miR-22-3p靶向调控PLAGL2保护OGD_R诱导的心肌细胞损伤机制研究.pdf

全科医学临床与教育 2023 年 9 月 第 21 卷第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9DOI：10.13558/ki.issn1672-3686.2023.009.005作者单位：310007浙江杭州，杭州市中医院急诊科 论著 miR-22-3p靶向调控PLAGL2保护OGD/R诱导的心肌细胞损伤机制研究陈玥璇汪潞柳华锋摘要目的探讨miR-22-3p在氧-糖剥夺/复氧（OGD/R）心肌细胞铁死亡中的作用及机制。方法大鼠心肌细胞系H9c2采用OGD/R处理以及转染miR-22-3p模拟物（miR-22-3p mimic）。细胞根据是否缺氧及有无转染分为常氧组、OGD/R组、OGD/R+miRNA模拟物阴性对照（miRNA-NC组）和OGD/R+miR-22-3p组。采用细胞计数（CCK-8）法检测细胞活力，酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测H9c2细胞中铁死亡指标水平，Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶 4（Gpx4）及多形性腺瘤基因样蛋白 2（PLAGL2）蛋白表达，双荧光素酶报告实验验证 miR-22-3p 和PLAGL2 靶向关系。结果OGD/R 处理 H9c2 细胞后，第 4 天的吸光度值低于常氧组，活性氧（ROS）及丙二醛（MDA）水平、Fe2+的积累明显高于常氧组，miR-22-3p水平明显低于常氧组（t分别=3.78、4.24、2.54、4.47、3.53，P均0.05），H9c2细胞转染miR-22-3p mimic及OGD/R处理后，第3、4 天的吸光度值高于miR-NC+OGD/R组（t分别=2.98、1.97、2.57、2.46，P均0.05），细胞MDA、ROS、Fe2+明显低于OGD/R+miR-NC组（t分别=2.62、5.35、4.11，P均0.05），Gpx4表达水平高于OGD/R+miR-NC组。Fer-1和OGD/R处理H9c2细胞后，第3、4 天的细胞吸光度值明显高于OGD/R组（t分别=3.12、3.36，P均0.05），细胞MDA、ROS和Fe2+水平显著低于OGD/R组（t分别=3.03、5.33、2.48，P均0.05）。H9c2细胞转染miR-22-3p组的PLAGL2蛋白表达明显低于miR-NC组，且PLAGL2-WT+miR-22-3p组的荧光素酶活性明显低于PLAGL2-MUT+miR-22-3p组（t=2.69，P0.05）。H9c2细胞共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒后，Gpx4表达低于OGD/R+miR-22-3p组，吸光度值明显低于OGD/R+miR-22-3p 组（t 分别=3.91、3.12，P 均0.05），MDA、Fe2+、ROS 水平高于OGD/R+miR-22-3p组（t 分别=3.78、3.87、3.05，P 均0.05）。结论miR-22-3p靶向调控PLAGL2表达抑制铁死亡，进而降低OGD/R诱导的心肌细胞损伤。关键词miR-22-3p；PLAGL2；OGD/R；心肌细胞；铁死亡Study on mechanism of miR-22-3p protection against OGD/R-induced cardiomyocyte injury by targetingPLAGL2CHEN Yuexuan，WANG Lu，LIU Huafeng.Department of Emergency，Hangzhou Traditional Chinese MedicineHospital，Hangzhou 310007，China.AbstractObjectiveTo study the role of miR-22-3p in oxygen and glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R）induced myocardial cell injury and the mechanism.MethodsRat myocardial cell line H9c2 was cultured upon OGD/Rand transfetced with miR-22-3p mimic.Based on the presence or absence of hypoxia and transfection，cells were dividedinto normal oxygen group，OGD/R group，OGD/R+miRNA-NC group，and OGD/R+miR-22-3p mimic group.Cell viabilityand ferroptosis markers were detected by CCK-8 and ELISA methods.The expression of Gpx4 and PLAGL2 proteins weredetected by western blot.Dual luciferase reporting assay verified the targeting relationship between miR-22-3p and PLAGL2.ResultsAfter OGD/R treatment，the absorbance value of H9c2 cells on 4th day was lower than that of the normaloxygen group，the accumulation of ROS，MDA and Fe2+was significantly higher than that of the normal oxygen group，thelevel of miR-22-3p was significantly lower than that of the normal oxygen group（t=3.78，4.24，2.54，4.47，3.53，P0.05）.After transfected with miR-22-3p mimic and subjected to OGD/R in H9c2 cells，the absorbance was higher thanthat of miR-NC+OGD/R group at third and fourth day（t=2.98，1.97，2.57，2.46，P0.05）.MDA，ROS and Fe2+were significantly lower than those in OGD/R+miR-NC group（t=2.62，5.35，4.11，P0.05），and Gpx4 expression level was higher than that in OGD/R+miR-NC group.After Fer-1and OGD/R treatment，the absorbance of H9c2 cellsat third and fourth day was significantly higher than 784全科医学临床与教育 2023 年 9 月 第 21 卷第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9that of OGD/R group（t=3.12，3.36，P0.05）.The levels of MDA，ROS and Fe2+were significantly lower than those ofOGD/R group（t=3.03，5.33，2.48，P0.05）.The PLAGL2 protein expression in H9c2 cells transfected with miR-22-3pgroup was significantly lower than that of miR-NC group.The luciferase activity in PLAGL2-WT+miR-22-3p group wassignificantly lower than that of PLAGL2-MUT+miR-22-3p group（t=2.69，P0.05）.After co-transfected with miR-22-3p mimic and PLAGL2 overexpression plasmid，the Gpx4 expression in H9c2 cells was lower than that of OGD/R+miR-22-3p group，and the absorbance was significantly lower than that of OGD/R+miR-22-3p group（t=3.91，3.12，P0.05）.The levels of MDA，Fe2+and ROS were higher than those of OGD/R+miR-22-3p group（t=3.78，3.87，3.05，P0.05）.ConclusionmiR-22-3p inhibits ferroptosis and reduces OGD/R-induced myocardial cell injury via targeting PLAGL2.Key wordsmiR-22-3p；PLAGL2；OGD/R；cardiomyocytes；ferroptosis心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤是指急性冠状动脉闭塞后，再灌注导致更严重的心肌损伤，是影响心肌梗死患者预后的重要因素1。铁死亡是一种新型的调节性细胞死亡，其特征是铁依赖的脂质过氧化物累积，在心肌缺血等多种疾病中发挥重要作用2。微小 RNA（microRNAs，miRNAs）在转录后水平调控基因表达，参与调控细胞增殖、分化、凋亡和自噬等过程。有研究表明miR-22-3p可作为诊断冠心病的特异性生物标志物3，然而 miR-22-3p 在 I/R 损伤期间对于心肌细胞损伤的保护机制尚不清楚。因此，本次研究探讨了 I/R 过程中 miR-22-3p 对心肌细胞保护的分子机制。1材料与方法1.1研究对象本次研究起止时间为2022年8 月至2023年4 月，采用购自武汉普诺赛生命科技有限公司的大鼠心肌细胞系H9c2作为研究对象。所有实验操作均在杭州市中医院实验室进行。1.2细胞培养和转染H9c2细胞在含10胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素的DMEM培养液中，置于37 含5CO2的恒温细胞培养箱中培养。转染方法参考LipofectamineTM2 000转染说明书，转染48 h后收集细胞用于后续实验。1.3氧糖剥夺/复氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）体外细胞模型构建H9c2细胞根据是否缺氧分为常氧组、OGD/R组，根据是否转染miR-22-3p mimic分为OGD/R组+miR-NC组，OGD/R+miR-22-3p组，根据是否共转染miR-22-3p mimic和Fer-1分为OGD/R+Fer-1组和OGD/R-Fer-1+miR-22-3p组，根据是否共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒分为OGD/R+miR-22-3p组和OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2组。OGD/R处理方法如下：H9c2细胞在血清和无糖DMEM中培养，含有1O2、5CO2和94 N2，37 下培养6 h。缺氧后，细胞在正常生长条件下（5CO2和95空气）的完全培养基中再培养12 h。常氧组细胞在正常生长条件下，用完全DMEM培养液培养。本次实验为验证miR-22-3p对铁死亡的调控，H9c2细胞用60 nmol/L 铁死亡抑制剂 Fer-1 进行预处理 24 h，然后用OGD（6 h）/R（12 h）处理。1.4CCK-8检测细胞活力 将H9c2细胞以1104细胞/孔的密度接种到 96 孔板中。OGD/R 处理 18 h后，根据说明书要求，使用CCK-8试剂盒检测分别在24 h、48 h、72 h和96 h的细胞活力。每孔加入10 l CCK-8溶液，在37 孵育3 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。1.5实 时 定 量 PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）用Nanodrop检测从H9c2细胞中分离的RNA浓度和纯度。逆转录体系为1 l oligo（dT）Primer，用ddH2O补充至10 l，逆转录程序为37，15 min，85，5 s。qRT-PCR反应体系，12.5 l SYBR Premix Ex Taq，1 lcDNA和上下游引物各0.5 l，ddH2O补充至25 l。采用2-Ct公式计算miR-22-3p相对表达量，U6作为 内 参。引 物 如 下 所 示：miR-22-3p：5-AAGCUGCCGUUGAAGAACUGU-3（正向），5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3（反向）；U6：5-AACCTTATATCGGGCGGGA-3（正向），5-TTACGGCGATGCATAAT-3（反向）。1.6铁死亡水平测定取细胞悬液，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞 12 次。通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份。4，2 500 r/min 离心 20 min，弃沉淀、取上清。根据试剂盒说明书，测定细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、Fe2+水平。785全科医学临床与教育 2023 年 9 月 第 21 卷第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.91.7双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 实 验借 助 TargetScan7.1（http：/www.targetscan.org/vert_71/）网站用于预测miR-22-3p与PLAGL2的靶向结合位点。含 有 预 测 miR-22-3p 结 合 位 点 的 报 告 载 体pmiRGLO-PLAGL2 野生型质粒（PLAGL2-WT）或miRGLO-PLAGL2突变型质粒（PLAGL2-MUT）。使用 Lipofectamine 2 000 进 行 miR-22-3p mimic 与PLAGL2质粒共转染，并分为PLAGL2-WT+mirR-22-3p组和PLAGL2-MUT-mirR-22-3p组。48 h后，用双萤光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。1.8Western blot检测Gpx4蛋白 使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，再用10 SDA-PAGE进行电泳，转移至PVDF膜上。室温下使用5脱脂牛奶封闭2 h后，PVDF 膜与一抗 PLAGL2（1 1000）、Gpx4（1 1000）或-actin（1 10000）4 过夜孵育。TBST洗膜，使用兔二抗（1 5000）孵育1 h。TBST洗膜，使用ECL试剂检测蛋白信号。1.9统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数标准差（xs）表示。组间计量资料比较采用t检验；计数资料比较采用2检验。设P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1OGD/R诱导H9c2细胞后不同时间的吸光度值比较见表1表1OGD/R诱导H9c2细胞后不同时间的吸光度值比较组别OGD/R组常氧组第1天0.170.040.180.03第2天0.200.130.280.25第3天0.310.270.550.42第4天0.420.34*0.780.38注：*：与常氧组比较，P0.05。由表1可见，OGD/R组H9c2细胞在第1 天、第2 天和第3 天的吸光度值与常氧组比较，差异均无统计学意义（t 分别=0.21、0.86、0.25，P 均0.05），OGD/R组H9c2细胞在第4 天的吸光度值低于常氧组，差异有统计学意义（t=3.78，P0.05）。2.2OGD/R 诱导 H9c2 细胞后 ROS、MDA、Fe2+及miR-22-3p水平比较见表2表2OGD/R诱导H9c2细胞后ROS、MDA、Fe2+及miR-22-3p水平比较组别OGD/R组常氧组ROS/ng/L380.455.64*55.562.15MDA/nmol/L3.220.76*0.260.20Fe2+/nmol/L20.564.35*4.951.02miR-22-3p0.150.02*0.570.13注：*：与常氧组比较，P0.05。由表2可见，OGD/R组H9c2细胞ROS及MDA水平、Fe2+的积累明显高于常氧组，miR-22-3p水平明显低于常氧组，差异均有统计学意义（t 分别=4.24、2.54、4.47、3.53，P均0.05）。2.3Western blot 检测 OGD/R 诱导 H9c2 细胞后Gpx4蛋白水平见图1Gpx4GAPDH常氧组OGD/R组图1Western blot检测OGD/R诱导H9c2细胞后Gpx4蛋白水平由图 1 可见，Western blot 实验进一步证实，Gpx4蛋白表达在OGD/R组明显降低。2.4H9c2细胞中miR-22-3p mimic转染效率miR-22-3p组的miR-22-3p表达水平（3.560.43），明显高于OGD/R+miR-NC组（0.230.14），差异有统计学意义（t=3.25，P0.05）。2.5H9c2 细 胞 OGD/R 处 理 及 转 染 miR-22-3pmimic后吸光度值比较见表3表3H9c2细胞OGD/R处理及转染miR-22-3p mimic后吸光度值比较组别常氧组OGD/R组OGD/R+miR-NC组OGD/R+miR-22-3p 组第1天0.130.020.140.010.150.020.140.03第2天0.290.150.220.100.200.130.210.15第3天0.590.220.320.25*0.330.200.450.16#第4天0.820.280.430.24*0.440.210.660.19#注：*：与常氧组比较，P0.05；#：与OGD/R+miR-NC组比较，P0.05。由表3可见，各组在第1 天和第2 天间吸光度值比较，差异均无统计学意义（F分别=0.88、0.22，P均0.05），第3 天和第4 天，OGD/R组吸光度值高于常氧组，OGD/R+miR-22-3p 组吸光度值高于OGD/R+miR-NC组，差异均有统计学意义（t分别=2.98、1.97、2.57、2.46，P均0.05）。2.6H9c2 细胞中转染 miR-22-3p mimic 后 ROS、MDA、Fe2+水平比较见表4由表4可见，OGD/R组H9c2细胞中MDA、ROS水平、Fe2+的积累明显高于常氧组，差异均有统计学意义（t分别=3.33、2.47、2.03，P均0.05），而OGD/R+miR-22-3p 组MDA、ROS水平、Fe2+的积累明显低于 786全科医学临床与教育 2023 年 9 月 第 21 卷第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9注：A为Targetscan预测PLAGL2和 miR-22-3p的特异性结合位点；B为Western blot检测PLAGL2蛋白表达水平。图3miR-22-3p对PLAGL2的表达调控检测PLAGL2GAPDHmiR-NC组miR-22-3p组常氧组ABOGD/R+miR-NC组，差异均有统计学意义（t分别=2.62、5.35、4.11，P均0.05）。表4H9c2细胞中转染miR-22-3p mimic后ROS、MDA、Fe2+水平比较组别常氧组OGD/R组OGD/R+miR-NC组OGD/R+miR-22-3p 组ROS/ng/L58.35 2.15390.45 8.24*386.5814.18166.3811.64#MDA/nmol/L0.310.163.140.42*2.840.801.240.15#Fe2+/nmol/L2.450.1720.635.14*17.274.528.354.31#注：*：与常氧组比较，P0.05；#：与OGD/R+miR-NC组比较，P0.05。2.7H9c2细胞中转染miR-22-3p mimic后Gpx4表达水平比较见图2Gpx4GAPDH常氧组OGD/R组OGD/R+miR-NC组OGD/R+miR-22-3p组图2Western blot检测H9c2细胞中Gpx4蛋白表达由图2可见，OGD/R组Gpx4表达水平下调，而OGD/R+miR-22-3p组Gpx4表达水平显著上调。2.8OGD/R后细胞转染miR-22-3p mimic和Fer-1处理后吸光度值比较见表5由表5可见，第1 天和第2 天，各组间吸光度值比较，差异均无统计学意义（F分别=0.04、0.32，P均0.05）。第3 天和第4 天，OGD/R组吸光度值低于常氧组（t分别=4.66、3.21，P均0.05），OGD/R+Fer-1 组吸光度值明显高于OGD/R组（t分别=3.12、3.36，P均0.05）。而OGD/R+Fer-1+miR-22-3p组吸光度值与OGD/R+Fer-1 组比较，差异均无统计学意义（t分别=0.31、1.06，P均0.05）。表5OGD/R后细胞转染miR-22-3p mimic和Fer-1处理后吸光度值比较组别常氧组OGD/R组OGD/R+Fer-1组OGD/R+Fer-1+miR-22-3p组第1 天0.220.020.200.050.210.040.210.03第2 天0.350.050.250.100.230.030.220.12第3 天0.620.170.420.19*0.590.12#0.550.14第4 天0.880.180.530.23*0.800.17#0.710.23注：*：与常氧组比较，P0.05；#：与OGD/R+miR-NC组比较，P0.05。2.9OGD/R后细胞转染miR-22-3p mimic和Fer-1处理后ROS、MDA、Fe2+水平比较见表6表6OGD/R后细胞转染miR-22-3p mimic和Fer-1处理后ROS、MDA、Fe2+水平检测组别常氧组OGD/R组OGD/R+Fer-1 组OGD/R+Fer-1+miR-22-3p 组ROS/ng/L61.30 6.03394.6010.12*171.35 8.14#180.43 9.55MDA/nmol/L0.220.062.930.12*1.170.43#1.190.25Fe2+/nmol/L2.250.3118.264.53*5.571.02#6.051.31注：*：与常氧组比较，P0.05；#：与OGD/R+miR-NC组比较，P0.05。由表6可见，OGD/R组H9c2细胞MDA及ROS水平、Fe2+的积累明显高于常氧组，差异均有统计学意义（t 分别=4.52、3.49、3.39，P 均0.05），GD/R+Fer-1 组逆转下调 MDA、ROS 和 Fe2+水平（t 分别=3.03、5.33、2.48，P均0.05）。OGD/R+Fer-1+miR-22-3p 组H9c2细胞MDA及ROS水平、Fe2+的积累与OGD/R+Fer-1 组比较，差异均无统计学意义（t分别=0.21、1.18、0.63，P均0.05）。2.10miR-22-3p 对 PLAGL2 的表达调控检测见图3 787全科医学临床与教育 2023 年 9 月 第 21 卷第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9由图3A 可见，通过Targetscan靶向关系预测网站发现 miR-22-3p 和 PLAGL2 存在特异性结合位点。由图3B可见，H9c2细胞转染miR-22-3p组的PLAGL2蛋白表达明显低于miR-NC组。2.11miR-22-3p 靶向调控 PLAGL2 表达的检测PLAGL2-WT+miR-22-3p 组的荧光素酶活性为（0.950.15），明显低于 PLAGL2-MUT+miR-22-3p组（0.240.05），差异有统计学意义（t=2.69，P0.05）。2.12过表达PLAGL2对Gpx4的表达调控见图4由图4A、4B可见，共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒组细胞中PLAGL2表达显著高于miR-22-3p转染组，Gpx4表达显著低于miR-22-3p转染组。PLAGL2GAPDH常氧组 miR-22-3p组miR-22-3p+PLAGL2组Gpx4GAPDH常氧组OGD/R组OGD/R+miR-22-3p组OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2组AB图4Western blot检测H9c2细胞PLAGL2和Gpx4蛋白表达水平2.13OGD/R 后细胞共转染 miR-22-3p mimic 和PLAGL2过表达质粒后吸光度值见表7表7OGD/R后细胞共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒后吸光度值组别常氧组OGD/R组OGD/R+miR-22-3p 组OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2组第1 天0.180.030.180.040.170.030.190.02第2 天0.370.040.320.090.350.070.340.11第3 天0.610.090.320.07*0.570.11#0.410.12第4 天0.840.130.410.10*0.780.15#0.460.15注：*：与常氧组比较，P0.05；#：与OGD/R组比较，P0.05；：与OGD/R+miR-22-3p组比较，P0.05。由表7可见，第1、2 天，各组细胞吸光度值比较，差异均无统计学意义（F分别=0.21、0.12，P均0.05）。第3、4 天，OGD/R组吸光度值明显高于常氧组，差异均有统计学意义（t分别=6.33、7.18，P均0.05）。OGD/R+miR-22-3p 组吸光度值明显高于OGD/R组（t分别=3.11、4.22，P均0.05），OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2 组 的 吸 光 度 值 明 显 低 于OGD/R+miR-22-3p 组，差异均有统计学意义（t分别=3.91、3.12，P均0.05）。2.14OGD/R 后细胞共转染 miR-22-3p mimic 和PLAGL2过表达质粒后ROS、MDA、Fe2+水平比较见表8表8OGD/R后细胞共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒后ROS、MDA、Fe2+水平组别常氧组OGD/R组OGD/R+miR-22-3p组OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2组ROS/ng/L56.354.24383.507.32*156.638.05#356.468.58MDA/nmol/L0.260.162.910.10*1.210.31#2.790.20Fe2+/nmol/L2.130.4618.183.58*5.171.32#14.851.25注：*：与常氧组比较，P0.05；#：与OGD/R组比较，P0.05；：与OGD/R+miR-22-3p组比较，P0.05。由表8可见，OGD/R组ROS、MDA、Fe2+水平明显高于常氧组（t 分别=4.52、3.54、4.01，P 均0.05），OGD/R+miR-22-3p 组MDA及Fe2+、ROS水平明显低于OGD/R组（t分别=4.71、4.35、3.05，P均0.05）。OGD/R+miR-22-3p+PLAGL2组的MDA及Fe2+、ROS水平高于 OGD/R+miR-22-3p（t 分别=3.74、3.87、3.05，P均0.05）。3讨论最近的研究表明，I/R损伤会导致miRNAs的表达改变，影响心肌细胞的存活和恢复。此外，仍有其它研究指出miR-22-3p在冠状动脉疾病过程中起作用，可作为诊断冠状动脉疾病的特异性标志物3。本次研究揭示 miR-22-3p 在体外心肌细胞OGD/R损伤过程起到保护作用，其机制为通过靶向 788全科医学临床与教育 2023 年 9 月 第 21 卷第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9PLAGL2蛋白表达抑制铁死亡。既往研究已证实铁死亡在心肌病、心肌梗死、缺血再灌注损伤等疾病中发挥重要作用4。miRNAs如miR-7-5p、miR-150-5p和miR-706等通过调控心肌细胞铁死亡，参与心脏发育、心肌重塑和心力衰竭等生物过程。本次研究发现OGD/R诱导心肌细胞损伤过程中伴随铁死亡指标MDA及Fe2+、ROS水平上调，miR-22-3p表达水平降低。Gpx4在阻断铁死亡过程中起主要作用，本次研究发现OGD/R可诱导心肌细胞中Gpx4表达下调。进一步的研究结果发现，过表达miR-22-3p下调了OGD/R诱导的心肌细胞MDA及Fe2+、ROS水平，提高心肌细胞活力，上调 Gpx4 表达，而铁死亡抑制剂 Fer-1 对过表达miR-22-3p后H9c2细胞活力及铁死亡无明显影响，提示miR-22-3p对心肌细胞OGD/R损伤的保护功效被Fer-1阻断，miR-22-3p对心肌细胞OGD/R损伤的保护机制依赖于降低铁死亡。Cao 等5发现miR-22在OGD/R诱导的大鼠神经干细胞中表达降低，而过表达miR-22可减轻OGD/R诱导的神经干细胞损伤。Yuan等6揭示心肌梗死患者心肌细胞中过表达miR-22-3p能够抑制肿瘤细胞铁死亡。这些研究可一定程度上也支持本次研究结论，证实了miR-22-3p通过抑制铁死亡保护心肌细胞I/R损伤的作用。PLAGL2是一类源自于PLAG基因家族的锌脂蛋白，也是一种细胞核转录因子，可参与调控多种基因表达，已被报道在多种肿瘤进展中发挥重要作用7，然而在I/R损伤中鲜有研究。本次研究通过Targetscan预测发现PLAGL2和 miR-22-3p存在特异性结合位点，且过表达miR-22-3p显著降低H9c2细胞中PLAGL2蛋白水平。双荧光素酶报告实验显示过表达miR-22-3p显著降低PLAGL2-WT的荧光素酶活性，而对PLAGL2-MUT的荧光素酶活性无明显影响，证实 miR-22-3p 与 PLAGL2 可直接结合。这些结果提示miR-22-3p通过靶向结合PLAGL2负调控其表达。此外，本次研究结果还显示，PLAGL2过表达可明显逆转miR-22-3p过表达诱导的H9c2细胞活力增加，MDA及Fe2+、ROS水平抑制和Gpx4表达上调，提示PLAGL2参与心肌I/R损伤后细胞活力和铁死亡的调控，miR-22-3p对心肌细胞损伤保护功效可能是通过靶向负调控PLAGL2蛋白表达来完成。Fan等8研究显示，miR-22-3p可通过靶向调控PLAGL2表达抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。在心肌I/R损伤过程中，miR-22-3p与PLAGL2存在调控关系，即miR-22-3p可通过靶向调控PLAGL2表达进而抑制铁死亡保护心肌I/R损伤。综上所述，本次研究结果证实了miR-22-3p靶向调控 PLAGL2 蛋白表达抑制铁死亡，从而保护OGD/R诱导的心肌细胞损伤，为开发新的临床治疗提供研究方向。本次研究缺乏体内实验，因此需要后续开展动物研究进一步确证miR-22-3p对心肌缺血保护的分子机制。然而，本次研究只在体外细胞模型中探究miR-22-3p对心肌细胞的保护作用，不能完全模拟人体心肌I/R损伤。因此需要继续开展动物或原代心肌细胞实验，以进一步确证miR-22-3p对心肌缺血保护的功效及分子机制。参考文献1Li Y，Li Z，Liu J，et al.miR-190-5p alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by targeting PHLPP1J.Dis Markers，2021，2021：8709298.2Lillo-Moya J，Rojas-Sole C，Munoz-Salamanca D，et al.Targeting ferroptosis against ischemia/reperfusion cardiacinjuryJ.Antioxidants（Basel），2021，10（5）：667.3Zhang M，Hu Y，Li H，et al.miR-22-3p as a potentialbiomarker for coronary artery disease based on integratedbioinformaticsanalysisJ.FrontGenet，2022，13：936937.4Wang Z，Yao M，Jiang L，et al.Dexmedetomidine attenuates myocardial ischemia/reperfusion-induced ferroptosisvia AMPK/GSK-3beta/Nrf2 axisJ.Biomed Pharmacother，2022，154：113572.5Cao Y，Liu H，Zhang J，Dong Y.Circular RNA cZNF292silence alleviates OGD/R-induced injury through up-regulation of miR-22 in rat neural stem cells（NSCs）J.Artif Cells Nanomed Biotechnol，2020，48（1）：594-601.6Yuan Y，Mei Z，Qu Z，et al.Exosomes secreted from cardiomyocytes suppress the sensitivity of tumor ferroptosisin ischemic heart failureJ.Signal Transduct Target Ther，2023，8（1）：121.7赵琪，何长海，王志，等.PLAGL2、p16、p53 基因在前列腺癌中的表达及意义J.广东医学，2020，41（8）：818-824.8Fan T，Wang C，Li X，et al.MiR-22-3p suppresses cellmigration and invasion by targeting PLAGL2 in breastcancerJ.J Coll Physicians Surg Pak，2021，31（8）：937-940.（收稿日期2023-06-16）（本文编辑高金莲）789