MC3T3-E1细胞成骨模型的应用及研究进展.pdf

doi:10.3969/j.issn.1672-5972.2023.05.017文章编号:swgk2022-10-00260生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY2023 年 10 月第 20 卷 第 5 期MC3T3-E1细胞成骨模型的应用及研究进展*曹志威1，2，3，4 武晓蓉1 邵国5 赵志军2，3，4 张春阳2，3，4*摘要 骨形成与骨重建涉及各种细胞的协同作用。通过各种体外培养模型，在了解成骨过程的生物学方面取得了显著进展。当前，骨组织工程研究火热，但由于原代人成骨细胞十分有限，这些细胞模型越来越多地被应用。MC3T3-E1细胞是前骨细胞，该细胞在研究骨骼疾病和骨缺损的细胞治疗及组织工程方面具有较大潜力。本文全面回顾了MC3T3-E1细胞成骨模型的培养、鉴定及应用等方面内容。此外，还进一步讨论了该模型的优缺点并提出了几点展望。关键词 MC3T3-E1细胞；骨生长；研究进展中图分类号 R318 文献标识码 AApplication and research progress of MC3T3-E1 cell osteogenic modelCao Zhiwei1,2,3,4,Wu Xiaorong1,Shao Guo5,Zhao Zhijun2,3,4,Zhang Chunyang2,3,4.1 Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou Inner Mongolia,014000;2 Department of Neurosurgery,The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou Inner Mongolia,014000;3 Institute of Neurosurgical Diseases,Baotou Medical College(Translational Medicine),Baotou Inner Mongolia,014000;4 Inner Mongolia Autonomous Region Bone Tissue Regeneration and Damage Repair Engineering Technology Center,Baotou Inner Mongolia,014000;5 Translational Medicine Center,Third Peoples Hospital of Longgang District,Shenzhen Guangdong,518112,ChinaAbstract Bone formation and bone remodeling involve the synergistic action of various cells.By culturing various in vitro cell models,a comprehensive understanding of the biological aspect of the osteogenic process has been advanced.Currently,bone tissue engineering research has recently become a hot topic,but due to the limited availability of primary human osteoblasts,in vitro cell models are gradually being widely used.MC3T3-E1 cells are pro-osteoblasts,and this cell line has great potential for studying cell therapy and tissue engineering of skeletal diseases and bone defects.In this paper,we describe the culture,identification and application of MC3T3-E1 cell osteogenesis model,further discuss the advantages and disadvantages of this model for simulating the osteogenesis process and present the outlook.Key words MC3T3-E1 cells;Bone growth;Research progress骨的再生修复一直是个世界性难题。骨骼具有很强的再生能力，具体表现在损伤（骨折）修复期间，以及成年后的骨骼发育和持续重塑过程中1。大量研究表明，骨修复与骨发育过程相似，其机制十分复杂，涉及多种细胞类型和细胞内外分子信号通路2-3。骨不连、骨缺损或骨溶解等是临床上常见的再生修复类型，目前治疗手段非常有限，此类疾病都是因骨细胞分化成熟过程出现问题引起的。因此，在体外选取一种成骨细胞模型来探究骨生长及再生修复的分子机制是十分有必要的。MC3T3-E1细胞（小鼠颅顶前骨细胞）是最常用的成骨样细胞系之一，通常情况下，MC3T3-E1细胞在含抗坏血酸、-甘油磷酸钠和地塞米松等诱导因子的培养基中能够很好地向成骨细胞分化4，重现体内成骨细胞的生长周期。该细胞现已被发展为研究细胞分化调节、细胞因子和激素调节、基质蛋白的合成和分泌、骨骼疾病的分子机制和药物药代动力学的理想模型5-9。近年来，MC3T3-E1细胞培养也发展到对新型生物材料的细胞相容性和成骨活性方面的评估10-11。本文就MC3T3-E1细胞成骨模型的培养、鉴定及应用等方面进行综述。以期明确MC3T3-E1细胞成骨模型的研究方向，并提出几点新见解。综述与讲座*基金项目：国家自然科学基金（82160250，81960238）；内蒙古自然科学基金（2021SHZR1205）；包头医学院 2021 年研究生科研创新项目（bycx2021015）作者单位：1 内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头，014000；2 内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科，内蒙古 包头，014000；3 包头医学院神经外科疾病研究所（转化医学），内蒙古 包头，014000；4 内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心，内蒙古 包头，014000；5 深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心，广东 深圳，518112.862023 年 10 月第 20 卷 第 5 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY1 体外培养MC3T3-E1细胞取自新生小鼠颅顶骨，是一种贴壁生长的成纤维细胞12。该细胞系有多个亚克隆，在含抗坏血酸培养基中的成骨分化与矿化能力各有不同13。MC3T3-E1亚克隆4和亚克隆14表现出高水平的成骨细胞分化能力，是当前研究者们首选的成骨模型。不同组分的培养基对MC3T3-E1细胞增殖和成骨的影响有所不同。维生素C（Vitamin C,VC）是抗坏血酸的L-对映体，是生物体不可缺少的营养物质14。Izumiya等15比较了是否含VC的-MEM或DMEM培养基对MC3T3-E1细胞增殖和成骨的影响，结果显示无论细胞密度如何，-MEM都会促进细胞增殖，即使在不含VC的-MEM中也是如此。此外，细胞在含或不含VC的DMEM培养基中增殖能力都明显低于-MEM培养基。这些结果表明VC并不是MC3T3-E1细胞的必需营养物质，-MEM似乎是此细胞培养的更优选择。在使用VC和-甘油磷酸成骨诱导后，出现了一个有趣的现象15，在额外添加VC的培养基中培养的细胞钙化程度明显高于在-MEM培养基中自带VC培养的细胞，这或许是因为商业-MEM培养基中的VC失去了生物活性，而新鲜的 VC 发挥了重要作用。相反，使用DMEM作为基础培养基来诱导成骨，其效果并不明显，在3周时几乎没有钙化。上述研究表明，用于培养MC3T3-E1细胞的两种主要培养液-MEM和DMEM在增殖、成骨和钙化等方面存在很大差异，这些差异影响了生物材料的评估，即使评估相同的材料，也可能产生不同的结果。目前大部分实验对于该细胞的培养及成骨诱导所使用的基础培养基都是-MEM，如何优化培养基的成骨效果是研究者们下一步的研究方向。2 鉴定方法2.1 细胞形态MC3T3-E1细胞在使用基础培养基培养时形态与成纤维细胞类似，呈梭形，而进行成骨诱导后细胞逐渐伸展呈多角形，并伸出多个树枝状突起，胞体和胞核逐渐变大16。大部分研究鉴定该成骨模型时未将细胞形态纳入其评价指标，这些学者认为细胞形态与细胞状态、代数及培养基的不同都有关系，甚至不同人培养出来的细胞形态可能都会略有差异，故单从细胞形态来判断MC3T3-E1细胞成骨模型建立是否成功没有意义。形态决定功能，尽管细胞形态对于MC3T3-E1细胞成骨的鉴定没有太大帮助，但对细胞成骨前后的形态对比研究可能会揭示细胞的某些功能。2.2 碱性磷酸酶活力检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）是成骨细胞的标志性酶，在MC3T3-E1细胞成骨早期产生，很容易在细胞表面找到17。文献报道，MC3T3-E1细胞的ALP活力随着成骨诱导时间的延长而增加18。目前检测成骨细胞中ALP表达的主要技术有基因检测法、染色法和活力检测法。传统的ALP活力检测基本原理是在特定条件下，ALP 可以将底物对-硝基苯磷酸盐（Para-nitrophenyl phosphate,PNPP）分解成对-硝基苯酚（p-Nitrophenol,PNP）和磷酸盐，通过测定PNP的吸光度来间接反映ALP的活力19。虽然该方法已广泛应用于成骨细胞的鉴定，但仍存在灵敏度低、干扰强、可能出现假阳性结果等问题。在过去的几年里，随着光学、电化学及荧光探针等新兴材料的出现20-21，各种ALP活性分析方法得到了蓬勃发展。这将为检测ALP活性提供更多潜在的原则和策略。2.3 矿化结节染色矿化结节是MC3T3-E1细胞分化成熟的标志22，同时也是其行使成骨功能的主要形态学表现。正常成骨条件下，细胞在培养至第14天后会有少量矿化结节形成，随着诱导时间的延长，矿化结节逐渐增加23，且在一些促成骨药物的作用下，矿化结节也可提前出现。目前实现商品化的矿化结节染色方法包括Von Kossa法、茜素红S法和四环素法24-26。Von Kossa法是矿化结节染色的经典方法，但由于其特异性较差，在成骨培养中观察到的阳性染色可能不仅仅是羟基磷酸钙结节，也有可能是某些来源不明的营养不良矿化27，现在大多数实验均不使用此方法。茜素红S法是检测矿化结节的最常用方法，它是一种蒽醌类衍生物，作为阴离子染料，能够与钙离子以螯合方式形成橘红色或紫红色复合物24。值得一提的是，茜素红并不是钙特异性染料，会受到其他金属离子（如镁、锰、钡、锶等）的干扰，但是这些离子含量往往很低，因此并不会影响最终的染色结果。与Von Kossa法相比，茜素红S法的优势在于对少量的矿化结节能够得到更可靠的结果。此外，四环素可以与矿化结节中的钙离子螯合并形成荧光的磷酸复合物，这一特性使得四环素也可用来检测成骨过程中的矿化情况25。除上述三种染色方法外，研究者们还尝试利用各种荧光染料对矿化结节进行检测，Querido等28首次证实Giemsa可作为体外矿化结节的荧光染料。扫描电镜通常用于观察骨的胶原结构，而廖乃顺等29首次利用扫描电镜来观察成骨细胞矿化结节的形态结构，虽然该方法可更加精确地显示矿化结节的数量及微观结构，且具有一定的新颖性，但此方法成本较大，不利于推广。.872023 年 10 月第 20 卷 第 5 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY2.4 成骨相关基因检测在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中，许多基因参与其中，如矮小相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）、ALP、骨钙素（osteocalcin,OCN）和骨桥蛋白（osteopontin,OPN）等。利用蛋白印迹法和聚合酶链式反应等技术手段检测这些基因的表达，往往也可作为一种佐证来判断细胞是否成骨。正常成骨条件下，随着诱导时间的延长，成骨相关基因的表达也随之增加。但细胞和培养基的不同可能会使部分基因的表达出现略微差异。在MC3T3-E1细胞正常成骨诱导过程中，成骨相关基因的表达在14天前大致呈上升趋势23。茜素红染色矿化结节也在该时间节点出现，说明在此之后细胞可能已经分化成熟。因此做成骨相关研究时，选取成骨诱导14天前的细胞较为合适。若培养周期过长，细胞污染几率和时间成本也会增加。3 细胞培养环境MC3T3-E1细胞通常在体外二维微环境中培养。然而，该培养环境与成骨细胞的组织内环境非常不同，不能完全模拟体内骨环境。三维细胞培养技术是一种新颖的细胞培养技术，可以通过支架或特殊装置模拟细胞在体内的生长状态30。水凝胶能模拟天然细胞外基质的生物化学和力学环境，已被广泛用于细胞培养和组织工程。型胶原是骨骼细胞外基质的主要成分，其为成骨细胞提供了一个良好的培养环境。已经证明，在3D胶原凝胶中培养细胞会影响细胞形态、细胞间相互作用和对可溶性因子的反应31。Matthews等32将MC3T3-E1细胞接种于3D 型胶原凝胶中，并与2D凝胶中培养的细胞进行比较，结果显示，前者矿化结节及成骨细胞标志基因的上调出现较早。此外，有研究团队研发出了3D羟基磷灰石（HAP）-多肽杂化水凝胶33，该水凝胶具有良好的生物相容性、机械稳定性及低细胞毒性等特点，可长期用于细胞培养。利用MC3T3-E1细胞来研究成骨细胞在体外的生物学变化成为当前的热点。微重力（microgravity,MG）和辐射（radiation,RA）是太空中的主要环境因素34，对人体尤其是骨组织有多种影响。Dong等35模拟微重力和X射线单独或联合作用MC3T3-E1细胞，与对照组相比，细胞活性降低，成骨相关基因Runx2表达降低。等离子体能够产生多种生物活性物质，特别是活性氧（reactive oxygen species,ROS），各种实验表明ROS可以影响细胞活性36。Tominami等37证明短期适当的等离子体照射可促进MC3T3-E1细胞分化，且不会对细胞造成损伤，但其潜在机制仍不清楚。随着人们对MC3T3-E1细胞培养环境的研究进一步深入，越来越多骨骼疾病的发病机制被揭示。通过模拟不同情境下体内骨细胞所处的微环境来探究某些疾病的发病机制已成为现阶段的研究热点。4 细胞模型的体外应用及优劣势骨质疏松症是一种以骨折风险增加、骨量减少和骨结构紊乱为特征的全身代谢性骨骼疾病38。成骨细胞是骨的主要成分，对骨的发育和形成至关重要。骨形成在很大程度上取决于成骨细胞的数量和活性，成骨细胞功能障碍是导致骨质疏松的直接原因39。因此，探索促进成骨细胞活性和分化的方法可能有助于预防骨质疏松。MC3T3-E1细胞成骨模型是其理想选择之一。颅骨缺损通常由创伤、感染、肿瘤、先天性畸形或骨骼疾病引起40，骨重建是目前最主流的治疗方法。颅骨修复过程中发挥主要作用的是前骨细胞和间充质干细胞，二者向成骨细胞的分化能够帮助缺损部位的快速修复。组织工程技术在近几年发展迅速，一种典型方式是将合适的种子细胞和生长因子添加到可降解的多孔支架中41。MC3T3-E1细胞作为前骨细胞，在体外成骨后与支架结合能促进缺损部位的骨修复。牙齿脱落后会导致牙槽骨的破坏和吸收减少42。这可能会给后期恢复拔除部位的美观和功能带来困难。目前最可靠、最有效的治疗方法是用植骨材料填充拔牙后的缺损区43。利用体外实验寻找一种促成骨因子或药物是当下研究的热点，不少研究者选择MC3T3-E1细胞作为体外实验的种子细胞。原代培养的成骨细胞可以很好地模拟体内成骨过程44，但存在增殖能力差、培养时间受限、转染效率低等问题，在骨组织工程的应用方面受到了限制。研究者们开发出了多种成骨细胞系，其中包括骨样细胞MLO-Y4、骨肉瘤细胞MG-63、前骨细胞MC3T3-E1等。MC3T3-E1细胞的生物学功能与原代培养的成骨细胞最为接近，其增殖能力强、能无限传代，并且作为成骨细胞的前体，可用于研究细胞的整个成骨过程。而其他成骨细胞系虽能无限传代，但由于其取自成熟的骨细胞或瘤样细胞，部分生物学特性与原代培养的成骨细胞略有不用，故不作为细胞成骨模型的首选。所以，在当前骨组织工程的大背景下，MC3T3-E1细胞被广泛地用于研究成骨细胞的分化、增殖和分子机制，并且作为众多疾病的靶细胞类型的首选。尽管MC3T3-E1细胞是一种几乎能替代原代人成骨细胞的体外模型，适用于各研究领域，但在临床转化方面，最令人担忧的是物种差异，有一定的局限性。因此，应谨慎推断结果，根据具体研究情况得出结论。另外，目前商业化的MC3T3-E1细胞系来源于新生小鼠的颅顶骨，而在现阶段的大部分研究中，MC3T3-E1细胞系多应用于四肢骨的研究，颅顶骨的生长方式以膜内成骨为主，而四肢骨.882023 年 10 月第 20 卷 第 5 期生 物 骨 科 材 料 与 临 床 研 究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY则以软骨内成骨为主，二者的生长方式不一样，当MC3T3-E1细胞应用于四肢骨的成骨过程研究时所得出的结论是否严谨需要进一步讨论。5 展望合适的细胞模型有助于更好地了解所涉及的生理、病理和再生过程。MC3T3-E1细胞是一种前骨细胞，其在早期具有较强的增殖、矿化和分化能力，已被广泛用于研究成骨细胞在体外的生物学变化。必须指出的是，许多因素可以影响MC3T3-E1细胞的生长，例如，用于细胞培养的培养基及其添加剂、细胞接种密度及培养系统本身，这可能会导致不同的结果。长期以来，单层培养一直是MC3T3-E1细胞体外培养的标准方法。但这不能反映自然条件下的骨生长，因此人们对建立一个更接近细胞自然环境的细胞系统更感兴趣。研究表明，在3D系统中培养的细胞，与普通培养的细胞有很大的差异，其更能体现细胞的真实状态，这将会是未来研究的重点。此外，许多研究已经将MC3T3-E1细胞成骨模型用于生物材料的评估，并将注意力放在参与细胞成骨的信号通路上。随着研究深入和其他技术的发展，有望扩大其应用前景。参考文献1 Huang S,Jin M,Su N,et al.New insights on the reparative cells in bone regeneration and repairJ.Biol Rev Camb Philos Soc,2021,96(2):357-375.2 Majidinia M,Sadeghpour A,Yousefi B.The roles of signaling pathways in bone repair and regenerationJ.J Cell Physiol,2018,233(4):2937-2948.3 Vermeulen S,Tahmasebi BZ,Habibovic P.Biomaterial-induced pathway modulation for bone regenerationJ.Biomaterials,2022,283:121431.4 Li W,Zhang S,Liu J,et al.Vitamin K2 stimulates 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BIOMECHANICS MATERIALS AND CLINICAL STUDY提下，在产品注册前总结新材料骨植入医疗器械产品研发过程中的关注重点。对于无法及时形成标准的内容，可将其体现在指导原则和审评要点中，如新的测试方法和研究思路，并突出对新材料风险识别的内容。尽早完成相关技术指导文件的制定并发布，以期为相关产品的研发和安全有效性评价提供技术参考。研究数据和信息的积累是提升审评人员专业技术能力的基础，审评机构可以充分利用数据化、智能化技术手段，建立新材料骨植入医疗器械内部数据库，基于产品安全有效性评价的基本框架，定期将审评的产品情况进行归档，重点说明新材料、新工艺、新风险和新性能的评价方法，并总结产品问题及解决方案，形成相应的审评共识。随着产品数量的增加，不断扩充数据库，还可保持审评的延续性。利用数据库的方式实现审评经验的积累，既有助于审评尺度的统一，也有助于准确把握产品风险点，真正做到风险的精准控制，以期减少产品源头性风险和系统性风险。基于数据库形成新的审评要求，定期通过修订指导原则和审评要点对外发布，力求申请人及时了解产品安全有效性评价要求的动态，提高监管服务质量。参考文献1 国家药品监督管理局.国家药监局启动中国药品监管科学行动计划EB/OL.(2019-04-30)2023-02-22.https:/ 李玉国.骨科可降解镁合金生物材料的研究进展J.合成材料老化与应用,2021,50(6):155-188.3 李少鹏,陈豪杰,杨帆,等.可降解镁金属在骨科中的应用J.生物骨科材料与临床研究,2021,18(4):92-96.4 施泽文,刘辰,陈先军,等.表面改性可降解镁的生物性能及其在骨修复领域的应用J.国际骨科学杂志,2021,42(4):226-230.5 张继坤,乌日开西艾依提,阿依古丽喀斯木,等.3D打印聚醚醚酮复合材料人工骨的成型参数优化J.西安交通大学学报,2022,56(8):22-31.6 朱策,丰千钧,刘立岷,等.骨修复聚醚醚酮材料改性的研究进展J.华西医学,2022,37(10):1441-1448.7 国家药品监督管理局.国家药监局关于发布医疗器械安全和性能基本原则的通告(2020年第18号)EB/OL.(2020-03-03)2023-02-22.https:/ 孙嘉怿（1988-）女，硕士，助理研究员。研究方向：骨科医疗器械技术审评。（收稿日期：2023-02-27）本文引用格式：孙嘉怿,张家振.新材料骨植入医疗器械审评方法研究及相关思考J.生物骨科材料与临床研究,2023,20(5):90-93.32 Matthews BG,Naot D,Callon KE,et al.Enhanced osteoblastogenesis in three-dimensional collagen gelsJ.Bonekey Rep,2014,3:560.33 Xu Y,Wu X,Wang S,et al.Hydroxyapatite nanoparticle-crosslinked peptide hydrogels for three-dimensional culture and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastsJ.J Biomed Nanotechnol,2019,15(12):2351-2362.34 韩标,张扬,李昊,等.模拟微重力环境下核因子 B 信号通路调节MC3T3-E1细胞成骨分化的实验研究J.生物医学工程学杂志,2019,36(3):421-427.35 Dong J,Wang H,Li G,et al.The combined effects of simulated microgravity and X-ray radiation on MC3T3-E1 cells and rat femursJ.NPJ Microgravity,2021,7(1):3.36 Ma Y,Ha CS,Hwang SW,et al.Non-thermal atmospheric pressure plasma preferentially induces apoptosis in p53-mutated cancer cells by activating ROS stress-response pathwaysJ.PLoS One,2014,9(4):e91947.37 Tominami K,Kanetaka H,Sasaki S,et al.Cold atmospheric plasma enhances osteoblast differentiationJ.PLoS 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