LMNB1在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第16期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.16LMNB1在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响程健祥1 杜文升2 魏敏2 王光慧21徐州医科大学研究生院(江苏徐州 221004);2徐州医科大学附属医院妇科(江苏徐州 221002)【摘要】目的探讨层黏连蛋白B1(LMNB1)在卵巢癌组织中的表达情况及其对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及相关机制。方法通过TCGA和GEO数据库分析LMNB1在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达差异。利用 Kaplan-Meier Plotter 数
2、据库分析LMNB1表达水平与卵巢癌患者预后之间的关系。收集68例新鲜卵巢癌组织标本和27例正常卵巢组织标本,通过免疫组化法检测卵巢癌组织和正常卵巢组织中 LMNB1 的表达情况,并分析其表达水平与临床病理特征间的关系;慢病毒构建稳定敲低LMNB1的卵巢癌SKOV3细胞系,细胞实验检测LMNB1对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,Western blot实验检测LMNB1对MMP-9、MMP-2、TIMP-1的影响。生物信息学进行GO富集分析和KEGG通路分析,探索 LMNB1 潜在的生物学功能和信号通路。结果数据库分析结果表明 LMNB1 在卵巢癌上高表达,并且LMNB1的高表达
3、与卵巢癌的不良预后相关(P 0.05)。免疫组化结果表明卵巢癌组织中的LMNB1蛋白表达高于正常卵巢组织(P 0.05),LMNB1的表达与卵巢癌患者的FIGO分期、组织学分级有明显相关性(P 0.05)。敲低 LMNB1 可以抑制卵巢癌 SKOV3 细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P 0.05)。富集分析显示与 LMNB1 共表达基因在卵巢癌中主要参与调控 PI3K-AKT、P53 通路、细胞周期和凋亡。结论LMNB1在卵巢癌中高表达,并可促进卵巢癌SKOV3细胞的恶性生物学行为,其机制可能是通过调控PI3K-AKT、P53通路、细胞周期和凋亡来实现的。【关键词】LMNB1;卵巢癌;侵袭;迁移【
4、中图分类号】R71Expression of LMNB1 in ovarian cancer and its effect on biological behavior of ovarian cancer cells CHENG Jianxiang*,DU Wensheng,WEI Min,WANG Guanghui.*School of Graduate,Xuzhou Medical University,Xuzhou 221004,ChinaCorresponding author:DU Wensheng Email:【Abstract】ObjectiveTo investigate th
5、e expression of lamin B1(LMNB1)in ovarian cancer and its effect on the proliferation,migration and invasion of ovarian cancer cells and mechanism.Methods Expression of LMNB1 in ovarian cancer tissues and normal ovarian tissues was analyzed by TCGA database and GEO database;Kaplan-Meier plotter was u
6、sed to analyze the effect of LMNB1 mRNA expression on the prognosis of patients with ovarian cancer.Sixty-eight ovarian cancer specimens and twenty-seven normal ovarian tissues were selected.The level of LMNB1 was detected in ovarian cancer tissues and normal tissues by immunohistochemistry,and the
7、relationship between LMNB1 and clinicopathological features was analysed.LMNB1-knockdowned SKOV3 ovarian cancer cell lines were constructed,then the effects of down-expression of LMNB1 on proliferation,migration,and invasion of ovarian cancer cells were detected by CCK-8,colony formation assay,scrat
8、ch wound healing assay,transwell assay and Edu assay.The expression of MMP2,MMP9,TIMP1 were detected by Western blot after the LMNB1 expression level was knockdowned.Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyelopedia of Gene and Genomes(KEGG)were used to enrich the biological functions and signaling pathways o
9、f LMNB1 and related proteins.ResultsThe expression of LMNB1 gene in human ovarian cancer tissues was significantly higher than that in normal ovarian tissues(P 0.05).Patients with high LMNB1 expression had poorer overall survival(P 0.05).Immunohistochemistry show that the expression level of LMNB1 w
10、as significantly upregulated in ovarian cancer tissues(P 0.05),and was correlated with pathological differentiation and Pathological stage.Silencing LMNB1 临 床 研 究doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2023.16.011基金项目:江苏省妇幼健康科研项目(编号:F201903);徐州市卫生健康委科研项目(编号:XWRCHT20220039)通信作者:杜文升 E-mail:2077实用医学杂志 2023年第39卷第1
11、6期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.16expression in SKOV3 cells significantly inhibited its proliferation,migration and invasion ability(P 0.05).LMNB1 and its co-expressed genes are mainly involved in PI3K-AKT pathway,P53 signaling pathway,cell cycle signaling pathway and cell apopto
12、sis pathway.ConclusionThe expression of LMNB1 in ovarian cancer tissues was significantly higher than in normal tissues,and strengthened the proliferation,invasion and migration ability of ovarian cancer cells.The mechanism of LMNB1 in ovarian cancer may be to regulate the activities of PI3K-AKT pat
13、hway,P53 signaling pathway,cell cycle signaling pathway and cell apoptosis pathway.【Key words】LMNB1;ovarian cancer;invasion;migration卵巢癌是妇科最常见的三大癌症之一,致死率位于妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌发病初期没有明显的临床症状,导致大约70%的患者就诊时候为晚期,而且大约 70%的卵巢癌患者在治疗 3 年后会再次复发1,因此晚期卵巢癌的五年生存率低至 30%2。即使现在外科技术飞速发展,卵巢癌的治疗和预后仍没有明显改善3-4。卵巢癌恶性程度高,侵袭性强而且预后极
14、差,目前其发病原因、分子机制仍然没有明确共识。因此,研究卵巢癌侵袭和转移的机制,寻找到有效的治疗靶点显得尤为重要。LMNB1是V型中间丝蛋白家族的重要成员之一,与LMNA、LMNC、LMNB2一起组成了核层(NL)的主要成分 V 型中间丝蛋白5。据报道,LMNB1广泛的参与多种生物活动,如 DNA 复制和转录、细胞周期的调节、核迁移和凋亡、细胞的增殖和分化6。近年来,关于LMNB1在肿瘤中的作用越来越引起人们的关注,TANG 等7的研究表明LMNB1在肺癌中作为肿瘤促进因子,并且LMNB1的敲低可以调节细胞增殖和凋亡。王瑞官等8通过siRNA敲低LMNB1在肝癌HepG2和Hep3B细胞中的表
15、达,发现 LMNB1 可以显著降低端粒酶活性,细胞增殖和侵袭能力,表明LMNB1有望成为评价肝癌患者临床预后的指标。据报道,LMNB1的过表达同样与前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌和肝癌的发生发展密切相关9-11。然而,LMNB1在卵巢癌中的作用及临床意义知之甚少,本研究通过实验分析LMNB1 在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌 SKOV3细胞生物学行为的影响,并通过生物信息学初步探讨LMNB1在卵巢癌发生发展中的具体机制,以期为卵巢癌的靶向治疗提供新的思路。1资料与方法1.1临床资料收集2019年9月至2022年12月徐州医科大学附属医院妇科卵巢癌患者手术切术标本68例,正常卵巢组织27例。所有卵巢癌患者
16、均经病理科医生明确诊断为卵巢癌,术前均未接受放化疗、排除合并其他恶性肿瘤和免疫系统疾病。正常卵巢组织来源于生殖系统良性疾病患者的手术切除标本。所有患者临床病例资料完整,均签署知情同意书,本研究已经获得徐州医科大学 附 属 医 院 伦 理 委 员 会 的 批 准(XYFY2023-KL106-01)。1.2细胞系及实验材料正常卵巢上皮细胞IOSE80,卵巢癌细胞 SKOV3、A2780、CAOV3 均购自中国科学院上海细胞库。RPMI-1640 培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。LMNB1兔抗人抗体、MMP-2兔抗人抗体、MMP-9兔抗人抗体购自Proteintec
17、h公司。SDS-PAGE制胶试剂盒购自上海雅酶生物技术有限公司。Matrigel基质胶购自美国BD公司,Transwell小室购自美国Corning公司。Edu细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物技术公司。1.3数据库信息处理和分析TCGA数据库和GEO数据库下载 LMNB1 在卵巢癌上表达情况的相关信息,R 语言处理将患者按照表达量中位数分为高表达组和低表达组,并绘制相关表达差异图。Kaplan-Meier Plotter 分析 LMNB1 的表达量和卵巢癌患者预后之间的关系,R软件中pROC包用于分析,ggplot包绘制ROC曲线。1.4免疫组化将所有组织的石蜡切片烘烤后,放入不同浓度梯度的
18、二甲苯和酒精溶液中进行脱蜡和水化,用柠檬酸钠抗原修复液在微波炉中进行抗原修复。PBS浸泡,滴加3%过氧化氢覆盖组织以去除过氧化氢酶。稀释后的一抗滴于标本玻片上,4 oC 孵育过夜。次日,取出湿盒恢复室温,按照超敏二步法试剂盒说明书进行DAB染色。再经过苏木素染核,盐酸酒精分化、返蓝、脱水封片,即可显微镜下观察。1.5Western blot在冰上用RIPA法提取各组细胞和组织蛋白,BCA 法测量蛋白浓度后,配平制作样品。配制 10%的 SDS-PAGE 分离胶,上好样品后,分离胶80 V电泳30 min,浓缩胶120 V电泳90 min。将提前裁剪好的PVDF膜甲醇预激30 s,110 V恒流
19、湿转1.5 h。5%脱脂牛奶封闭2 h,TBST清洗后,4 oC过夜孵育一抗。次日,TBST清洗3次,孵育二抗2 h,TBST洗膜3次后,显影仪进行显影并拍照。2078实用医学杂志 2023年第39卷第16期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.161.6细胞划痕实验用Marker笔在6孔板背后垂直划 3 条线,将生长状态良好的各组细胞均匀种植于六孔板中,待细胞生长完全融合后,用移液枪头垂直于细胞平面用力均匀划痕,PBS冲洗3遍,洗去划落的细胞。将细胞放回培养箱培养,在0、24、48 h取出细胞,显微镜观察并拍照。1.7Transw
20、ell 实验选取各组生长状态良好的细胞,胰酶消化后用不完全培养基重悬细胞,调整好细胞密度吸取200 L置于小室上层,在小室下层加入 600 L 完全培养基,培养箱培养 48 h 后,取出小室,弃去培养基,PBS清洗3次。4%多聚甲醛固定30 min后弃去固定液,结晶紫染色20 min,PBS清洗3遍,棉签轻轻擦去内室细胞,显微镜下观察并拍照。侵袭实验使用 Matrigel 基质胶包被小室,其余操作和迁移实验相同。1.8EdU细胞增殖实验选取对数生长期细胞,接种于 96 孔板,按照试剂说明书进行 EdU 标记、细胞固定化、Apollo染色、DNA染色、拍照并统计。1.9集落形成实验将处于对数生长
21、期的各组细胞用胰酶消化后,完全培养基重悬,细胞计数板计数,以每孔500细胞的数目接种于6孔板中,放在培养箱中培养14 d,肉眼可见克隆后,4%多聚甲醛固定,PBS清洗,用结晶紫染液进行染色20 min,PBS洗涤后,晾干,拍照并统计。1.10统计学方法所有研究数据均采用 SPSS 22.0,GraphPad Prism 8.0 进行统计分析并绘制相应统计图,独立样本 t 检验比较两组样本间的差异;不满足t检验条件的采用非参数检验。P 0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1生物信息学分析LMNB1在卵巢癌上的表达和预后情况通过 TCGA 数据库和 GEO 数据库分析LMNB1在卵巢癌和正常卵
22、巢上的表达差异,结果显示 LMNB1 在卵巢癌上高表达(P 0.01)。Kaplan-Meier Plotter 分析 LMNB1 的表达和卵巢癌患者预后之间的关系,结果表明 LMNB1 的高表达和卵巢癌的不良预后相关(P 0.05)。R 软件中pROC包用来分析LMNB1在卵巢癌中潜在诊断价值,结果显示:ROC曲线下面积(AUC)为0.981,表明 LMNB1 在卵巢癌中具有良好的诊断价值。见图1。2.2免疫组化检测LMNB1蛋白在卵巢癌组织中的表达卵巢癌组织中 LMNB1 的阳性表达率为75%(51/68),在正常卵巢组织中的阳性表达率为22%(6/27)。与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织的
23、LMNB1阳性表达率明显升高,差异有统计学意义(P 0.05)。见图2。*TCGANormalTumorNormalOvarian cancerNormalOvarian cancerGSE12470*111098765The expression level of LMNB1GSE10971*1098765The expression level of LMNB16420The expression level of LMNB1Log2(TPM+1)LMNB1(203276_at)LMNB1(203276_at)LMNB1(203276_at)OSPFSHR=1.22(1.06 1.41)l
24、ogrank P=0.0046HR=1.16(1.02 1.33)logrank P=0.027Expressionlowhigh0501001502002501.00.80.60.40.20.0ProbabilityExpression1.00.80.60.40.20.0Probability050100150200250时间(月)时间(月)Number at risklow 558 11444 6 0 0high 1098 28453 12 2 0Number at risklow 991117 286 1 0high 444 55 72 0 00.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.
25、0LMNB1AUC:0.981CI:0.970 0.9911.00.80.60.40.20.01-特异度(FPR)敏感度(TPR)ABCDEF注:A,TCGA数据库中LMNB1在卵巢癌组织和正常卵巢组织上的表达;B-C,GEO数据库中LMNB1在卵巢癌组织和正常卵巢组织上的表达;D-E,Kaplan-Meier Plotter中LMNB1在卵巢癌上的预后分析;F,LMNB1在卵巢癌中的ROC曲线。*P 0.05);而肿瘤的 FIGO 分期、组织学分级等与 LMNB1 的阳性表达有相关性(P 0.05)。见表1。2.4LMNB1在卵巢癌细胞上的表达情况以及稳转细胞系的构建Western blot
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