HPLC法测定藏药十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的含量.pdf

432 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期收稿日期：2022-07-11作者简介：杨小兰，硕士研究生，研究方向为中药制剂工艺与质量标准研究，E-mail:*通讯作者：谢和兵，硕士生导师，研究方向为高原医学研究、传统藏药的产业化开发，E-mail:Binghe_HPLC法测定藏药十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的含量 杨小兰1,2，谢和兵1,2,3*，尼玛次仁3，白玛旦增3，姜少婷4（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230000；2.江苏神猴医药研究有限公司，江苏 南通 226133；3.西藏神猴药业有限责任公司，西藏 聂拉木 858300；4.南京归禾至康生物医药科技有限公司，江苏 南京 210038）摘 要：目的 建立十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的含量测定方法。方法 采用UItimate XB-C18（4.6 mm250 mm，5 m）色谱柱，以甲醇-0.7%磷酸（三乙胺调节pH 6.0）（27:73）为流动相，流速为1.0 ml/min，进样量为10 l，检测波长403 nm，柱温25。结果 羟基红花黄色素A在23.4411195.3424 g/ml范围内呈线性（r=0.9996）；平均回收率（n=6）为99.9%，RSD为1.4%。结论 该方法灵敏度高，重复性好，测定结果准确，可用于十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的测定。关键词：十六味杜鹃花丸；羟基红花黄色素A；高效液相色谱法中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）05-0432-04DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.010Determination of Hydroxysafflor Yellow A in Tibetan Medicine Shiliuwei Dujuanhua Pills by HPLCYANG Xiao-lan1,2,XIE He-bing1,2,3*,NIMA Ciren3,BAIMA Danzeng3,JIANG Shao-ting4(1.School of Pharmacy,Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230000,China;2.Jiangsu Shenhou Pharmaceutical Research Co.,Ltd.,226133,China;3.Tibet Shenhou Pharmaceutical Research Co.,Ltd.,Nyalam 858300,China;4.Nanjing Guihe Zhikang Biomedical Technology Co.,Ltd.,Nanjing 210038,China)Abstract:Objective To establish a method for the determination of hydroxysafflor yellow A in Shiliuwei Dujuanhua Pills.Method An UItimate XB-C18(4.6 mm250 mm,5 m)chromatographic column was used with methanol-0.7%phosphoric acid(triethylamine adjusted to pH 6.0)(27:73)as mobile phase.The flow rate was 1.0 ml/min.The injection volume was 10 l.The detection wavelength was 403 nm.The column temperature was 25.Results The linear range of hydroxysafflor yellow A was 23.4411-195.3424 g/ml(r=0.9996).The average recovery was 99.9%with the RSD of 1.4%(n=6).Conclusion This method has high sensitivity,good repeatability and accuracy.It can be used for the determination of hydroxysafflor yellow A in Shiliuwei Dujuanhua Pills.Key Words：Shiliuwei Dujuanhua Pills;hydroxysafflower yellow A;HPLC十六味杜鹃花丸是由烈香杜鹃、石榴子、红花、石灰华，甘草、肉豆蔻、葡萄干、螃蟹、肉桂、木香、广枣、荜茇、肉桂、丁香、豆蔻和力嘎都等共十六味药材制成的藏药传统丸剂1，现行标准为1995年版中华人民共和国卫生部药品标准藏药：第一册（WS3-BC-0193-95）2，其质量标准中只有性状和烈香杜鹃药材的薄层定性鉴别，无成分的定量测定，质量控制水平较低。本文研究建立了高效液相色谱法（HPLC）测定十六味杜鹃花丸中红花色素A含量的方法，为该药品质量标准提升提供参考。1 仪器与试药1.1 仪器Agilent 1100液相色谱仪（美国安捷伦）；XSR205DU/AC梅特勒电子天平（梅特勒-托利多）；UC-250DE超声清洗器（上海微峰）；PHS-食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 4333C雷磁酸碱计（上海仪电）；TGL-16B高速离心机（常州中捷）。1.2 试药红花（批号：20200301），石榴子（批号：20200201），石灰华（批号：20200301），葡萄干（批号：200401），螃蟹（批号：210801），广枣（批号：20200301），荜茇（批号：20200301），力嘎都（批号：20200401），木香（批号：20200401），肉桂（批号：20200301）（西藏神猴药业）；甘草（批号：210901），沉香（批号：210801），丁香（批号：220228），豆蔻（批号：220228），烈香杜鹃（批号：211201），肉豆蔻（批号：210501）（安徽援康中药饮片）；药材经江苏神猴医药研究有限公司质检均符合法定标准。羟基红花黄色素A（批号：111637-202111，含量96.8%，中国食品药品检定研究院）；甲醇（批号：6808CU13，色谱纯），磷酸（批号：20210906，分析纯）、三乙胺（批号：C13683716，分析纯）（国药集团化学试剂公司）；水（娃哈哈纯净水）。十六味杜鹃花丸制剂由江苏神猴医药研究有限公司制剂实验室制备（批号：20220310，20220311，20220312，规格：每丸重0.5 g）。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：UItimate XB-C18（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相：甲醇-0.7%磷酸（三乙胺调节pH 6.0）（体积比27:73）；流速为1.0 ml/min；进样量为10 l；检测波长为403 nm；柱温25。2.2 溶液制备2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品10.09 mg，置入50 ml量瓶，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为195.3424 g/g的对照品储备液；取2 ml对照品储备液，置入10 ml量瓶，用25%甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度为39.0685 g/ml的对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备 取十六味杜鹃花丸（批号：20220310）适量，研细，过60目筛，精密称取粉末约2.5 g，置入150 ml具塞锥形瓶中，加入50 ml水，称定重量，加热回流提取60 min，静置冷却至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤纸抽滤，作为供试品储备液；精密量取续滤液5 ml，置10 ml量瓶中，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 m微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照处方比例配制缺红花药味的阴性样品，同2.2.2项下供试品溶液的制备方法制得。2.3 专属性 精密量取阴性样品溶液，对照品溶液，供试品溶液各10 l，按2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图。结果表明，供试品和对照品溶液的保留时间一致且峰形对称，阴性对照在目标峰处无干扰，理论塔板数以羟基红花黄色素A计不低于8000，该方法的专属性良好。见图。A：羟基红花黄色素A对照品；B：供试品溶液；C：阴性样品溶液图1 羟基红花黄色素A专属性色谱图ABC434 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期2.4 线性范围考察 精密移取3，4，5，7.5，10 ml对照品储备液，分别置入25 ml量瓶，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得线性对照品溶液15；取对照品储备液作为线性对照品溶液6。按2.1项下色谱条件分别测定线性对照品溶液16，记录色谱峰面积。以对照品溶液的质量浓度（g/ml）为横坐标，以对照品溶液中羟基红花黄色素A的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果，线性回归方程为Y=29.9700X-15.3126（r=0.9996），表明羟基红花黄色素A在23.4411195.3424 g/ml的范围内有良好的线性关系。2.5 检测限和定量限 取2.2.1项下对照品溶液适量，用25%甲醇溶液逐级稀释后进样分析，测得羟基红花黄色素A的定量限（S/N=12.4）为 0.08 g/ml；检测限（S/N=3.9）为 0.02 g/ml。2.6 精密度试验 取2.2.1项下制备好的对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续6次，记录峰面积，RSD为0.41%（n=6），表明仪器的精密度良好。2.7 重复性试验 按2.2.2项下供试品溶液配制方法平行制备6份，按2.1项下色谱条件对6份供试品溶液进样测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算羟基红花黄色素A的含量，分别为1403.1175，1386.0262，1406.4210，1410.7525，1384.2949，1385.2870 g/g，RSD为0.75%（n=6），表明该方法的重复性良好。2.8 加样回收率试验 精密称取十六味杜鹃花丸粉末2.0 g和羟基红花黄色素A对照品0.5 mg，置入150 ml具塞锥形瓶，再精密量取50 ml水，称定重量，加热回流提取60 min，静置冷却至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤纸抽滤，作为供试品储备液；精密量取续滤液5 ml，置入10 ml量瓶，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 m微孔滤膜滤过，即得。平行制备6份。按2.1项下色谱条件测定，记录色谱峰，按外标法计算回收率。结果，回收率在98.0%101.7%之间，平均回收率为99.9%，RSD为1.4%（n=6），表明该方法准确度良好。结果见表1。表1 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果（n=6）序号称样量/g对照品加入量/g 供试品中含量/g实测值/g回收率/%平均回收率/%RSD/%12.00147510.0000 2801.4584 3313.7264 100.4 99.9 1.422.00158500.0000 2801.6123 3291.6349 98.0 32.01351520.0000 2818.3108 3333.4749 99.1 42.00541500.0000 2806.9732 3315.4000 101.7 52.00781510.0000 2810.3325 3314.0612 98.8 62.00456500.0000 2805.7834 3311.0487 101.1 2.9 稳定性试验精密移取2.2项下对照品溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，于室温条件下，分别在0，2，4，6，8，10，12，14，24，30，72 h进行测定，记录色谱图，以峰面积考察供试品溶液和对照品溶液的稳定性。测得对照品峰面积和供试品峰面积的RSD分别为0.48%（n=11），0.37%（n=11），表明对照品溶液和供试品溶液在72 h内稳定性良好。2.10 耐用性按2.1项下色谱条件，单因素变化检测波长2 nm、流速0.2 ml/min、柱温2、有机相比例2%、0.7%磷酸pH0.2，并更换ShimNex CS C18色谱柱4.6 mm250 mm，5 m，岛津（上海），羟基红花黄色素A含量的RSD均小于2.0%，表明此法在单因素变化条件下的耐用性良好。2.11 中间精密度精密吸取2.2项下的对照品和供试品适量，在不同分析人员，不同高效液相色谱仪和不同工作日的条件下按2.7项方法进行检测并记录羟基红花黄色素A化合物的峰面积，结果表明，两位分析人员所得的12份溶液中羟基红花黄色素A含量RSD为1.78%。表明此法的精密度良好。食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 4352.12 样品的含量测定取批号为20220310，20220311，20220312的十六味杜鹃花丸样品，每批各2份，按照2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件记录峰面积，按外标法以峰面积计算，3批样品羟基红花黄色素A含量分别为1407.9624，1378.7066，1394.2544 g/g。3 讨论3.1 色谱条件的研究3.1.1 检测波长的选择 本实验配制的39.0685 g/ml的羟基红花黄色素A 对照品溶液，在 200600 nm波长内进行全扫描，结果表明，羟基红花黄色素A在403 nm处有较强的可见光吸收，因此，本实验选择403 nm进行测定。3.1.2 流动相、柱温的选择 本实验研究参考2020年版中国药典一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸（体积比26:2:72）为流动相，结果表明，目标峰羟基红花黄色素A峰形不对称，拖尾因子有逐渐偏大的趋势。参考文献3调节流动相pH，pH 6.0时，目标峰型对称性最佳，但目标峰处仍有干扰、分离度不佳的问题。在此基础上，参考文献4-15，以分离度、耐用性为评价指标，研究调节柱温和流动相的组成、比例，结果表明，柱温25 时，流动相为甲醇-0.7%磷酸（体积比27:73），目标峰的分离度最佳。3.2 供试品的处理研究 针对红花色素A的理化性质10-11，考察供试品的提取方式、提取溶剂。结果表明，水回流提取羟基红花黄色素A含量更高，峰形更好，理论塔板数和拖尾因子均达到理想效果，且无干扰；加水量与羟基红花色素A的得率呈正相关，当加水量为供试品重量的20倍及以上时，羟基红花黄色素A的得率无显著性差异。因此，最终优选的供试品处理方法为加水20倍，加热回流提取1 h，提取一次即可。3.3 其他羟基红花色素A是红花药材中的主要有效成分，本实验系统研究制定了十六味杜鹃花丸中羟基红花色素A的定量检测方法，提高了产品的质控水平，但十六味杜鹃花丸中含有大量含挥发性成分的药材，针对挥发性有效成分的定量研究尚需进一步的研究。参考文献1 王静,岳秀峰.十六味杜鹃花丸中丁香酚含量的GC测定法J.职业与健康,2012,28(6):696-697.2 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准藏药：第一册S.北京:中国医药科技出版社,1995:205.3 赵虎义,张德瑞,李彦铮,等.HPLC测定蒙药沙日毛都-9丸中羟基红花黄色素A的含量J.中国民族医药杂志,2022,28(5):59-60.4 何珊珊,万军,谭睿.高效液相色谱法测定肺热普清散中羟基红花黄色素A含量J.中国药业,2013,22(19):29-30.5 戴作波,姜志戎.HPLC法测定麝香接骨丸中羟基红花黄色素A的含量J.系统医学,2018,3(12):156-159.6 查娜,布音.建立清肝红花-7味散中羟基红花黄色素A的含量测定方法J.世界最新医学信息文摘,2016,16(58):86-87.7 赵国英,袁秀荣,李玲,等.鹿红颗粒中黄芪甲苷和羟基红花黄色素A的含量测定J.中国实验方剂学杂志,2014,20(6):40-43.8 彭红,付建武,余日跃.复方当归注射液中羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量测定J.时珍国医国药,2009,20(12):2925-2927.9 李鑫辉,王静雯,林丽美,等.丹参通络解毒汤中羟基红花黄色素A和丹酚酸B的含量测定 J.中华中医药学刊,2020,38(4):158-161.10 邢界红,刘庆玲,黎明.HPLC法测定蒙药清热八味丸中羟基红花黄色素A含量J.北方药学,2021,18(9):1-3,8.11 牛芬溪,刘悦,刘雅楠,等.羟基红花黄色素A的药理作用及研究进展J.中国药学杂志,2021,56(17):1372-1377.12 王小平,刘峰,马存德,等.红花中羟基红花黄色素A含量测定方法的改进J.陕西中医学院学报,2010,33(4):96-97.13 李栋,马秉智,梁莹莹,等.红花中羟基红花黄色素A的提取方法与含量测定研究进展 J.中日友好医院学报,2018,32(1):39-41.14 康新莉,顾健,谭睿.藏药二十味肉豆蔻丸中羟基红花黄色素A的含量测定J.中国药业,2015,24(19):39-40.15 包建华.红花益肝-7味散中羟基红花黄色素A的含量测定方法研究J.世界最新医学信息文摘,2016,16(36):230-231.