细胞对3种靶细胞的杀伤率差异极显著(P0.0 1);NK细胞对L N C a P的杀伤效率大于对D U 1 4 5的杀伤效率;对于P C 3没有杀伤作用,反而促进其生长。NK细胞对P C a细胞株的最高杀伤效率分别为L N C a P(9 2.0 39.9 5)%、D U 1 4 5(7 2.4 08.3 0)%、P C 3(2 6.6 91 0.5 6)%。结论 采用细胞因子诱导扩增P BMC s的方法能够获得纯度较高、数量足够的NK细胞,为NK细胞的临床应用奠定基础;NK细胞对3种P C a细胞系的杀伤率差异极显著,为后续进行深入研究探索原因及作用机制提供了方向。【关键词】NK细胞;诱导扩增;前列腺癌;细胞毒活性;效靶比【中图分类号】R 7 3 7.2 5 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.1 1.0 0 4 基金项目:内蒙古自治区自然科学基金项目(2 0 2 1 L HM S 0 8 0 6 0)通讯作者:陆相吉,E-m a i l:5 3 0 1 6 3 6 9 5q q.c o m引用本文:王丙萍,刘彩云,高艳伟,等.NK细胞培养及杀伤前列腺癌细胞效率的研究J.西部医学,2 0 2 3,3 5(1 1):1 5 7 7-1 5 8 3.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.1 1.0 0 4S t u d y o n N K c e l l c u l t u r e a n d k i l l i n g e f f i c i e n c y o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l sWA N G B i n g p i n g1,L I U C a i y u n2,G A O Y a n w e i3,G A O W e i s h i3,L U X i a n g j i4(1.C a n c e r I n s t i t u t e,I n n e r M o n g o l i a P e o p l eS H o s p i t a l,H o h h o t 0 1 0 0 1 7,C h i n a;2.B e i j i n g Y k o n o B i o t e c h n o l o g y C o.,L TD.,B e i j i n g 1 0 0 1 7 6,C h i n a;3.D e p a r t m e n t o f A b d o m i n a l O n c o l o g y S u r g e r y,I n n e r M o n g o l i a P e o p l eS H o s p i t a l,H o h h o t 0 1 0 0 1 7,C h i n a;4.D e p a r t m e n t o f G e n e r a l S u r g e r y,I n n e r M o n g o l i a A r m e d P o l i c e H o s p i t a l,H o h h o t 0 1 0 0 1 0,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a n e f f i c i e n t m e t h o d o f NK c e l l e x p a n s i o n a n d c u l t u r e i n v i t r o.T h e e f f e c t i v e n e s s o f NK c e l l s i n k i l l i n g t h r e e p r o s t a t e c a n c e r(P C a)c e l l l i n e s w a s t e s t e d t o e v a l u a t e i t s f e a s i b i l i t y i n t h e l a t e r t r e a t m e n t o f P C a,w h i c h l a i d a f o u n d a t i o n f o r t h e a p p l i c a t i o n o f a d o p t i v e NK c e l l t r a n s f u s i o n f o r P C a.M e t h o d s T h e N K c e l l s w e r e c u l-t u r e d b y i n d u c i n g a n d a m p l i f y i n g P B M C s w i t h c y t o k i n e s,a n d t h e p r o p o r t i o n a n d a m p l i f i c a t i o n o f N K c e l l s w e r e d e t e c t e d b y f l o w c y t o m e t r y.T h e e f f i c i e n c y a n d e f f e c t-t a r g e t r a t i o o f N K c e l l s a g a i n s t t h r e e p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s P C 3,L N C a P a n d D U 1 4 5 w e r e m e a s u r e d b y C C K 8 m e t h o d.R e s u l t s T h e N K c e l l s w e r e s u c c e s s f u l l y a m p l i f i e d.A f t e r P B M C s i n d u c t i o n,N K c e l l s w e r e a m p l i f i e d f r o m t h e i n i t i a l 1 0.9 7%3.2 8%t o m o r e t h a n 8 3.2 0%8.5 4%,a n d t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s w a s(2 5 1.6 61 9.0 5)t i m e s.T h e a m p l i f i c a t i o n f a c t o r o f N K c e l l s w a s(1 9 4 0.1 7 4 0 2.2 2).T h e k i l l i n g r a t e o f N K c e l l s t o t h e t h r e e k i n d s o f t a r-g e t c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t(P0.0 1).T h e k i l l i n g e f f i c i e n c y o f N K c e l l s a g a i n s t L N C a P w a s g r e a t e r t h a n t h a t a g a i n s t D U 1 4 5.I t h a s n o k i l l i n g e f f e c t o n P C 3,b u t p r o m o t e s i t s g r o w t h.T h e h i g h e s t k i l l i n g e f f i c i e n c y o f N K c e l l s a g a i n s t p r o s t a t e c a n c e r c e l l s w e r e L N C a P 9 2.0 3%9.9 5%,D U 1 4 5 7 2.4 0%8.3 0%a n d P C 3 2 6.6 9%1 0.5 6%,r e s p e c t i v e l y.C o n c l u s i o n T h e p r o l i f e r a t i o n o f P B M C s i n d u c e d b y c y t o k i n e s c a n o b t a i n h i g h p u r i t y a n d s u f f i c i e n t n u m b e r o f N K c e l l s,w h i c h l a y s a f o u n d a-t i o n f o r t h e c l i n i c a l a p p l i c a t i o n o f N K c e l l s.T h e k i l l i n g r a t e o f N K c e l l s t o t h e t h r e e p r o s t a t e c a n c e r c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r-e n t,w h i c h p r o v i d e d a d i r e c t i o n f o r f u r t h e r r e s e a r c h t o e x p l o r e t h e c a u s e s a n d m e c h a n i s m o f a c t i o n.【K e y w o r d s】NK c e l l s;I n d u c e d a m p l i f i c a t i o n;P r o s t a t e c a n c e r;C y t o t o x i c a c t i v i t y;E f f e c t t o t a r g e t r a t i o7751西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1 前列腺癌(P r o s t a t e c a n c e r,P C a)是危害老年男性健康的常见癌症之一,并且在我国呈明显的逐年上升趋势1-2。细胞免疫治疗(C e l l i mm u n o t h e r a p y,C I T)是免疫治疗的一种,开始于2 0世纪7 0年代,1 9 9 7年被美国食品药品监督管理局(F o o d a n d d r u g a d m i n i s-t r a t i o n,F D A)批准正式纳入美国药品法规接受监管,C I T原理是将人体内的抗肿瘤免疫细胞采集后,经过体外培养扩增后回输患者,以增强人体免疫系统,从而达到抗肿瘤的目的。NK细胞(N a t u r a l k i l l e r c e l l)是机体除T细胞之外的另一抗肿瘤利器,本身具有广谱的肿瘤杀伤能力。NK细胞数量减少或者功能受损与各种类型癌症的进展相关。在应用NK细胞作为过继性免疫治疗的细胞时,NK细胞的主要来源是外周血,但外周血单个核细胞中NK细胞的数量仅占1 0%1 5%,因此NK细胞的体外扩增培养十分重要。本研究建立了一种快捷、方便、高效的NK细胞体外扩增方法,将外周血中占比较少的NK细胞扩增到纯度较高、数量充足,从而为NK细胞的过继性免疫治疗奠定基础。通过NK细胞对3种P C a细胞系L N C a P、DU 1 4 5、P C 3杀伤率的研究,鉴定其用于后期治疗P C a的可行性,为应用NK细胞过继回输治疗P C a的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 实验材料 P C a细胞株P C 3、L N C a P、DU 1 4 5购自中 国 科 学 院 上 海 细 胞 所;V I VOTM1 5培 养 基、DMEM高糖培养基、1 6 4 0培养基、胎牛血清(F e t a l b o v i n e s e r u m,F B S)、胰酶、磷酸盐缓冲液(P B S)(美国G i b c o公司);I L-2、I L-7、I L-1 5、I L-1 8、I L-2 1、OK T 3(美国R&D公司);抗人C D 1 6单克隆抗体(中国北京同立海源生物科技有限公司);F i c o l l淋巴细胞分离液(中国T B DTM公 司);荧 光 标 记 单 克 隆 抗 体:C D 3-F I T C、C D 5 6-P E、鼠抗人I g G-F I T C(美国B D公司);C C K 8试剂盒(中国博士德生物公司)。1.2 实 验 仪 器 二 氧 化 碳 培 养 箱 及 生 物 安 全 柜(T h e r m o,美国);倒置荧光显微镜(L e i c a,德国);F A C S-C a l i b u r流式细胞仪(B D,美国);高速离心机(E p p e n d o r f,德国);超净工作台(苏州泰安空气技术有限责任公司,中国);E L x 8 0 8吸收光酶标仪(B i o t e c,美国)。1.3 方法1.3.1 P C a细胞株的培养 P C a细胞株P C 3的培养液为9 0%DMEM-F 1 2+1 0%F B S;L N C a P的培养液为9 0%R PM I-1 6 4 0+1 0%F B S;DU 1 4 5的培养液为9 0%DMEM高糖+1 0%F B S。从液氮罐取出需要解冻的细胞,立即放入3 7 水浴锅中,快速摇动,使冻存的细胞尽量在1 m i n内融化。将冻存管用酒精消毒后迅速 移入超净工 作台。用移液器将 细胞液移入1.5 m L管中,1 5 0 0 r p m/m i n离心5 m i n,弃液,加入1 m L培养液轻轻悬浮细胞,细胞计数板计数,按细胞数11 06个/瓶 的 数 量 接 种 在T 2 5的 培 养 瓶 中,3 7,5%C O 2培 养 箱 中 培 养。细 胞 培 养 至 贴 壁9 0%左右传代培养,0.2 5%胰蛋白酶消化的时间分别是L N C a P、DU 1 4 5为1 m i n,P C 3为3 m i n。1.3.2 外周血单个核细胞(P BMC s)分离 F i c o l l密度梯度离心法分离P BMC s:使用肝素钠采血管抽取静脉血1 5 m L,F i c o l l与血液体积比为1 2,用移液管缓慢地在F i c o l l上层加入血液;在水平转头离心机中离心(2 2,8 0 0 g,1 5 m i n,升速5,降速4);离心结束后,在不扰动白膜层的情况下,用注射器吸出血浆层,转移至1支1 5 m L离心管,将血浆管置于5 6 水浴锅内保持3 0 m i n,之后置于4 冰箱内1 0 m i n进行冷却,离心(1 5 0 0 g,5 m i n,2 2,升速9,降速9)后转移上清至1支新的1 5 m L离心管,保存于4 备用;用巴氏吸管将白膜层仔细移出,移到另1支1 5 m L离心管,加 入P B S至1 5 m L,吹 打 清 洗,上 离 心 机 后(2 2,6 0 0 g,7 m i n,升速9,降速7),弃上清液,用2 m L V I VOTM1 5培养基重悬P BMC s细胞,显微计数,取样进行流式检测。1.3.3 NK细胞的诱导扩增 D a y 0接种:调整P BMC s细胞密度为1.5 M/m L,加入自体血清1 0%,I L-2 1 0 0 0 I U/m L,I L-7 1 0 n g/m L,I L-1 5 5 0 n g/m L,I L-1 8 1 0 n g/m L,I L-2 1 5 0 n g/m L,OK T 3 1 0 n g/m L,A n t i-C D 1 6 1 0 n g/m L,9 0%V I VOTM1 5培养基培养细胞,细胞接种密度1.5 M/m L,密度过大影响NK生长,放入3 7,5%C O 2培养箱中培养。D a y 3补液:细胞计数,根据细胞数量补充培养液,补液调节细胞的密度为1.0 M/m L;培养基=9 0%V I VOTM1 5培养基+自体血浆1 0%+I L-2 1 0 0 0 I U/m L,如果细胞团较小,或者无细胞团,本次不计数,不晃动培养瓶,直接补充原体积1/2培养基继续培养。D a y 5补液:细胞计数,调整细胞密度为1.0 M/m L,培养基=9 0%V I VOTM1 5培养基+自体血清1 0%+I L-2 1 0 0 0 I U/m L)。D a y 7D a y 1 4补液:每次补液调整细胞密度为0.5 1.0 M/m L,自体血浆1 0%,加入I L-2 1 0 0 0 I U/m L,培 养 过 程 中 细 胞 密 度 不 可 超 过2.0 M/m L。D a y 1 4收获:流式细胞仪检测结果,合格后收获细胞。1.3.4 流式细胞检测 免疫荧光标记法进行流式细胞分析,取NK细胞1 m L,P B S洗涤,1 5 0 0 r p m/m i n离心5 m i n,弃 液,加 入5 0 u L P B S轻 轻 悬 浮 细 胞2 0 L C D 3-F I T C和2 0 u L C D 5 6-P E,4 避光保存3 0 m i n。P B S洗涤后流式细胞仪分析检测,用异硫氰8751西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1酸(F I T C)标记I g G作为阴性对照,根据流式细胞分析图中 C D 3-C D 5 6+的百分比,确定NK细胞所占比例。1.3.5 C C K-8法检测杀伤效率 以NK细胞为效应细胞,靶 细 胞 分 别 为P C a细 胞 株L N C a P、DU 1 4 5、P C 3。将3种靶细胞以51 03个/孔 的数量分别接种于9 6孔板中,于3 7,5%C O 2培养箱中培养1 2 h后,轻轻吸除培养液。按效靶比0.1 1、0.5 1、1 1、2 1、5 1、1 0 1、1 5 1、2 0 1的比例分别加入效应细胞,每孔2 0 0 L培养液,同时设置单独靶细胞孔和每种比例的单独效应细胞孔,每个比例3个复孔。共同培养2 4 h后,加入C C K 8试剂2 0 L/孔,放于3 7,5%C O 2培养箱中,孵育3.5 h后用酶标仪测定4 5 0 n m波长的O D值,以此方法检测NK细胞的细胞毒活性,公式如下:杀伤率(%)=1-(实验组O D值-单独效应细胞O D值)/单独靶细胞组O D值1 0 0%。1.4 统计学分析 应用S P S S 1 9.0进行数据统计分析,符合正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,P0.0 5),但与效靶比0.1 1实验组相比差异显著(P0.0 5),但与其它实验组相比差异显著(P0.0 5)(表1、3);NK细胞对靶细胞P C 3的杀伤率在除了效靶比为0.1 1、0.5 1的实验组外,其余各实验组的杀伤率均为负数,并且各实验组间差异显著(P0.0 5)(表1、4),说明NK细胞对前列腺癌P C 3细胞株没有杀伤效果;并且随着效靶比逐步增高,其负数值越大,说明NK细胞对其 有促进生长作用。3 讨论P C a是目前全世界男性中最常见的恶性肿瘤之一,近年来死亡人数在持续增加3。在我国,P C a发病率近年来已出现逐步升高趋势4,并且P C a发病隐匿,导致大多数人发病时已处于癌症晚期5-6。目前对于P C a的治疗手段主要包括手术治疗、内分泌治疗、放疗以及化疗7-8。而对于晚期和转移性的P C a患者,雄激素剥夺治疗是其主要治疗手段,但由于其副作用严重、发生概率高,且疾病进展后,患者将失去所有现有治疗手段对生存期的收益。因此,对于这部分P C a患者急需开发出新的治疗手段,以提高其生活质量、延长生存期。NK细胞是大颗粒淋巴细胞,约占人体外周血淋巴细胞总数的1 0%左右9。NK细胞参与天然免疫和适应性免疫,是先天免疫系统中最具杀伤性的细胞毒性淋巴细胞,能够介导强大的抗病毒和抗肿瘤作用1 0。NK细胞是除T细胞之外的机体抗肿瘤的另一重要利器,其本身具有广谱抗肿瘤的作用,同时还具有强大的间接增强T细胞免疫应答的作用,是T细胞发挥抗肿瘤功能的基础1 1。有研究表明,NK细胞过继性回输在晚期非小细胞肺癌的治疗中取得了令人满意的效果1 2。免疫检查点抑制剂与NK细胞联合应用,在治疗白血病和非小细胞 肺 癌 患 者 时 是 安 全、有 效 且 具 有 生 存 益 处的1 3。与T细胞相比,NK细胞的过继性回输具有耐受性良好,神经毒性、细胞因子释放综合征(C y t o k i n e r e l e a s e s y n d r o m e,C R S)和 移 植 物 抗 宿 主 病(G r a f t-v e r s u s-h o s t d i s e a s e GVHD)等严重不良反应的发生率大大降低;同种异体NK细胞的回输还能避免或降低杀伤细胞免疫球蛋白样受体(K i l l e r-c e l l i mm u n o-g l o b u l i n-l i k e r e c e p t o r s,K I R s)介导的抑制性信号,从而发挥更好的抗肿瘤作用1 4-1 6。本研究建立了一种NK细胞体外诱导扩增的方法,将 外 周 血 中 占 比 较 少 的NK细 胞(1 0.9 73.2 8)%,扩增到占比(8 3.2 08.5 4)%以上,细胞总数扩增倍数为(2 5 1.6 61 9.0 5)倍,NK细胞扩增倍数为(1 9 4 0.1 74 0 2.2 2)倍。高效的NK细胞体外扩增方法的成功建立为NK细胞的过继性免疫治疗的广泛应用奠定了基础。9751西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1 图1 N K细胞的培养结果F i g u r e 1 R e s u l t s o f N K c e l l c u l t u r e注:A.健康人外周血分离P BMC s(5 0);B.NK细胞扩增34 d后聚集成团(5 0);C.NK细胞扩增1 01 4 d(5 0);D.检测P BMC s中NK 细胞比例时选定的细胞群;E.P BMC s中NK细胞比例鉴定时的阴性对照鼠抗人I g G-F I T C;F.P BMC s中NK细胞比例鉴定C D 3-C D 5 6+(C D 3-F I T C,C D 5 6-P E);G.检测扩增培养后NK 细胞比例时选定的细胞群;H.扩增培养后NK 细胞比例鉴定时的阴性对照鼠抗人I g G-F I T C;I.扩增培养后NK 细胞比例鉴定C D 3-C D 5 6+(C D 3-F I T C,C D 5 6-P E)。L N C a p细胞系保留了P C a肿瘤细胞学及其早期分化功能的特征,代表着早期雄激素依赖性的P C a的显著特征。L N C a p细胞倾向分泌总前列腺特异性抗原(t P S A),而升高的t P S A提示为雄激素依赖性和早期肿瘤1 7。DU 1 4 5细胞系分化程度低,为雄激素非依赖的P C a细胞,具有强大的转移潜能,缺乏内源性的雄激素受体的表达1 8。DU 1 4 5以分泌游离前列腺特异性抗原(f P S A)为主,而升高的f P S A应警惕雄激素非依赖性肿瘤的存在1 9。P C 3细胞系分化程度低,为雄激素非依赖性P C a细胞,不含有内源性的雄激素受体,具有中等强度的转移潜能,被广泛用于雄激素抵抗型的P C a的研究2 0。本研究结果显示效应细胞NK细胞对3种靶细胞的杀伤率差异极显著(P0.0 1),杀 伤效率为由 高到低分别 为L N C a P细 胞、DU 1 4 5细胞、P C 3细胞;并且对于P C 3细胞,随着效靶比的增高,不但没有杀伤作用,反而促进其生长(杀伤效率为负数)。本研究通过对以往研究资料的梳理,发现在生物学特性方面1 8,P C 3细胞、DU 1 4 5细胞是激素抵抗性前列腺癌(C a s t r a t i o n r e s i s t a n t P r o s-t a t e C a n c e r,C R P C),而L N C a P细胞是激素敏感性前0851西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1 图2 效应细胞N K对靶细胞L N C a P、D U 1 4 5、P C 3在效靶比为1 0 1时的杀伤图F i g u r e 2 K i l l i n g o f e f f e c t o r c e l l s N K o n t a r g e t c e l l s L N C a P,D U 1 4 5 a n d P C 3 a t a n e f f e c t-t a r g e t r a t i o o f 1 0 1注:A.杀伤前的L N c a p细胞(5 0);B.杀伤前的D U 1 4 5细胞(5 0);C.杀伤前的P C 3细胞(5 0);D.NK 细胞与L N c a p细胞共培养2 4 h后(5 0);E.NK 细胞与DU 1 4 5细胞共培养2 4 h后(5 0);F.NK 细胞与P C 3细胞共培养2 4 h后(5 0)。由于A、B、C为不同靶细胞,所用培养液不同,因而背景颜色不同。图3 N K细胞对靶细胞L N C a P、D U 1 4 5、P C 3的杀伤率F i g u r e 3 K i l l i n g r a t e o f N K c e l l s k i l l t a r g e t c e l l s L N C a P,D U 2 4 5 a n d P C 3表1 N K细胞对靶细胞L N C a P、D U 1 4 5、P C 3的杀伤率(xs,%)T a b l e 1 K i l l i n g r a t e o f N K c e l l s k i l l t a r g e t c e l l s L N C a P,D U 1 4 5 a n d P C 3项目0.1 10.5 11 12 15 11 0 11 5 12 0 1L N C a P5 3.3 74.0 7 8 5.9 49.5 09 2.0 39.9 59 1.3 76.0 69 0.9 15.2 38 7.2 73.8 58 3.6 02.5 59 0.1 57.9 4D U 1 4 51 4.6 95.6 8 1 9.5 94.6 02 7.8 34.2 54 1.5 77.2 57 0.6 30.4 07 2.4 08.3 06 0.7 67.6 84 8.2 66.2 8P C 32 6.6 91 0.5 6 0.9 99.2 5-2 9.2 59.6 6-5 3.2 81 3.1 3-9 2.5 06.4 3-1 1 0.9 91 1.0 6-1 4 5.7 91 4.0 8-1 9 3.7 41 2.5 3列腺 癌(M e t a s t a t i c h o r m o n e-s e n s i t i v e p r o s t a t e c a n-c e r m,mH S P C),为什么NK细胞对L N C a P的杀伤效果好,而对P C 3细胞反而无杀伤力?甚至促进其生长?可能的机制是NK细胞对mH S P C杀伤效果好而对于C R P C杀伤效果 差甚至起到 反 作 用。P C 3与DU 1 4 5均为低分化、雄激素非依赖的P C a细胞,均具有转移潜能且缺乏内源性的雄激素受体的表达,均同时表达细胞生长因子C K 5和C K 8/1 8;而P C 3与L N-C a P均表现为上皮细胞特性、高表达E-c a d h e r i n、不表达V i m e n t i n。因此,除P C 3细胞不表达野生型P 5 31851西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1 表2 N K细胞在不同效靶比时对L N C a P靶细胞的杀伤率分组T a b l e 2 T h e k i l l i n g r a t e s o f N K t o L N C a P t a r g e t c e l l s a t d i f f e r e n t e f f e c t-t a r g eL N C a P 比率n子集12S t u d e n t-N e wm a n-K e u l s事后多重比较a,b0.1 165 3.3 7 6 71 5 168 3.6 0 5 00.5 168 5.9 4 6 71 0 168 7.2 7 1 72 0 169 0.1 5 1 75 169 0.9 1 1 72 169 1.3 7 3 31 169 2.0 3 0 0显著性1.0 0 00.3 2 3表3 N K细胞在不同效靶比时对D U 1 4 5靶细胞的杀伤率分组T a b l e 3 T h e k i l l i n g r a t e s o f N K t o D U 1 4 5 t a r g e t c e l l s a t d i f f e r e n t e f f e c t-t a r g eD U 1 4 5 比率n子集12345S t u d e n t-N e wm a n-K e u l s事后多重比较a,b0.1 161 4.6 9 8 30.5 161 9.5 9 8 31 162 7.8 3 5 02 164 1.5 7 1 72 0 164 8.2 6 3 31 5 166 0.7 6 3 35 167 0.6 3 8 31 0 167 2.4 0 8 3显著性0.1 6 81.0 0 00.0 6 21.0 0 00.6 1 5表4 N K细胞在不同效靶比时对P C 3靶细胞的杀伤率分组T a b l e 4 T h e k i l l i n g r a t e s o f N K t o P C 3 t a r g e t c e l l s a t d i f f e r e n t e f f e c t-t a r g eP C 3比率n子集12345678S t u d e n t-N e wm a n-K e u l s事后多重比较a,b2 0 16-1 9 3.7 4 3 31 5 16-1 4 5.7 9 6 71 0 16-1 1 0.9 9 3 35 16-9 2.5 0 5 02 16-5 3.2 8 8 31 16-2 9.2 5 0 00.5 160.9 9 5 00.1 162 6.6 9 6 7显著性1.0 0 01.0 0 01.0 0 01.0 0 01.0 0 01.0 0 01.0 0 01.0 0 0蛋白,而DU 1 4 5和L N C a P细胞均可表达野生型P 5 3蛋白外,并没有发现P C 3细胞系与另外两株P C a细胞系的不同之处。然而,P5 3基因是人体的抑癌基因之一,其突变会导致原有抑癌功能的丧失,同时获得新的致癌功能;有研究证明表达野生型P 5 3基因的肿瘤细胞对放、化疗的敏感性强于不表达野生型P 5 3基因的肿瘤细胞2 1。这说明本研究中“NK细胞促进P C 3细胞系生长”的结果,可能是由P C 3细胞系不表达野生型P 5 3蛋白引起的;也可能是由P C 3细胞系的特殊性导致的,而这种“特殊性”在目前的研究资料中并没有呈现出来,因此需要后续进行深入研究探索其作用机制。本研究的结果为肿瘤免疫逃逸的研究提供了可作为目标的研究细胞以及研究方向,为应用NK细胞过继性回输治疗前列腺癌的临床应用奠定了基础。4 结论采用细胞因子诱导扩增P BMC s的方法能够获得纯度较高、数量足够的NK细胞,为NK细胞的临床应用奠定基础;NK细胞对3种P C a细胞系的杀伤率差异极显著,为后续进行深入研究探索原因及作用机制提供了方向。2851西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1【参考文献】1HE H,L I ANG L,HAN D,e t a l.D i f f e r e n t T r e n d s i n t h e I n c i-d e n c e a n d M o r t a l i t y R a t e s o f P r o s t a t e C a n c e r B e t w e e n C h i n a a n d t h e U S A:A J o i n p o i n t a n d A g e-P e r i o d-C o h o r t A n a l y s i sJ.F r o n t M e d(L a u s a n n e),2 0 2 2,9:8 2 4 4 6 4.2S C HA T T E N H.B r i e f O v e r v i e w o f P r o s t a t e C a n c e r S t a t i s t i c s,G r a d i n g,D i a g n o s i s a n d T r e a t m e n t S t r a t e g i e sJ.A d v E x p M e d B i o l,2 0 1 8,1 0 9 5:1-1 4.3T O R R E 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