GSDMD单域抗体的筛选及功能探究.pdf
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1、论 著文章编号(23)6-0622-06GSDMD 单域抗体的筛选及功能探究高秋雲,孙亚楠,马振毅(天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系,天津300070)摘要 目的:筛选并验证gasdermin D(GSDMD)单域抗体(single-domain antibody,sdAb)及其生物学功能。方法:利用原位邻近连接分析(in situ proximity ligation assay,isPLA)结合高通量测序筛选抗GSDMD sdAbs候选序列;利用isPLA、Co-IP、GST pulldown、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,I
2、TC)验证这些sdAbs与GSDMD的特异性结合;在脂多糖(LPS)和nigericin处理的细胞焦亡模型中,观察细胞表型变化;检测细胞上清液中白细胞介素1-(IL-1)水平变化以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放;通过Western印迹检测经上述处理后的细胞中GSDMD以及GSDMD N端结构域(GSDMD N terminus,GSDMD-NT)量的变化。结果:通过isPLA结合高通量测序方法筛选出GSDMD sdAb的候选序列,其中sdAb#26与GSDMD C端结构域(GSDMD Cterminus,GSDMD-CT)相互作用;与sdAb Con对照组相比,sdAb#26处理高表达GSDMD
3、细胞产生焦亡表型的细胞显著增多;细胞上清中释放的IL-1以及LDH显著提高(t=68.54,P0.001;t=5.909,P0.01);GSDMD-NT产生量显著增加。结论:GSDMDsdAb具备操控GSDMD介导焦亡的潜力,为焦亡相关疾病的治疗提供了新思路。关键词细胞死亡;焦亡;gasdermin D;单域抗体;筛选中图分类号R34文献标志码Screening and functional investigation of anti-GSDMD single-domain antibodiesGAO Qiu-yun,SUN Ya-nan,MA Zhen-yi(Department of Bi
4、ochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)AbstractObjective:To screen and investigate single-domain antibodies(sdAbs)against gasdermin D(GSDMD)and their biologicalfunctions.Methods:Using in situ proximity ligation assay(isPLA)fo
5、llowed by high-throughput sequencing,the candidate sequences ofanti-GSDMD sdAbs were obtained.The specific binding of these sdAbs against GSDMD was verified by isPLA,Co-IP,GST pull down,andisothermal titration calorimetry(ITC),respectively.In the pyroptosis model of lipopolysaccharide(LPS)and nigeri
6、cin treated THP-1 cells,the cellular morphology,the level of interleukin-1(IL-1)and the release of lactate dehydrogenase(LDH)in cell supernatants weredetected.Western blotting was also used to detect the expression of GSDMD and GSDMD N-terminal domain(GSDMD-NT)in the abovetreated cells.Results:The c
7、andidate sequences of anti-GSDMD sdAbs were screened by isPLA followed by high-throughput sequencing.One of them,sdAb#26 was verified to interact with the C-terminus of GSDMD(GSDMD-CT).Compared with the sdAb control group,thenumber of cells producing pyroptosis morphology in high expression GSDMD ce
8、lls treated with sdAb#26 was significantly increased.Therelease of IL-1 and LDH in cell supernatants significantly increased(t=68.54,P0.001;t=5.909,P0.01).The production of GSDMD-NTsignificantly increased.Conclusion:Anti-GSDMD sdAb has the potential to manipulate GSDMD-mediated pyroptosis,which may
9、providea novel manipulation for the treatment of pyroptosis-related diseases.Key wordscell death;pyroptosis;gasdermin D;single-domain antibody;screening基金项目 天津市教委科研计划(2 0 2 1 K J 2 5 1)作者简介 高秋雲(1 9 9 5-),女,硕士在读,研究方向:生物化学与分子生物学;通信作者:孙亚楠,E-m a il:y a n a n s u n tm u.e d u.c n;马振毅,E-m a il:z h y m a t
10、m u.e d u.c n。细胞焦亡(pyroptosis)是一种程序性细胞死亡方式,其特定的细胞形态特征是形成气泡样囊泡,细胞体积增大,细胞器变形,细胞核变小,导致细胞膜破裂1。细胞焦亡在细胞增殖、微生物感染、肿瘤的发生和转移以及细胞死亡过程中发挥重要作用2。GSDMD是目前研究最多,机制研究相对完整的一种焦亡相关蛋白3,含有N端结构域(GSDMD-NT)和C端结构域(GSDMD-CT)4,主要表达于免疫细胞和小肠黏膜上皮细胞表面5。由于GSDMD是焦亡的执行蛋白6,理论上可以通过调控GSDMD的功能来操控焦亡过程。单域抗体(sdAb)又称纳米体(nanobody),相对分子质量为15 00
11、020 000 Da。它由4个框架区(FR1FR4)和3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)组成,其中CDR3是主要特异性抗原识别的区段7。与传统抗体相比,sdAb具有分子量小、特异性强、高亲和力和跨膜运输等特性,能够靶向细胞内抗原,在疾病的诊断和治疗方面具有广阔的应用前景8。天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷6期23年11月 29熏 6Nov.23622基于此,笔者试图通过筛选抗GSDMD的sdAb,来调控GSDMD介导的焦亡,为临床上控制焦亡相关疾病的进展提供新思路。1材料与方法1.1实验材料细胞系:人源单核细胞THP
12、-1、胚肾细胞293T、宫颈癌细胞HeLa、骨肉瘤细胞U2OS、结肠癌细胞HT29、淋巴瘤细胞U937、非小细胞肺癌细胞A549均为本实验室保存;DMEM、胎牛血清购自Biological Industries公司;原位邻位连接(isPLA)相关试剂购自Sigma-Aldrich;Protein G Sepharose 4Fast Flow,Glutathione Sepharose 4B和Ni2+NTA agarose beads均购自Cytiva;白细胞介素(IL)-1ELISA检测试剂盒购自碧云天;LDH检测试剂盒购自索莱宝。1.2实验方法1.2.1细胞培养293T、HeLa、U2OS和
13、HT29细胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素、非必需氨基酸的DMEM培养液;THP-1、A549和U937细胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素、非必需氨基酸的RPMI-1640培养液,于37,5%CO2的恒温培养箱培养。1.2.2isPLA结合高通量测序筛选抗GSDMD的sdAbs将实验室前期构建的Flag-sdAb文库和HA-GSDMD以及阴性对照质粒共转染进HEK293T细胞中,48 h后收集细胞,随后对收集的细胞进行PLA实验,在isPLA后,通过流式细胞仪分选红色荧光信号的细胞,将阳性细胞作为模板扩增CDR3区,构
14、建sdAb亚库,重复上述步骤进行3轮筛选,最终将扩增CDR3产物送至诺禾致源公司进行二代测序。实验方法参照相关文献9。1.2.3细胞isPLA实验将筛选到的CDR3序列构建到带有3Flag的sdAb骨架载体上,同阴性对照质粒一起分别和HA-GSDMD、GSDMD-NT、GSDMD-CT共转入HEK293T中。隔天将细胞铺至载玻片上,待细胞贴壁后进行PLA实验,DAPI染核后,封片,避光低温保存。实验方法参照相关文献9。1.2.4GST pull down实验分别将GSDMD构建在GST标签的原核表达载体上,筛选的sdAb序列构建在His标签的原核表达载体上,进行原核诱导表达,菌液中加入IPTG
15、至终浓度0.2 mmol/L,16诱导过夜。将菌液超声破碎后离心收集上清,分别加入GST珠子和Ni珠,4摇床孵育2 h。孵育结束后,将珠子用新鲜裂解液洗涤3次,将His标签蛋白使用50 mmol/L咪唑洗杂后,用300 mmol/L咪唑将His标签蛋白洗脱下来。将洗脱下来的His标签蛋白加入到结合了GST标签蛋白的珠子中,4摇床孵育2 h。结合结束后,使用裂解液洗去非特异结合蛋白并将样品进行考马斯亮蓝染色。1.2.5Co-IP实验分别将带有HA标签的GSDMD和带有Flag标签的sdAb Con、sdAb#3、sdAb#26共转到HEK293T细胞中,48 h后收集细胞并在冰上超声裂解,向离心
16、后的样品中加入少量ProteinG珠子孵育2 h以去除非特异结合。然后去掉Protein G珠子,向只转染了HA-GSDMD的样品中加入IgG抗体,另外3组样品中加入Flag抗体,4摇床过夜孵育。第2天,向每组样品中加入ProteinG珠子,4摇床孵育2 h,孵育结束后收集珠子并煮样,再进行Western印迹检测。1.2.6等温滴定量热实验首先在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达GST-GSDMD和8His-SUMO-TEV site-sdAb#26,将GST-GSDMD结合GST珠子后使用10 mmol/L还原性谷胱甘肽洗脱。8His-SUMO-sdAb和Ni珠结合后,加入TEV酶切过夜,
17、得到纯化的sdAb。使用10 000 Da的超滤管将所有纯化好的蛋白溶于50 mmol/L Tris,pH 7.5,200 mmol/L NaCl溶液中。启动MicroCal VP-ITC仪器,在加样池加入10 mol/L的GST或GST-GSDMD,在滴定池加入300 mol/L的sdAb Con或sdAb#26进行测定,使用MicroCalPEAQ-ITC分析软件计算出解离常数,并使用Origin 7.0做出拟合曲线。1.2.7sdAb纯化将重组质粒GST-TEV site-sdAb-ETA-3 Flag转 化 进 入 大 肠 杆 菌BL21(DE3)中,当菌液OD值达到0.8时,加入IP
18、TG至终浓度0.2 mmol/L,16诱导过夜。摇菌结束后离心收集菌体,将菌体冰上超声后,12 000 r/min离心30 min收集上清。在上清中加入GST珠子,4摇床孵育2 h后收集珠子,取少量珠子煮沸进行考马斯亮蓝,与BSA进行对比,估算出原珠子中含有的蛋白量,以sdAb:TEV=101的比例向珠子中加入TEV酶,4过夜收集去除了GST标签的sdAb。1.2.8细胞上清中LDH释放量检测将THP-1细胞铺入96孔板中,并将纯化好的sdAb Con、sdAb#26加入细胞中过夜,12 h后用1 g/mL LPS预处理4 h,再用10 mol/L nigericin处理1 h后,收集检测细胞
19、上清中LDH的释放量,检测方法参照试剂盒说明书进行。1.2.9ELISA检测细胞上清IL-1蛋白水平将THP-1细胞铺入24孔板中,过夜贴壁后,将纯化的sdAb Con、sdAb#26加入细胞中过夜,12 h后用1 g/mL LPS预处理4 h,再用10 mol/L nigericin处高秋雲,等.GSDMD单域抗体的筛选及功能探究第6期623理1 h后,收集细胞上清培养液检测IL-1浓度,检测方法参照试剂盒说明书进行。1.2.10Western印迹实验提取各组细胞蛋白,按常规步骤进行Western印迹分析,一抗:GSDMD(11 000)、FLAG(15 000)、HA(11 000)、AC
20、TB(15 000)。4孵育过夜,室温二抗孵育1 h,显影并曝光。1.3统计学处理所有数据为3次独立实验,符合正态分布的计量资料使用均值标准差表示,数据分析采用双因素方差分析,P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1GSDMD sdAb的筛选isPLA后,流式分选出红色荧光信号的阳性细胞,对照组为带有HA标签的空载体和sdAb文库(图1A)。将阳性细胞作为模板通过聚合酶链反应,扩增CDR3区,片段大小为325 bp(图1B)。经3轮筛选后,将富集的CDR3区进行序列测定,得到如表1所列的CDR3氨基酸序列。接下来,通过PRODIGY网站预测候选sdAb和GSDMD相互作用的亲和力,选出两条
21、亲和力较强的sdAb#3和#26进行验证。2.2GSDMD的sdAb#3和sdAb#26与GSDMD特异性结合由细胞isPLA实验结果可知,sdAb#3和#26与GSDMD全长及GSDMD-CT产生了相互作用,而不和GSDMD-NT互相作用(图2A、2B)。为了进一步验证这两条sdAb与GSDMD的结合是否为直接相互作用,笔者通过使用含有GST标签的GSDMD与His标签的sdAb进行pull down实验。结果显示,在GST标记GSDMD中检测到His标记的sdAb,与isPLA数据一致(图2C)。接着,将带有Flag标签的sdAb和带有HA标签的GSDMD共转进293T细胞中,通过Co-I
22、P实验,再次证实sdAb#3和sdAb#26分别和GSDMD相互作用(图2D)。最后,通过ITC实验测定了GST-GSDMD和sdAb#26之间的解离常数(dissociation constant,Kd)为(3.780.42)mol/L,而GST-GSDMD和sdAb Con以及GST和sdAb#26之间都不发生互相作用(图2E)。表1由isPLA-seq筛选得到的抗GSDMD单域抗体CDR3序列Tab 1The CDR3 sequences of the anti-GSDMD sdAb obtained byisPLA-seq screening编号12345678910111213141
23、51617181920212223242526氨基酸序列VGCDRCWQMDVTGTMQHNLRSVPARALKDRWIIRTGCGTGRSPVELADLDSSPVYTVVSSLIGGRRIPYSVGCHRVWMQAVSIACSVTALMIARLTSKIRGTVSGFVPGQQASGWFYLAPHTECLLHGSTCQSTGHDRGSAVGALDVPDWRRSRRGDSTSIICQGTTCEVTLLVAACCRYNGRWRNGVDPGGGSAYLTMGIRYVHWYCSHHDLKCTFFAIRRVRSGLLGARGVLMQLRSKSGRVPIEGVTFVLRCSISGHALSSLEHSEKRC
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