GEO数据库对类风湿性关节炎自噬相关基因的鉴定及生物信息学分析.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 26 GEO 数据库对类风湿性关节炎自噬相关基因的鉴定及生物信息学分析 陈波杰1 王敷强1 张 赟1 刘 芳2（通讯作者）1.赣州市人民医院关节外科，江西 赣州 341000 2.赣南医学院第一附属医院耳鼻喉头颈外科，江西 赣州 341000 摘要：摘要：目的 自噬可能参与 RA 的发病；但是，RA 与自噬相关的基因在很大程度上尚不清楚。因此，探讨自噬相关基因在 RA 中的作用机制。方法 采用 GEO 数据库对 GSE55235 芯片数据集进行差异基因的筛选，获得差异表达基因与自噬相关基因作交集，获得 RA 自噬相关基因，随后对 RA 自噬相关基因进行相关性分析、GO 和 KEGG 通路富集分析，构建蛋白之间互作网络图（PPI），通过 Cytoscape3.9.0 软件获取 hub 关键基因。结果 基于生物信息学分析，共筛选出 1122 个差异表达基因，自噬基因 232 个，二者交集共鉴定了 26 个潜在的自噬相关基因。BP 主要富集在细胞对外部刺激的反应、肽酶活性的调节过程等 436 个生物学进程条目；在 CC 中主要富集在线粒体外膜、细胞器外膜和外膜等 8 个细胞成分条目；在 MF 中主要富集在泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合等 33 个分子功能条目。主要富集在 MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、TNF/TNF信号通路及凋亡等 75 个信号通路中。10 个关键基因 VEGFA、MAPK8、CASP8、FOXO3、MYC、FOS、CDKN1A、TNFSF10、FOXO1、EGFR。结论 RA 中的自噬相关基因可能是诊断和预后的有价值的生物标志物，将来可能在临床上用作治疗靶点。关键词：关键词：类风湿性关节炎；GEO 数据库；自噬；生物信息学 中图分类号：中图分类号：R593 类风湿性关节炎（RA）属于一种慢性自身免疫性疾病，如果不及时治疗，可能导致不可逆的关节损伤或残疾1。然而 RA 的发病机制至今仍未完全明确。自噬可能参与免疫和非免疫细胞的成熟、存活和增殖，这表明它在 RA 的发病机制中发挥着重要作用2。其他研究也表明自噬可能与 RA 成纤维细胞样滑膜细胞凋亡抵抗、破骨形成以及软骨和骨的慢性炎症和破坏相关3。因此，对类风湿性关节炎自噬相关基因有待进一步探索研究。本研究通过 GEO 数据库获取 RA 差异表达基因并对自噬相关基因鉴定分析处理。利用生物信息学技术探讨自噬参与 RA 发生、发展的关键基因及通路，进一步更好地阐明自噬在 RA 发病机制中的作用。并为 RA 的治疗提供潜在的生物学标志物。1 材料和方法 1.1 数据来源及预处理 通过GEO数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以“Rheumatoid arthritis”为检索词，基于 GPL96 平台的 Affymetrix Human Genome U133A Array 所获得数据集 GSE55235。其中收集了 10 例 RA 患者滑膜组织作为实验组和 10 例健康滑膜组织作为对照组。自噬基因 来 源 于 人 类 自 噬 数 据 库（HADb）（http:/www.autophagy.lu/index.html）。1.2 RA 差异表达基因的鉴定 从 GEO 获得数据集并使用 GEO2R 在线分析对微阵列数据进行分析。以|log2FoldChange|1，调整后的p值0.05作为筛选条件，筛选出差异表达基因（DEGs）。利用 R 编程语言对基因表达进行火山图可视化。其中Venn Diagram 包对自噬基因与 RA 差异表达基因进行交集分析，获得 RA 自噬相关基因。并在GSE55235数据集中识别并匹配这些自噬相关基因的表达值创建热图。1.3 RA 自噬相关基因功能富集分析 通过 R 语言中“ClusterProfiler”和“ggplot”软件包用于 GO 和 KEGG 富集分析并且可视化，分析已鉴定的 RA 中涉及的差异表达自噬相关基因。按照生物过程、细胞成分和分子功能三大类对 RA 进行富集分析。调整后的 P 值0.05 被认为是显著富集项的筛选标准。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 27 1.4 构建 PPI 网络，筛选 hub 基因 为了更深入地了解RA中差异表达与自噬相关基因之间的关系，使用 STRING 数据库（v3.9.0）构建 RA-自噬基因的 PPI 网络，并导入 Cytoscape 软件(版本3.9.0)分析。筛选阈值设置为中等置信度0.4，并丢弃孤立的节点，使用 CytoHubba 插件进行拓扑分析，筛选出评分排名前 10 的关键基因。2 结果 2.1 RA 差异表达基因的筛选 差异基因的筛选条件设定为|log2FoldChange|1，调整后的 p 值0.05，得到差异表达基因（DEGs）1122 个，其中 650 个为下调基因，472 个为上调基因。并绘制差异基因火山图（图 1）。图 1 差异基因表达火山图 Up 表示上调基因，Down 表示下调基因 2.2 RA 自噬相关基因的筛选 通过人类自噬数据库(HADb)获得自噬基因232个，再与 RA 差异基因做交集，利用 R(4.2.1)版本软件VennDiagram 包绘制绘制韦恩图，共获得 26 个 RA 自噬相关基因。并使用 R 软件包绘制 RA 自噬相关基因热图（图 2）。图 2 RA 与健康组 26 个自噬相关基因热图 2.3 RA 自噬相关基因功能富集分析 使用 R 软件包 ClusterProfiler 进行对筛选出的26 个 RA 自噬基因进行富集分析，得到生物学进程条目436 个、细胞学组分条目 8 个、分子功能条目 33 个和KEGG 条目 75 个。P 值最显著的前 5 个以气泡图的形式展现出来，BP 主要富集在细胞对外部刺激的反应、肽酶活性的调节过程等；在CC中主要富集在线粒体外膜、细胞器外膜和外膜等；在 MF 中主要富集在泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合等（图 3）。KEGG 富集主要分布在 MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、TNF/TNF信号通路及凋亡等（图 4）。图 3 GO 富集分析（BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能）图 4 KEGG 通路富集分析 2.4 PPI 网络构建及 hub 基因的筛选 通过 STRING 数据库构建交集基因的 PPI 网络，其节点数目有 26 个，边数是 80 条，PPI enrichment p-value:1.0e-16；从该数据库下载结果并以导入Cytoscape3.9.0 软件构建更为清晰的蛋白-蛋白互作网络图，见图 5。并利用 Cytoscape 软件中 CytoHubba插件筛选出排名前 10 基因：VEGFA、MAPK8、CASP8、FOXO3、MYC、FOS、CDKN1A、TNFSF10、FOXO1、EGFR。图 5 自噬相关基因的蛋白互作网络（红色代表上调，蓝色代表下调）3 讨论 RA 是一种由炎症和自身免疫反应介导的慢性全身性疾病4。其发病机制尚不明确，研究表明,自噬相关基因与多种自身免疫性疾病有关5。自噬可以通过多种中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 28 方式参与 RA 进展，例如，参与自身免疫反应的延续，促进炎症和自身反应细胞的存活，细胞因子的产生以及瓜氨酸抗原的呈递。然而很少有通过生物信息学分析研究专门探讨 RA 中的自噬相关基因，通过多方面的探索可能为揭示它们在RA的病因和发病机制中的作用提供思路。本研究通过 GEO 数据库中对 GSE55235 基因芯片数据集进行 GEO2R 分析，在以|log2FoldChange|1，调整后的p值0.05筛选标准后共发现RA差异基因1122个，其中上调基因 472 个，下调基因 650 个。结果表明 RA 潜在发病机制相关复杂，而是许多基因和生物途径共同作用的结果。通过 GO 和 KEGG 分析确定不同表达的自噬相关基因的潜在生物学功能。其中“MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、TNF/TNF信号通路”在RA 自噬的发展中起着关键作用。研究表明通过雷公藤红素抑制PI3K/AKT/mTOR轴上调自噬来改善RA6。MAPK通路的激活与炎症反应密切相关，是有效治疗 RA 的潜在靶点7。TNF/TNF激活 RA 患者破骨细胞中的自噬，从而诱导破骨细胞分化，刺激破骨细胞介导的骨吸收8。本研究鉴定筛选出10个关键基因：VEGFA、MAPK8、CASP8、FOXO3、MYC、FOS、CDKN1A、TNFSF10、FOXO1、EGFR。据报道，VEGFA 在 RA 患者的 FLSs、巨噬细胞样滑膜细胞、中性粒细胞、滑膜液及血清中均呈现高表达状态9。JNK MAPKs 在 RA 中的主要作用是基质金属蛋白酶(MMP)介导的软骨破坏10。成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）通过促进滑膜炎症和持续性关节损伤，在 RA 中起关键作用，而阻断 CASP8 可以减少 RA 等疾病的细胞侵袭11。研究发现，CDKN1A 过表达显著抑制 HFLS-RA（人类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞）的增殖和侵袭12。另一项研究发现 FOS 表达能增加 TNF 诱导的破骨细胞的数量和再吸收能力13。在RA发病过程中，EGFR 可促进滑膜成纤维细胞产生细胞因子，抑制破骨细胞的形成，从而加重 RA 的严重程度14。一项研究表明，FoxO3 活性确定为 RA 的严重程度标志物，FoxO3a单倍型与成人 RA 的侵蚀评分有关15。一项研究表明，与健康供体外周血血相比，抑制 FoxO1 表达以促进 RA中的 FLS 存活16。MYC 在 RA 患者中抑制脂肪酸合成介导滑膜细胞的自噬过程，抑制 MYC 的表达在体内外具有抗炎作用17。本研究基于生物信息学分析确定了RA潜在的自噬相关基因，为通过调节自噬参与 RA 发病机制的潜在基因提供了新证据。本研究结果可能有助于提高对 RA 发病机制的理解，并可能在未来用于临床。这些关键基因和途径可能代表 RA 的潜在治疗靶点。然而，需要进一步的分子生物学实验加以验证。参考文献 1邵鑫,蒋先虹,王瑞,等.类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及巨自噬的表达水平J.风湿病与关节炎,2021,10(1):1-5.2王修竹,王福荣,葛玉,等.基于GEO数据库对类风湿关节炎差异表达基因的分析 验证及治疗中药预测J.中医药信息,2023,40(4):21-28.3冯艳花,张竞竞,王绍辉.整合生物信息学探究骨质疏松症和类风湿性关节炎潜在关键共同生物标志物及其 靶 向 治 疗 中 药 活 性 成 分 筛 选 J.药 学 研究,2023,42(2):82-88.4李渊博,李小建,张静涛,等.基于自噬筛选英夫利昔单抗治疗类风湿性关节炎不应答的标志物及其鉴定J.西安交通大学学报(医学版),2021,42(6):897-903.5夏福灿,王彩红,徐红薇.自噬在免疫及免疫相关疾病 中 的 研 究 进 展 J.国 际 免 疫 学 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号：GZ2022ZSF104）；2023 年江西省卫生健康委科技计划项目（项目名称：基于新型网络药理学模型探讨多种中药方剂治疗类风湿性关节炎作用机制，项目编号：202311958）。