H9N2亚型禽流感病毒感染鸡红细胞引起白细胞介素的免疫应答.pdf
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1、山西农业科学 2023,51(11):1323-1330Journal of Shanxi Agricultural SciencesH9N2亚型禽流感病毒感染鸡红细胞引起白细胞介素的免疫应答刘智民 1,任鹏飞 1,韩心语 1,乔梦丽 1,牛胜 1,王颖 1,任建乐 1,赵宇军 1,张鼎 1,范瑞文 1,毕玉海 1,2,田文霞 1(1.山西农业大学 动物医学学院,山西 太谷 030801;2.中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室/中国科学院 流感监测与预警中心,北京 100101)摘要:为研究 H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)感染鸡红细胞后白细胞介素(ILs)参与的免疫
2、应答反应,进一步揭示鸡红细胞在感染 H9N2亚型禽流感病毒中所发挥的免疫调节作用,应用实时荧光定量 PCR 技术分别对体外感染 H9N2 AIV后 0、2、6、10 h和体内攻毒 3、7、14 d后 8种白细胞介素相关基因(IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-34)的表达水平进行检测。结果表明,8 种 ILs相关基因均在鸡红细胞中表达,其表达水平在体外感染 H9N2 AIV 后和体内攻毒后呈现动态变化;与对照组相比,体外感染 H9N2 AIV 后不同时间点 IL-6和 IL-18的相对表达量呈现逐渐升高的趋势,而 IL-7、IL-12、IL-1
3、5的相对表达量呈现逐渐下降的趋势;IL-13在感染 H9N2 AIV 后的 0、6 h显著下降,而 IL-16仅在感染 H9N2 AIV 后的 2 h显著下降。体内攻毒后的不同时间点,IL-12、IL-13、IL-15、IL-16的相对表达水平均逐渐升高,而 IL-6、IL-18、IL-34的表达水平先升高后降低,仅IL-7表达水平先降低后升高。综上,鸡感染 H9N2 AIV 后红细胞发生了相应的免疫应答反应,并通过促炎因子以及抗炎因子的表达来调节鸡感染 H9N2后的免疫应答。关键词:H9N2亚型禽流感病毒;鸡红细胞;SPF鸡;白细胞介素中图分类号:S852.65 文献标识码:A 文章编号:1
4、0022481(2023)11132308Immune Responses of Interleukin Induced by H9N2 Subtype Avian Influenza Virus Infection in Chicken ErythrocytesLIU Zhimin1,REN Pengfei1,HAN Xinyu1,QIAO Mengli1,NIU Sheng1,WANG Ying1,REN Jianle1,ZHAO Yujun1,ZHANG Ding1,FAN Ruiwen1,BI Yuhai1,2,TIAN Wenxia1(1.College of Veterinary
5、Medicine,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;2.CAS Key Laboratory of Pathogen Microbiology and Immunology/Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)Abstract:To explore the immune responses of interleukin(ILs)during the infection in chicken erythrocytes
6、induced by H9N2 subtype avian influenza virus(H9N2 AIV)and further reveal immunomodulatory role of chicken erythrocytes in H9N2 subtype avian influenza virus infection in chickens,in this study,real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of eight IL-related genes(IL-6,IL-7,IL
7、-12,IL-13,IL-15,IL-16,IL-18,IL-34)in chicken erythrocytes infected by H9N2 AVI at 0,2,6,and 10 h,as well as their expression levels in erythrocytes of H9N2-infected chicken were detected at 3,7 d and 14 d of poison attack in vivo.The results showed that expression of eight IL-related genes in chicke
8、n erythrocytes was identified and their expression levels showed dynamic changes after infection and challenge.Compared with the control group,the relative expression levels of IL-6 and IL-18 showed a increasing trend,while the relative expression levels of IL-7,IL-12,and IL-15 showed a declining tr
9、end in vitro.In addition,the expression level of IL-13 significantly declined at 0 h and 6 h after infection,while the expression level of IL-16 only significantly declined at 2 h.At different time of in vivo,the relative expression levels of IL-12,IL-13,IL-15 and IL-16 increased gradually,while the
10、 expression levels of IL-6,IL-18 and IL-34 increased at first and then declined,only the expression level of IL-7 declined at first and then increased.The results above doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.11.12收稿日期:2022-10-19基金项目:山西省重点研发项目(202102130501001);中美新发和再发传染病合作项目(E090090201-3,E2900901-02);山
11、西省现代农业产业技术体系建设专项(2021-07,2022-07);山西省1331工程项目(20211331-13);山西省科技创新青年人才团队(202204051001022)作者简介:刘智民(1996-),男,山西运城人,在读硕士,研究方向:动物疫病发生与免疫。刘智民、任鹏飞为同等贡献作者。通信作者:田文霞(1967-),女,山西闻喜人,教授,博士,主要从事动物疫病发生与免疫机制研究工作。1323山西农业科学 2023 年第 51 卷第 11 期indicated that chicken erythrocytes participated in the immune responses
12、after infection of H9N2 AVI,and the immune responses of chickens infected with H9N2 was regulated by expression of pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors.Key words:H9N2 subtype avian influenza virus;chicken erythrocyte;SPF chicken;interleukinH9N2 亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)可引起
13、鸡的免疫抑制性疾病,给家禽业带来巨大的经济损失。AIV 是 20世纪 90年代初首次在我国鸡群中发现和分离的一种病毒,在发现后的几十年中逐渐发展成大部分地区家禽养殖的地方病1。H9N2 AIV 属于低致病性禽流感病毒,但因其变异能力强、流行范围广而成为最难防控的禽流感亚型之一。目前,虽然疫苗防控研究已取得一定进展,但没有从根本上阻断其流行和传播。红细胞不仅能够运输氧气,还参与机体的免疫调节反应。1981年,“红细胞免疫系统”的概念首次由 SIEGEL 等2提出,他们的研究鉴定了红细胞的多种免疫功能,并发现红细胞是通过免疫黏附作用发挥其免疫功能。人红细胞是红细胞免疫领域研究的重点,动物中有关核红
14、细胞免疫功能方面的研究侧重于鱼类和爬行类,但关于鸡红细胞参与机体免疫反应的研究较少。模式识别受体的识别是机体抵抗病原感染的第一步,也是机体诱导天然免疫反应的关键一步。Toll样受体(TLRs)是发挥模式识别功能最重要的受体之一,当外界病原入侵机体,TLRs能立刻识别病原相关配体,激活下游相应细胞因子,启动天然免疫应答反应3。白细胞介素(Interleukin,IL)是一种细胞因子,现已发现 39种4,它们在免疫细胞的成熟、活化、调节中发挥重要作用,可参与炎症反应和免疫反应。最新研究发现,这些 ILs 的 mRNA 表达量随着病毒入侵机体而发生变化。JAHEJO 等5研究发现,IL-7 在感染马
15、立克氏病毒(Marek s disease virus,MDV)的鸡红细胞中的表达量与对照组相比显著上升,而 IL-12和IL-13 的表达量显著降低。董建国等6研究发现,PK15(猪肾细胞)感染型塞内卡病毒(SVA)后,IL-6 表达水平显著上升。BOULASSEL 等7和胡宽修等8研究均发现,感染 HIV-1 的患者体内 IL-15 和 IL-16 的表达量明显上升。鸡感染禽白血病病毒(ALV-J)后,单核细胞中 IL-18 mRNA 的表达水平升高9。感染流感 A 病毒(Influenza a virus,IAV)后期,患者血清和外周血单核细胞(PBMC)中 IL-34 表达量升高10。
16、因此,鉴定 H9N2 感染鸡后红细胞中 ILs表达水平的变化有助于更深入研究H9N2的致病和免疫机理。目前,关于 H9N2 感染鸡红细胞后 ILs 的表达水平变化仍未见报道。本研究通过实时荧光定量PCR 鉴定 H9N2 感染鸡红细胞后不同白细胞介素(IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-34)的表达水平,旨在为研究鸡红细胞在感染H9N2后 ILs相关基因参与免疫调节功能以及防治H9N2提供理论依据。1 材料和方法1.1试验材料1.1.1毒株禽流感病毒 H9N2 亚型山西毒株 A/chicken/Shanxi/1.23 TGRL003-O/2019
17、 由山西农业大学生物制品实验室保存;SPF鸡胚购自山东济南赛福实验动物养殖有限公司;SPF 鸡和 H9N2免疫鸡血清购自山西太谷隆科尔公司。1.1.2试剂RNAiso plus 2000、荧光定量 PCR 试剂盒(AK6003)、反转录试剂盒(AK3020)、淋巴细胞 分 离 液 均 购 自 大 连 Takara 宝 生 物 工 程 公 司。DMEM 培养基购自美国 HyClone公司。1.2试验方法1.2.1 H9N2 体 外 感 染 鸡 红 细 胞 翅 静 脉 采 集SPF鸡新鲜血液,参考 NIU 等11的方法分离红细胞(大约 5.0109个)用于后续试验。试验组根据红细胞与 H9N2 共
18、孵育的时间分为 4 组:0 h 组、2 h组、6 h 组和 10 h 组,每组 4 个重复。每个离心管中先加入 50 L 红细胞,然后加入 100 L 的 H9N2 AIV 尿囊液(病毒滴度 72)和 900 L 的细胞维持液 DMEM。在对照组的 4 个离心管中直接加入50 L 红细胞和 1 000 L 的细胞维持液 DMEM。将 4 组红细胞与 H9N2 混合后在 37 培养箱分别孵育 0、2、6、10 h 后,2 000 r/min 离心 20 min,重新分离红细胞,然后用 PBS洗涤 3次,用于后续试验。1.2.2H9N2感染雏鸡选择1日龄SPF雏鸡48羽,随机分为攻毒组和对照组(每
19、组各 24羽)。预饲期7 d,预饲期结束后,试验组滴鼻接种 H9N2 亚型禽流感尿囊液(病毒滴度 72)0.2 mL/只,对照组滴鼻接种相同体积的 PBS 缓冲液。攻毒后第3、7、14 天从 2 组中各随机选取 5 只进行心脏采血(2 mL/只),抗凝处理后用于后续试验。1.2.3红细胞的分离心脏采集 4 mL新鲜血液保1324刘智民等:H9N2亚型禽流感病毒感染鸡红细胞引起白细胞介素的免疫应答存于抗凝管中,采用淋巴细胞分离液分离红细胞。按淋巴细胞分离液血液无菌 PBS 比例为 2 1 1使用,首先将抗凝血与等体积无菌 PBS 混匀,随后缓慢倾斜加入到等体积的淋巴细胞分离液中,避免发生混合,2
20、 000 r/min 离心 20 min,弃去最上层的血清和中间层的淋巴细胞,分离得到红细胞,再用无菌 PBS 洗涤红细胞,2 000 r/min 离心 12 min,重复 3次。1.2.4RNA 提取与 cDNA 合成按照 1.2.3 方法从血液样品中分离得到红细胞,收集 25 L 红细胞,采用 Trizol 法提取总 RNA。总 RNA 的浓度和纯度通过 1.5%琼脂凝胶电泳和核酸测定仪检测。评估核糖核酸质量的标准是凝胶中可以看到 28 S和18 S条带且RNA的A260/A280值为1.92.1。根据反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)的操 作 步 骤,将 总 RNA 反 转 录
21、为 cDNA,保 存 至-20,用于后续的荧光定量 PCR检测 cDNA。1.2.5荧光定量 PCR根据 NCBI 数据库中 8 种白细胞介素的 CDS 序列信息,使用 Primer 5.0软件设计引物,引物序列如表 1所示。荧光定量 PCR 采用 10.0 L 反应体系,其中 SYBRPremix Ex TaqII(2)5.0 L,ROX Reference Dye II(50)0.1 L,上下游引物各 0.25 L(100 mol/L),cDNA 模板1.0 L,ddH2O 3.4 L。反应条件为:95 3 min;95 30 s,55 30 s,共 42 个循环,每个样品设置4 个重复。
22、1.3数据分析以 18S rRNA 作为标准内参基因,使用 2-ct方法计算目的基因在不同时间段试验组的表达差异。使用 GraphPad Prism 5.0进行上述基因表达量数据的统计分析,结果以平均值标准误表示,P0.05代表具有显著性差异。2 结果与分析2.1体外感染 H9N2 AIV 后鸡红细胞中 ILs相关基因的 mRNA表达变化荧光定量 PCR 结果如图 1 所示,H9N2 体外感染鸡红细胞后,与对照组相比,IL-6 的表达水平在感染后期(6、10 h)显著上升(P0.05);IL-7 在 0、6 h 显 著 上 升(P0.05),在 2 h 显 著 下 降(P0.05);IL-12
23、 的表达量在 0、6 h 都显著升高(P0.05),0 h 的表达量高于 6 h;IL-13 的表达水平在感染病毒后 0、6 h 显著下降(P0.05);IL-15 在感染早期(0 h)显著上调(P0.05),而在感染的中间点(2、6 h)显著下调(P0.05);IL-16 仅在感染后2 h显著下调(P0.05),在其余感染时间点无显著变化;IL-18在感染第 2、6 h显著上调(P0.05),并且在 6 h 上调程度更高;IL-34 在感染后的 0、2、6、表 1 定量 PCR引物信息Tab.1 Primers of real-time qPCR基因GenesIL-6IL-7IL-12IL-
24、13IL-15IL-16IL-18IL-3418S rRNA引物序列(5 3)Primer seqences(5-3)F:CGGCTTCGACGAGGAGAAATR:TGCTGTAGCACAGAGACTCGF:CTTGTTCTGTCGCCAGTGAAR:CTTCGATGTCATGGCTGAGTF:CTGGAAAAAGGGAACAGAACR:CTTAGCAGACAGGCAGGTGTAF:CTGGCGATGAACTTGTCCAAR:CCACTCTGGTGTCATTGCAAF:CCATAGGTTTCCGAGGCTTGTR:TCCGGCAGAGTTTTGTGTTGF:AAAGGACAAGGGAAGGG
25、TTTGR:GCTCCACCAGGAAAGATGGTTF:GTGAGAAAGAGCATGGGAAAATR:CGAACTTAAAAGCCTTGGAGCF:GGACAAGCTGCGGTATGAGAR:TCCGACACCTTCCCATCACF:TTCCGATAACGAACGACACR:GACATCYAAGGGCATCAG退火温度/Tm555555555555555555登录号Accession numberAB302327NM_001037835DQ202328AJ621250AF139097AJ508678NM_204608NM_001193295FM1654141325山西农业科学 2023 年
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