netrin-1及其受体在非神经系统中的作用.pdf

netrin-1 及其受体在非神经系统中的作用贾盛元，孙振民，李艳艳，翟朝晖*（潍坊医学院整形外学科研究所，潍坊 261053）摘要轴突生长导向因子-1（netrin-1）是 netrins 家族中研究最广泛的成员。netrin-1 最初被认为是胎儿发育过程中轴突引导的调节因子，与其经典受体非协调 5（uncoordinated-5,UNC5）与结直肠癌缺失基因（deleted in colorectal cancer,DCC）共同介导轴突的吸引或排斥。随着更多netrin-1受体的发现，如唐氏综合征细胞粘附分子（down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM）、整合素 64（integrin 64，In64）和整合素 31（integrin 31，In31）、腺苷 A2B 受体（A2B adenosine receptor，A2BAR）和 CD146 等的发现，扩展了 netrin-1 在非神经系统的功能，如调控血管生长，肿瘤生长，细胞凋亡，炎症发展。本文就 netrin 1 及其受体在非神经系统中的作用的研究进展进行概述。关键词轴突生长导向因子-1；CD146；经典受体非协调 5B；腺苷受体 A2B；整合素 64中图分类号R363 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2023.03.012The role of netrin-1 and its receptor in non-nervous SystemJia Shengyuan,Sun Zhenmin,Li Yanyan,Zhai Zhaohui*（Plastic Surgery Institute of Weifang Medical University,Weifang 261053,China）AbstractThe axonal growth guidance factor 1(netrin-1)is the most extensively studied member of the netrins family.Ne-trin-1,initially considered a regulatory factor guided by axons during fetal development,along with its classical receptor uncoordinated 5(UNC5)and deleted in colorectal cancer(DCC),mediates axonal attraction or rejection.With the discovery of more netrin-1 recep-tors,such as down syndrome cell adhesion molecule(DSCAM),integrin 64(In64)and integrin 31(In31),adenosine A2B receptor(A2BAR)and CD146,the functions of netrin-1 in non nervous systems has been expanded,such as regulating vascular growth,tumor growth,cell apoptosis,and inflammatory development.This article provides an overview of the research progress on the role of netrin-1 and its receptors in non neural systems.KeywordsNetrin-1;CD146;uncoordinated-5B;A2B adenosine receptor;integrin 64中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 32 卷第 3 期2023 年 6 月Vol.32.No.3June.2023收稿日期2022-07-23 修回日期2023-06-02基金项目山东省自然科学基金重点项目（ZR2020KE0 18）；山东省自然科学基金（ZR2022MH211）；潍坊市科技发展计划（2020YX040）作者简介贾盛元，男（1993 年），汉族，硕士研究生*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：轴突生长导向因子（netrin）在哺乳动物中包括 3 个成员，netrin-1、netrin-3（与层粘连蛋白 链同源）和 netrin-4/Netrin（与层粘连蛋白 链同源）1。Netrin-1 是一种由 NTN1 基因编码的可溶性蛋白，含有 640 个氨基酸，分子量约为 67 000。结构类似于层粘连蛋白，包括 N 端的层粘连蛋白样结构域（LN，又称 VI 域）、3 个表皮生长因子（EGF）重复序列（EGF1、EGF2 和 EGF3）或 EGF 域和C 端的 netrin 样结构域（NTR）（图 1）。最初认为 netrin-1 主要在神经发育过程中指导细胞和轴突迁移，随后研究发现，netrin-1 受体众多，且分布广泛，在非神经系统中也发挥重要作用，如促进或抑制血管生成，促进或抑制肿瘤生长2-7，促进或抑制炎症8，促进组织器官发育9-12。本文就 netrin-1 的受体及其与受体的关系在非神经系统中发挥的作用予以综述。1 netrin-1 的受体netrin-1 的受体包括结直肠癌缺失基因（deleted 图 1 Netrin-1 的分子结构Fig.1 Molecular structure of Netrin-1贾盛元等.netrin-1 及其受体在非神经系统中的作用第 3 期 301in colorectal cancer,DCC）、非协调-5（uncoordinat-ed-5,UNC5）家族（UNC5AD）、唐氏综合征细胞粘附分子（down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM）、整合素 64（integrin 64，In64）和整合素 31（integrin 31，In31）、腺苷 A2B受体（A2B adenosine receptor，A2BAR）和 CD146等13-17。1.1 DCCDCC 是一个跨膜受体，属于依赖性受体18-20，在许多正常组织中均有表达，但在大多数结直肠癌中缺失，故命名为 DCC21,22。当缺乏相应配体时，依赖性受体会诱导细胞凋亡20。在细胞外，DCC 由4 个 Ig 结构域和 6 个纤维连接蛋白 III（FNIII）型结构域组成，其中第 4 和第 5 个 FNIII 重复序列为netrin-1 的结合点23,24。在细胞内，包含 3 个高度保守的序列，称为 P1、P2 和 P3 基序25，其中 P3 基序与粘着斑激酶结合，促进细胞骨架重排。过去对DCC 的研究多局限在其促进神经生长方面，近来有研究表明 DCC 在促进癌细胞死亡与保护心肌细胞缺血再灌注损伤等方面也发挥作用。以往的研究表明 netrin-1 低表达时通过 DCC 受体触发癌细胞死亡，在肠癌中起抑癌作用。最近Boussouar 等人研究发现，在人黑色素瘤细胞系中重新表达 DCC 可促进异种移植小鼠模型中的肿瘤细胞死亡26。DCC 在心脏缺血再灌注损伤中保护心肌细胞。在一项心脏缺血再灌注损伤实验中，netrin-1 有效地激活DCC受体，从而激活ERK1/2/eNOSs1177通路，并在心肌内皮细胞和心肌细胞产生一氧化氮（NO）27,28。NO 已被认为是减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡的一个显著因素29,30。netrin-1/DCC可能成为心脏缺血再灌注损伤治疗干预的一个有前途的靶点。因此，外源性netrin-1或是能增加netrin-1和DCC表达的药物，是治疗心脏缺血/再灌注损伤的新型候选药物分子之一。1.2 UNC5UNC5 蛋白家族是一类 I 型跨膜蛋白，包括UNC5A、UNC5B、UNC5C 和 UNC5D 4 个成员。图 2 UNC5B 诱导的促凋亡信号Fig.2 Proapoptotic signaling induced by UNC5B中国组织化学与细胞化学杂志302第 32 卷与 DCC 不同，UNC5 受体在胞外序列中有两个免疫球蛋白（Ig）样结构域和两个凝血酶反应蛋白 I 型（thrombospondin type I，TSP I）结构域，在细胞内序列中有一个 ZU5 结构域、一个含有 DCC 结合基序的结构域（又称 UPA 结构域）和一个死亡结构域（death domain，DD）23,31-33。在 UNC5 家族中对UNC5B 的研究最为广泛，涉及多个方面，包括抑制神经生长，促进细胞凋亡以及抑制炎症。UNC5B 同为配体依赖性受体，参与介导细胞凋亡。在没有 netrin-1 的情况下，UNC5B 胞内区被Caspase-3 切割后与丝氨酸/苏氨酸死亡相关蛋白激酶（death-related protein kinase，DAPK）和全酶蛋白磷酸酶 2A（protein phosphatase2A，PP2A）的磷酸酶调节亚基 65（phosphatase regulatory subunit 65，PR65）形成复合体，进而诱导细胞凋亡（图2）34。然而，当 netrin-1 存在时，UNC5B 采用封闭的构象，并与磷酸化的非活性形式的 DAPK 和致癌抑制物 PP2A（carcinogenic inhibitor of PP2A，CIP2A）相互作用，发送细胞存活信号35。UNC5B 同样可以促进血管内皮细胞和卵巢癌细胞凋亡。UNC5B 已被证明是 p53 的直接转录靶标，它响应 DNA 的损伤而上调，通过胞内的死亡结构域促进细胞凋亡36。体外实验显示，UNC5B 在缺氧条件下介导 p53 依赖性的细胞凋亡37。Yang 等人的研究也表明，UNC5B 通过激活 ROS-P53 途径促进内皮细胞衰老38。还有更多的研究表明，UNC5B可以通过促进内皮细胞凋亡，从而调控血管生成方向31,35,39。在血管内皮细胞中，使用特定的 siRNA来敲低 UNC5B，无论浓度如何，都会导致细胞增殖和迁移能力显著丧失40。Zeng 等人发现，通过抑制UNC5B，可以抑制卵巢癌细胞增殖和迁移。遗憾的是，Zeng 等人没有继续探究，抑制卵巢癌细胞增殖的通路是否与之前发现的UNC5B凋亡通路一致。但他们的实验表明，UNC5B有潜力成为治疗卵巢癌的新靶点41。除上述功能外，UNC5B 还可在多种病理条件下减轻炎症水平。Ramesh 等人分析白细胞亚群上不同的 netrin-1 受体发现，UNC5B 的表达非常高，而UNC5C、UNC5D 和 DCC 不表达，UNC5A 的表达很少或可以忽略不计，这表明UNC5B可能是这些白细胞的主要受体42。肾缺血再灌注损伤后，netrin-1及其受体 UNC5B 的表达发生动态变化，循环中的netrin-1 减少，而间质中分布的 netrin-1 从内皮细胞转移向肾小管上皮细胞43。随着肾小管损伤，尿中netrin-1 水平增高。所以 netrin-1 可能是肾炎症损伤的标记物。当使用外源性 netrin-1 治疗时，UNC5B 通过减少中性粒细胞对肾脏的渗透而减轻肾脏损伤。近端小管特异性缺失 UNC5B 的小鼠在糖尿病诱导后 8周出现比杂合子和野生型小鼠更严重的蛋白尿，表明 UNC5B 受体信号在减轻肾脏损伤方面具有保护作用44。在一项关于急性肺损伤的研究中，脓毒症患者的 netrin-1 及其受体 UNC5B 水平降低，而过表达 netrin-1 则减轻内毒素诱导的 BEAS-2B 细胞的炎症水平并增加了 UNC5B 水平45。以上研究表明netrin-1 通过 UNC5B 抑制炎症进而减轻炎症损伤。最近的一项研究让 UNC5B 抑制炎症的作用受到了挑战。在低氧条件下，氧化低密度脂蛋白和缺氧诱导因子-1 通过激活促炎信号，如 NF-B，显著地诱导斑块巨噬细胞 netrin-1 和 UNC5B 启动子的活性，使 netrin-1 与 UNC5B 表达上调，抑制巨噬细胞从动脉粥样硬化斑块迁移，加剧慢性炎症46。Schlegel等人进一步证实，在晚期动脉粥样硬化中沉默 netrin-1 可改善动脉粥样硬化炎症并促进斑块消退47。netrin-1/UNC5B 在动脉粥样硬化斑块中表现为对炎症的促进，可能受巨噬细胞亚型极化的影响。netrin-1/UNC5B 在动物肾缺血再灌注损伤模型、糖尿病肾病模型、脓毒症患者观察性研究以及细胞体外实验中均表现出显著的炎症抑制作用，而在动脉粥样硬化模型中加重炎症水平。这种相反的结果，可能由 netrin-1 的来源、浓度和实验模型的差异性导致的。对其通路的进一步研究可能有助于解释 Netrin-1 在炎症中的差异表现。目前，对 UNC5 家族的其他成员的研究较少。UNC5A 通过诱导自噬而不是通过诱导细胞凋亡抑制丙型肝炎病毒复制48，还可以调节雌激素及其受体介导的信号转导49。netrin-1通过UNC5A 激活NF-B 信号通路，促进胶质瘤细胞的生长50,51。netrin-1及其受体 UNC5A 参与 细胞的凋亡信号，外源性netrin-1 治疗可促进成人 细胞存活52。UNC5C 触发未分化精原细胞的黏附/迁移，调节精原细胞的分化，维持精原细胞的稳态53。无配体时UNC5C被-贾盛元等.netrin-1 及其受体在非神经系统中的作用第 3 期 303分泌酶切割，增加神经细胞的死亡，加速阿尔茨海默病的病理变化，损害学习和记忆54。对 UNC5A、C、D 还有待开展更广泛的研究。1.3 CD146CD146最初于1987年被确定为黑色素瘤的肿瘤标志物，也被称为黑色素瘤细胞粘附分子55，是免疫球蛋白超家族的一员55。CD146 参与细胞粘附、迁移、增殖、分化和免疫应答56，其在细胞外片段中包含 5 个 Ig 域，1 个跨膜区域和 1 个短的细胞质尾部56，在细胞外区域缺乏 FNIII 重复序列6。netrin-1 与 CD146 高亲和力结合在内皮细胞上，相互作用调节血管生成6。CD146 作为 VEGF 受体-2（VEGFR-2）的共受体，主要参与 VEGF 诱导的VEGFR-2 磷酸化57，通过 ERK1/2 和 p38 途径促进内皮细胞活化和血管生成58（图 3）。Tu 的研究显示，50 ng/mL 或 200 ng/mL 的 netrin-1 可以诱导VEGFR2、ERK1/2 和 p38 的磷酸化，而 2000 ng/mL的 netrin-1 则抑制这些蛋白质的磷酸化6。值得注意的是CD146与VEGFR-2的相互作用是独立于VEGF的57。这表明，netrin-1 具有替代 VEGF 成为抗肿瘤的新靶点的潜力。虽然研究表明 CD146 可以促进血管生成，但目前在 CD146 和 netrin-1 敲除的小鼠中还没有明确的发育性血管生成缺陷的报道。后续研究发现，CD146 不直接参与 netrin-1 介导的促进内皮祖细胞血管生成，但介导 Netrin-1 在内皮祖细胞中的抗凋亡作用59。Guo 等人的研究表明，netrin-1 通过与血管内皮细胞中的CD146相互作用诱导卵巢子宫内膜异位瘤的血管生成60。这些研究可能意味着，netrin-1/CD146 的相互作用对于病理条件（如伤口修复、缺血或肿瘤）相关的血管生成比血管发育更重要。1.4 A2BARA2BAR 是属于 A 类 G 蛋白偶联受体的腺苷受体，含有 7 个跨膜结构域，由 3 个胞内和 3 个胞外环连接，1 个胞外 N 端和 1 个胞内 C 端。前文已述UNC5B 具有减轻炎症的作用，近来对 A2BAR 的研究表明该受体同样具有抑制炎症的作用。对部分netrin-1 缺乏的小鼠的遗传学研究显示，糖尿病肾病动物的肾脏损伤更严重，而重组 netrin-1 治疗组通过 A2BAR 信号转导，减少蛋白尿并改善组织学评分61。Yang 等人发现，中性粒细胞源性 netrin-1 通过A2BAR可降低心肌缺血再灌注损伤38。Zhang等人的实验证实，netrin-1 通过 A2BAR 促进巨噬细胞向 M2 表型转化，促进炎症消退62。M1 到 M2 巨噬细胞表型的转变障碍会导致炎症消退迟滞，从而引起组织损伤。netrin-1/A2BAR 加速了巨噬细胞表型的转化，促进了炎症的消退。A2BAR 抗炎的信号传导还有待于进一步研究。虽然对 netrin-1 在炎症中的作用（抑制或促进炎症）的研究有很多，但对其受体及通路仍不甚了解。UNC5B 和 A2BAR 抗炎或促炎的信号传导还有待于进一步研究。但基于现有的研究，亦可以肯定UNC5B 和 A2BAR 具有治疗炎症疾病的前景。1.5 In64 和 In31In64 和 In31 主要是在上皮细胞中表达的图 3 CD146 是 VEGFR2 的共受体Fig.3 CD146 is a coreceptor of VEGFR2中国组织化学与细胞化学杂志304第 32 卷层粘连蛋白受体，它们与上皮组织的分支形态发生（branching morphogenesis，原有上皮细胞发生分支并侵入生长的重复过程）、发育和功能有关63-66。Yebra等人的研究结果表明In64在内皮细胞与ne-trin-1 的粘附中起主要作用。这种相互作用可以被定位到netrin-1的C末端的一个高度碱性的区域，该区域类似于层粘连蛋白的富含碱性残基的结构域3,67。In31与In64通过netrin-1趋化上皮细胞的迁移。3 和 6 基因敲除小鼠不仅在上皮细胞中表现出明显的细胞粘附和迁移缺陷，在神经组织中也有相同的表现68,69。这提示 3 和 6 整合素亚基对 netrin-1的识别可能对DCC/netrin-1依赖的神经轴突引导和细胞迁移途径发挥重要的互补作用。以上研究的结果可能对 netrin-1/整合素受体在其他发育中的上皮细胞中的功能具有普遍意义。另一项研究表明，netrin-1 通过 In64/c-Src/Tiam1/Rac1 促进人脐带血间质干细胞增殖。c-Src是 In64 的关键下游效应因子70，是该通路促进细胞增殖的关键71。活性 c-Src 可以磷酸化并增强Tiam1，这是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，对 Rac1表现出高度的特异性。Rac1主要通过Tiam1被c-Src激活72。Lee 等人认为，netrin-1/In64 触发 c-Src的磷酸化以调节膜脂筏部分中的Rac1活化73。这些研究明确了 netrin-1/In64 可以促进人脐血间充质干细胞增殖。且 In64 和 In31 在 netrin-1 上皮细胞粘附/迁移中的作用尤为引人关注，因为这一发现首次引入了近距离的细胞粘附/迁移作用。该作用有别于过去认为的 netrin-1 作为远程化学引导线索34。2 netrin-1 与其受体的关系炎症发生时，循环中的 netrin-1 减少，下调的netrin-1 水平与单核细胞趋化蛋白-1 和 IL-6 的表达增加以及白细胞组织的浸润相关。大多数白细胞亚群上Unc5b的表达非常高，外源性netrin-1与Unc5b受体结合，通过减少中性粒细胞对组织的浸润，同时减少环氧合酶-2(COX-2)的表达和前列腺素 E-2(PGE-2)的产生从而减轻炎症损伤。netrin-1 在体外抑制 T 细胞产生 IL-2、IL-6、IL-17 和干扰素-。Netrin-1也可以减轻RAG-1基因敲除小鼠的炎症反应。表明netrin-1对中性粒细胞浸润的影响不依赖于T 和 B 细胞。netrin-1 过表达增加了精氨酸酶-1、IL-4 和 IL-13 的表达，降低了 COX-2 的表达，表明巨噬细胞通过激活PPAR途径向M2样表型转变。这种巨噬细胞的表型转化可能是通过 A2BAR 受体实现。血管和神经往往遵循平行的轨迹，促使人们调查netrin-1是否影响血管化和神经支配。netrin-1对血管生成和血管系统产生双重影响，这取决于它所结合的受体。netrin-1 受体 UNC5B 选择性地表达在血管系统中，netrin-1 通过 UNC5B 的信号传导在引导血管生成中起着排斥作用，如内皮细胞丝状延伸、血管分支和异常导航。netrin-1 诱导血管生成的机制之一是由 DCC 介导的，DCC 激活下游 ERK1/2 信号，随后通过丝氨酸 1179 磷酸化 eNOS 增加内皮 NO 的产生，形成内皮细胞生长和迁移的前馈信号级联。此外，netrin-1 通过调节 PI3K/AKT-eNOS 信号，改善高血糖暴露时的内皮细胞损伤。netrin-1 诱导血管的另一机制是通过 In64 和 In31 受体调节上皮迁移。3 展望netrins 是神经发育过程中细胞迁移和轴突生长的重要趋化因子线索。早期大多数研究都集中在胚胎神经系统中的远程引导线索作用。但近几年的研究显示，netrins 及其受体在整个发育和成年期参与多种组织的一系列功能，如调节炎症、细胞粘附、调节血管生长以及在肺和胰腺的发育中发挥作用，这极大的扩展了 netrins 及其受体的研究方向。最近研究发现，netrin-1 及其受体在几种细胞环境中调节粘附，该发现挑战了netrin-1在神经和血管生成中作为远程引导线索的作用。然而，在发育过程中指导轴突运动的信号机制如何在随后的成熟过程中转换，以调节细胞间相互作用和粘附仍有待确定。在成熟组织中，新的发现令人兴奋，netrin-1 参与调节成体干细胞迁移、肿瘤细胞存活和炎症消退，这些发现表明调节 netrin-1 及其受体可能是抑制疾病损伤或促进恢复的新方向74。在欧洲肿瘤医学会大会会议上一项关于抗 netrin-1（NP137）联合化疗和/或派姆单抗治疗局部晚期/转移性子宫内膜癌或宫颈癌患者的安全性和有效性的多组随机/期试验被报道75。试验结果让人期待的同时，也意味着 netrin-1 在癌症治疗中步入新的阶段。netrin-1 及其受体在肿瘤治疗中备受关注的同时，越来越多的研究发现，netrin-1 还可作为多种非肿瘤疾病的诊断标志物的潜力，这种潜力可能来自于netrin-1及其受贾盛元等.netrin-1 及其受体在非神经系统中的作用第 3 期 305体在炎症中的作用。遗憾的是，netrin-1 及其受体在炎症中发挥作用的信号传导机制，以及netrin-1对炎症是促进还是抑制还未有定论。因此，了解 netrin-1及其受体和所涉及的下游信号传导机制，有助于开发神经退行性疾病、血管疾病、炎症疾病、和癌症的诊断方法与治疗方法76,77。参 考 文 献1 Roome RB,Rastegar-Pouyani S,Ker A,et al.Netrin1 and reelin signaling are required for the migration of anterolat-eral system neurons in the embryonic spinal cordJ.Pain,2022,163(4):e527-e539.2 Li Q,Cai H.Induction of cardioprotection by small ne-trin-1-derived peptidesJ.Am J Physiol Cell 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