Graves眼病中预测性ceRNA网络的构建及免疫细胞浸润模式的鉴定.pdf
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1、 中南大学学报(医学版)J Cent South Univ(Med Sci)2023,48(8)http:/Journal of Central South University(Medical Science).All rights reserved.Graves眼病中预测性ceRNA网络的构建及免疫细胞浸润模式的鉴定曹家敏,陈海燕,谢冰雨,陈艺枝,熊炜,李明渊(中南大学湘雅三医院眼科,长沙 410013)摘要 目的:Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO)是一种多因素疾病,其非编码RNA相互作用的机制及炎症细胞浸润模式尚不完全清楚。本研究旨在构建GO的竞争性内源
2、RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)网络并明确眼眶组织中炎症细胞浸润模式以进一步探究GO的发病机制。方法:使用GEO2R工具鉴定差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),对 DEGs 进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和基因本体分析,并从RNA相互作用数据库中提取RNA的相互作用关系;使用STRING数据库鉴定蛋白质之间的相互作用,并通过Cytoscape进行可视化;基于StarBase、miRcode和DIANA LncBase
3、 Experimental v.2数据库中相互作用的非编码RNA来构建ceRNA网络;采用CIBERSORT算法和R语言检测并描述GO中免疫细胞的浸润模式。结果:共获得 114 个 DEGs,通过 KEGG 和基因本体分析明确 121 条通路。使用 Cytoscape 中的cytoHubba从蛋白质-蛋白质相互作用中提取了4个Hub基因(SRSF6、DDX5、HNRNPC和HNRNPM),共提取104个节点和142条连接,构建出1个ceRNA网络(MALAT1-MIR21-DDX5)。免疫细胞分析结果显示:GO中CD8+T细胞和CD4+静止型记忆T细胞的比例分别上调和下调。CD4+静止型记忆T
4、细胞的比例与MALAT1、MIR21和DDX5的表达呈正相关(均P0.05)。结论:成功构建出GO眼眶组织内的ceRNA调节网络(MALAT1-MIR21-DDX5),明确在GO中CD4+静止型记忆T细胞的比例下调且与ceRNA组成成分存在正向调节关系,进一步揭示了GO的发病机制。关键词 Graves眼病;生物信息学分析;竞争性内源RNA;免疫细胞Construction of predictive ceRNA network and identification of the patterns of immune cells infiltrated in Graves ophthalmopa
5、thyCAO Jiamin,CHEN Haiyan,XIE Bingyu,CHEN Yizhi,XIONG Wei,LI Mingyuan(Department of Ophthalmology,Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,China)DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2023.230118收稿日期(Date of reception):2023-03-23第一作者(First author):曹家敏,Email:,ORCID:0000-0003-2498-3454;陈
6、海燕,Email:,ORCID:0009-0009-4536-8590通信作者(Corresponding author):李明渊,Email:,ORCID:0000-0003-1655-1360基金项目(Foundation item):国家自然科学基金(82071006)。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82071006).1185中南大学学报 (医学版),2023,48(8)http:/Journal of Central South University(Medica
7、l Science).All rights reserved.ABSTRACT Objective:Graves ophthalmopathy(GO)is a multifactorial disease,and the mechanism of non coding RNA interactions and inflammatory cell infiltration patterns are not fully understood.This study aims to construct a competing endogenous RNA(ceRNA)network for this
8、disease and clarify the infiltration patterns of inflammatory cells in orbital tissue to further explore the pathogenesis of GO.Methods:The differentially expressed genes were identified using the GEO2R analysis tool.The Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)and gene ontology analysis were us
9、ed to analyze differential genes.RNA interaction relationships were extracted from the RNA interactome database.Protein-protein interactions were identified using the STRING database and were visualized using Cytoscape.StarBase,miRcode,and DIANA-LncBase Experimental v.2 were used to construct ceRNA
10、networks together with their interacted non-coding RNA.The CIBERSORT algorithm was used to detect the patterns of infiltrating immune cells in GO using R software.Results:A total of 114 differentially expressed genes for GO and 121 pathways were detected using both the KEGG and gene ontology enrichm
11、ent analysis.Four hub genes(SRSF6,DDX5,HNRNPC,and HNRNPM)were extracted from protein-protein interaction using cytoHubba in Cytoscape,104 nodes and 142 edges were extracted,and a ceRNA network was identified(MALAT1-MIR21-DDX5).The results of immune cell analysis showed that in GO,the proportions of
12、CD8+T cells and CD4+memory resting T cells were upregulated and downregulated,respectively.The proportion of CD4 memory resting T cells was positively correlated with the expression of MALAT1,MIR21,and DDX5.Conclusion:This study has constructed a ceRNA regulatory network(MALAT1-MIR21-DDX5)in GO orbi
13、tal tissue,clarifying the downregulation of the proportion of CD4+stationary memory T cells and their positive regulatory relationship with ceRNA components,further revealing the pathogenesis of GO.KEY WORDS Graves ophthalmopathy;bioinformatics analysis;competing endogenous RNA;immune cellsGraves 眼病
14、(Graves ophthalmolpathy,GO)是一种器官特异性自身免疫性疾病,也是发病率最高的成人眼眶疾病1。CD34+眼眶成纤维细胞可在转化生长因子(transforming growth factor,TGF-)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-)的影响下分别分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞,从而参与GO的发病2-3。在GO的指南中,维持甲状腺功能正常和戒烟是控制GO进展的2种重要方式4。此外,遗传调控也被认为是GO发病机制中的一个重要因素。研究5-8表明非编码RNA可以调节GO中的蛋白质表达和
15、CD34+眼眶成纤维细胞功能。非编码RNA是一种不编码蛋白质但参与蛋白质生产和修饰过程的RNA。根据非编码RNA的长度是否大于 200 nt,可分为长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和短链非编码 RNA,后者包括miRNA。近年来,许多miRNA被认为参与了GO发病的调控过程,包括眼外肌肉的水肿和纤维化、脂肪生成和GO的其他病理过程。例如,miR-130a可降低腺苷一磷酸激活的蛋白激酶的活性,促进脂肪组织在眼眶中积聚9。MiR-146a可下调透明质酸和一型胶原蛋白的分泌,从而参与眼外肌水肿和纤维化改变10。一项RNA测序研究11表明:lncRNA可能参与
16、成纤维细胞的细胞外基质的合成,该研究共鉴定出809个差异表达的lncRNA,并认为这些lncRNA参与了GO发病过程中某些重要生物学过程的调控。GO中不同的非编码RNA之间具有相互调控作用,从而形成广泛的调控网络。根据竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假说,非编码RNA可以与mRNA竞争miRNA的结合位点,从1186Graves眼病中预测性ceRNA网络的构建及免疫细胞浸润模式的鉴定 曹家敏,等Journal of Central South University(Medical Science).All rights reserved.而调节蛋
17、白质的表达和修饰12。在眼科领域,有关ceRNA 的调控机制尚不完全清楚。Ning 等13发现ceRNA参与青光眼的发病机制,LINC01518可下调TGF-1 的表达,而该过程可被 has-miR-216b-5p 抑制。研究14表明lncRNA TRPM2-AS充当miR-497的ceRNA,可上调视网膜母细胞瘤中WEE1蛋白的表达。关于ceRNA在GO中的作用研究较少,有关该疾病中非编码RNA之间的复杂调控关系有待确定。在GO患者的眼眶内,B细胞分泌的某些自身免疫性抗体如促甲状腺素受体抗体水平增加。这些抗体不仅诱导眼眶成纤维细胞功能障碍并促进其分泌免疫因子,还可促进眼眶内其他免疫细胞的积聚
18、、增殖和分化,引起多种类型的免疫细胞浸润眼眶组织,如T细胞、B细胞和单核细胞3。然而这些免疫细胞的比例和分布仍不清楚。本研究旨在分析GO患者和健康对照之间的差异表达mRNA和非编码RNA,并据此分析参与GO的功能通路和蛋白质相互作用网络;通过构建不同RNA之间的相互作用来预测GO的ceRNA,并分析免疫细胞在GO患者眼眶中的浸润模式。1 资料与方法 1.1 基因芯片数据和差异表达分析从基因表达综合(gene expression omnibus,GEO)数据库(https/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载相关的基因芯片数据集(GSE58331和GSE105149)。其
19、中,从GSE105149获得4个GO样本和7个健康对照样本,从GSE58331获得8个GO样本和7个健康对照样本,分别分为GO组和对照组。GEO2R分析工具(https/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)用于分析差异表达基 因(differentially expressed genes,DEGs)。设 置DEGs的标准为P1;分别定义log2(FC)1和log2(FC)1的DEGs为上调DEGs和下调DEGs。使用GraphPad Prism 9绘制相应的火山图。1.2 功能富集分析对DEGs进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia o
20、f genes and genomes,KEGG)分析和基因本体分析。使用org.Hs.eg.db包获得每个DEG的Entrez ID,随后使用R语言(R 4.0.1)的clusterProfiler包来确定DEGs的富集通路15-16。从比较毒理学基因组 学 数 据 库(comparative toxicogenomics database,CTD)中下载GO的相关基因,通过与DEGs对比,确定二者共同的基因17。1.3 DEGs之间交互关系的检测在RNA相互作用体数据库中搜索并提取RNA相互作用关系18。在搜索结果中,设置ID 1和ID 2的物种参数为人类,并使用 Cytoscape 3.
21、7.2 构建关系网络。1.4 蛋白质-蛋白质相互作用分析设置综合评分0.4的标准后,使用STRING数据库11.0(https:/version-11-0.string-db.org/)获取蛋白质-蛋白质相互作用,其数据来源为RNA相互作用网络中提取的mRNA。使用Cytoscape 3.7.2对获取的结果进行可视化。设置最大聚类中心度(maximal clique centrality,MCC)、最 大 邻 域 分 量(maximum neighborhood component,MNC)、边 缘 过 化 分 量(edge percolated component,EPC)、最大邻域分量密度
22、(density of maximum neighborhood component,DMNC)和等级算法中排名前 10 的基因为 Hub 基因后,使用CytoHubba提取Hub基因。1.5 CeRNA网络的构建从 starBase(https:/ DIANA-LncBase(https:/diana.e-ce.uth.gr/lncbasev3)获取lncRNA-miRNA之间的相互作用,其中lncRNA-miRNA对至少被2个数据库 收 录。从 starBase 和 miRcode 中 获 得 miRNA-mRNA对,其中miRNA-mRNA对至少被2个数据库收录。使用Cytoscape
23、3.7.2从提取的lncRNA miRNA对和miRNA mRNA对中构建ceRNA网络。1.6 免疫细胞浸润分析使用CIBERSORT算法计算GSE58331中22种免疫细胞的比率,分析眼眶组织中浸润的各种免疫细胞的比例19。Corrplot包用于计算免疫细胞之间的相关性。1.7 统计学处理采用Wilcoxon符号秩和检验比较GO组和对照组之间各种免疫细胞之间的比值差异,通过Pearson相关分析用于检测细胞比例和基因之间的关系。P1和P0.05)。3 讨 论 非编码RNA在其他类型的疾病中有较充分的研究,但关于 lncRNA 和 ceRNA 在 GO 中的类别和机制,以及在GO中免疫细胞比
24、例的研究较少。本研究使用GEO2R进行DEGs分析,共提取出图6 GO中免疫细胞浸润组织的分析Figure 6 Analysis of immune cell infiltration tissues in GOA:Proportion of 22 immune cell types in the sample of GSE58331;B and C:Comparison of immune cell ratios between GO and control groups;D:Correlation between immune cell types;EG:Correlation betwe
25、en CD4 positive stationary memory T cells and ceRNA composition.GO:Graves ophthalmolpathy.1193中南大学学报 (医学版),2023,48(8)http:/Journal of Central South University(Medical Science).All rights reserved.28个上调和295个下调的共同基因,进一步富集该通路。使用CTD对GO相关基因进行验证后发现,内质网蛋白折叠、黏着斑和钙黏蛋白结合分别是BB、CC和 MF 中 最 显 著 的 通 路。将 mRNA 与 lnc
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