FABPs基因表达量与高黎贡山猪脂肪酸含量的相关分析.pdf
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1、-169-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 FABPs基因表达量与高黎贡山猪脂肪酸含量的相关分析周戚斌1,富国文2,吴玲想1,杨世婷1,刘珈纶1,李文君1,吴正明1,赵桂英1*(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201;2.云南农业大学动物医学院,云南昆明 650201)摘 要:为探究FABP1、FABP3基因在高黎贡山猪肝脏、背脂和背最长肌 3 个组织中的相对表达量和脂肪酸含量的关系,本研究以高黎贡山猪为研究对象,采用气相色谱法测定其背最长肌脂肪酸含量,利用 RT-qPCR技术检测FABP1、FABP3基因在高黎贡
2、山猪背脂、背最长肌和肝脏中的相对表达量,并与脂肪酸含量进行相关分析。高黎贡山猪FABP1基因的表达趋势为:肝脏 背脂 背最长肌,FABP3基因的表达趋势为:背最长肌 肝脏 背脂;经与脂肪酸含量进行相关性分析,发现在肝脏组织中FABP1基因与十九酸的含量呈显著负相关;在背最长肌组织中FABP3基因与二十二碳一烯酸含量呈显著正相关,与二十碳五烯酸呈极显著正相关。结果表明,FABP3基因与高黎贡山猪多不饱和脂肪酸中的二十二碳一烯酸和二十碳五烯酸含量有相关性,但FABP1、FABP3能否作为影响高黎贡山猪脂肪酸含量的关键基因还需进一步探究。关键词:FABP1;FABP3;高黎贡山猪;基因表达量;脂肪酸
3、中图分类号:S828.2 文献标识码:A DOI 编号:10.19556/j.0258-7033.20230310-02猪肉作为我国主要的肉类消费品,其品质越来越受到人们的关注,其中猪肉中的脂肪酸含量对猪肉的理化性质有着极其重要的影响,且与猪肉的营养价值紧密相关1。高黎贡山猪作为云南特有的地方猪种,具有肉质优良、适应性强、多不饱和脂肪酸和必需脂肪酸含量较高等特点,相较于云南其他几个地方猪种,高黎贡山猪猪肉营养成分丰富,肉质营养价值较优,有较高的开发利用价值2-3。脂 肪 酸 结 合 蛋 白(Fatty Acid Binding Proteins,FABPs)作为胞内脂质结合蛋白家族的成员之一,
4、在动物胞内长链脂肪酸摄取、转运和调节代谢等生理调控过程中起重要作用4。FABP1也被称为L-FABP,在胞质内能与长链脂肪酸发生特异性结合,与细胞内脂质调节、核信号传导和细胞内脂肪酸运输等功能相关联5。FABP3又名H-FABP,是一种可溶性的小分子细胞内非酶蛋白质,Gerbens 等6通过对来自猪/啮齿动物细胞杂交组的 DNA 进行猪序列特异性 PCR,将猪H-FABP基因定位在 6 号染色体上。研究发现,FABP1基因表达主要在增殖细胞中被诱导,而FABP3在前脂肪细胞分化后期的过程中表达量增加,FABP3可能参与脂肪形成中间阶段的脂肪酸转运7。在哺乳动物中,FABP1基因主要在肝脏和小肠
5、中表达8,FABP3主要在心肌和骨骼肌中表达9。FABP1、FABP3 是 2 种在肌肉脂质沉积中起重要作用的胞质蛋白,作为调控家畜脂肪酸含量的重要候选基因已在鸡、猪、羊等家畜上进行了相关研究10-11,在猪上关于此基因的研究较多集中在肌内脂肪(IMF)方面,但FABP1、FABP3基因在高黎贡山猪上的研究还未有报道。本实验采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)技术测定高黎贡山猪 3 个组织中FABP1、FABP3基因的相对表达量,以期在分子水平研究FABP1、FABP3基因与高黎贡山猪肉质中脂肪酸含量的相关性,为研究高黎贡山猪脂肪酸合成沉积提供分子参考依据。1 材料与方法 1.1 实验材
6、料 收稿日期:20230310;修回日期:2023-04-25资助项目:云南农业大学科研发展基金(KX900095000)作者简介:周戚斌(1999-),男,云南曲靖人,在读硕士研究生,主要从事动物生产学研究,E-mail:*通讯作者:赵桂英(1966-),女,云南昆明人,教授,主要从事猪的遗传育种和地方猪种资源的评价、开发及利用研究工作,E-mail:-170-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期1.1.1 动物及基础日粮 实验动物为怒江州高黎贡山猪保种场提供的胎次和产仔日期相近的 70 日龄已阉割纯种高黎贡山猪 10 头(5,5),进
7、入实验期前使其适应周围环境,饲养 3 周后隔离,并对其进行体表驱虫和免疫。90 日龄进入实验期,在同一营养水平和饲养条件下饲养至 260 日龄。实验猪自由采食、饮水,饲料选择某公司全价配合饲料。1.1.2 主 要 试剂 与 仪 器 RNA 提 取 试 剂 盒(DP419)购自天根生化科技(北京)有限公司,逆转录试剂盒(GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2)和荧光定量试剂盒(2TsingKe Master qPCR Mix SYBRGreen I)购自北京擎科新业生物技术有限公司。仪器主要有荧光定量 PCR 仪(Bio-RadiCycler 型)、凝
8、胶成像系统(Tanon-1600 型)和梯度 PCR 仪(Veriti 型)。1.1.3 样品采集 饲养至 260 日龄(90 kg 左右)时随机屠宰 6 头高黎贡山猪(3,3),用无 RNA 酶的冻存管采集新鲜背最长肌、背脂、肝脏组织,随即放入液氮存于-80超低温冰箱中储存备用;采集 6 头猪的倒数第2、3根肋骨处的背最长肌(500 g)样品存放于-20冰箱中用于脂肪酸含量的检测。1.2 方法1.2.1 脂肪酸的测定 基于实验室前期所测的高黎贡山猪背最长肌脂肪酸含量12进行后续实验及分析,结果显示 6 头高黎贡山猪不饱和脂肪酸(UFA)的平均含量为 61.69%,其中单不饱和脂肪酸(MUFA
9、)含量为51.79%、多不饱和脂肪酸(PUFA)含量为 9.90%、饱和脂肪酸(SFA)含量为 38.31%。1.2.2 总 RNA 的提取及检测 按照试剂盒说明书分别提取 3 个组织样品的 RNA,用核酸蛋白检测仪检测浓度,1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。1.2.3 逆转录 按照北京擎科新业生物科技有限公司的逆转录试剂盒(GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2)提供的方法,反转录为 cDNA。1.2.4 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)参照 NCBI 收录的猪FABP1、FABP3及管家基因ACTB基因序列,用 Primer 5.0 软件完成
10、引物设计,并将引物交由昆明擎科生物科技有限公司进行合成,引物序列及 PCR 退火温度见表 1。参照北京擎科新业生物技术有限公司 2TsingKe Master qPCR Mix SYBRGreen I 试剂盒说明书提供的方法进行 RT-qPCR。20 L 反应体系为 2TsingKe Master qPCR Mix 10 L,Pimer F 和 Pimer R(10 mol/L)各0.8 L,Template DNA 2 L,ddH2O 6.4 L;RT-qPCR反应条件为FABP1、FABP3及管家基因在 95预变性1 min、95变性 10 s,FABP1在 58退火 10 s、FABP3
11、和ACTB在 55.5退火 10 s,3 个基因均在 72延伸10 s,40 个循环。1.3 统计分析 用 SPSS 23 软件t检验的 T-TEST 程序对实验数据资料进行显著性检验,实验数据以“平均数 标准误”表示;RT-qPCR 采用 2-Ct法进行基因的相对表达量分析;利用 SPSS 23 软件 CORR 程序对高黎贡山猪表观数据和表达量进行相关性分析。2 结果与分析2.1 FABP1、FABP3基因在高黎贡山猪 3 个组织中的相对表达量 RT-qPCR 分析结果显示,高黎贡山猪肝脏、背最长肌、背脂样品中FABP1、FABP3基因的相对表达量测定结果显示(表 2),FABP1基因在高黎
12、贡山猪 3 个组织中的表达趋势为:肝脏 背脂 背最长肌;FABP3基因在高黎贡山猪 3 个组织中的表达趋势为:背最长肌 肝脏 背脂。2.2 FABP1、FABP3基因表达量与脂肪酸含量相关分析 利用 SPSS 23 软件对FABP1、FABP3基因表达量与高黎贡山猪脂肪酸含量进行相关分析(表 3),FABP1基因在高黎贡山猪肝脏中的相对表达量与十九酸含量呈显著负相关,与其他脂肪酸无相关性,在背最长肌和背脂中与脂肪酸无相关性;FABP3基因在高黎贡山猪背最表 2 3 个组织中FABP1、FABP3基因的相对表达量表 1 引物序列及退火温度 基因引物序列(53)退火温度,Gen Bank 登录号F
13、ABP1F:GAACTCATCCAGAAGGGGAAG;R:TTGACCTTCTCCCCAGTCAG58.0NM_001004046.2FABP3F:AATTGGTGTGGGTTTTG;R:TGTCATCTGCTGTTGTCTCA55.5NM_001099931.1ACTBF:TCTGGCACCACACCTTCT;R:TGATCTGGGTCATCTTCTCAC55.5NM_205518.1组织FABP1FABP3肝脏6.2510-33.4510-45.6310-31.4410-4背最长肌1.2310-41.5810-43.9310-25.9210-3背脂1.0610-32.0910-47.96
14、10-48.2110-5-171-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 长肌中的相对表达量与二十二碳一烯酸含量呈显著正相关,与二十碳五烯酸呈极显著正相关,与其他脂肪酸无相关性,在肝脏和背脂中与脂肪酸无相关性。3 讨 论FABP1在肝脏中具有较高的表达水平,同时FABP1的结合特性和调节多种细胞过程(炎症、免疫、代谢和能量稳态)的功能也证明了FABP1的重要性13。在小鼠身上进行的基因敲除研究显示,当摄入高脂肪或高胆固醇食物时,对代谢调节和体重增加有显著影响14。FABP3在哺乳动物心脏和骨骼肌中高度表达,在胃、脑、肺和乳腺中表达程度较低
15、,对于脂肪酸转运、细胞生长、表 3 高黎贡山猪 3 个组织中FABP1、FABP3基因相对表达量与脂肪酸含量相关性分析项目相关性肝脏背最长肌背脂FABP1FABP3FABP1FABP3FABP1FABP3辛酸相关系数0.4900.134-0.3100.0960.1960.196显著性0.3230.8000.5490.8570.7090.709癸酸相关系数-0.2310.0260.161-0.381-0.074-0.074显著性0.6600.9610.7600.4560.8890.889十二酸(月桂酸)相关系数-0.6620.0110.029-0.470-0.114-0.114显著性0.1520
16、.9840.9570.3470.8300.830十四酸(肉豆蔻酸)相关系数-0.7000.1010.342-0.271-0.298-0.298显著性0.1210.8490.5080.6030.5660.566十五酸相关系数-0.374-0.0200.079-0.595-0.234-0.234显著性0.4650.9710.8820.2130.6560.656十六酸(软脂酸)相关系数-0.1610.6140.4200.501-0.692-0.692显著性0.7610.1950.4080.3120.1270.127十六碳一烯酸相关系数-0.169-0.2860.424-0.3160.2130.213
17、显著性0.7490.5830.4030.5410.6850.685十七酸(珠光脂酸)相关系数-0.470-0.152-0.270-0.716-0.008-0.008显著性0.3470.7740.6050.1090.9870.987十七碳一烯酸相关系数-0.479-0.1200.088-0.694-0.106-0.106显著性0.3360.8200.8690.1260.8410.841十八酸(硬脂酸)相关系数-0.1730.4720.121-0.121-0.686-0.686显著性0.7440.3450.8190.8190.1320.132十八碳一烯酸(油酸)相关系数0.224-0.3160.1
18、190.4080.4810.481显著性0.6700.5420.8230.4220.3340.334十八碳二烯酸(亚油酸)相关系数0.049-0.222-0.627-0.6120.2390.239显著性0.9270.6730.1830.1960.6480.648十九酸相关系数-0.851-0.5540.185-0.7210.2900.290显著性0.0320.2540.7260.1060.5770.577十八碳三烯酸(亚麻酸)相关系数0.016-0.204-0.673-0.7510.2470.247显著性0.9760.6980.1430.0850.6380.638二十酸(花生酸)相关系数-0.
19、1100.474-0.179-0.237-0.499-0.499显著性0.8360.3420.7340.6510.3140.314二十碳一烯酸相关系数-0.4420.254-0.330-0.318-0.289-0.289显著性0.3800.6280.5240.5390.5790.579二十碳二烯酸相关系数-0.114-0.198-0.515-0.6800.1400.140显著性0.8290.7070.2960.1370.7920.792二十碳三烯酸相关系数-0.395-0.348-0.238-0.8110.1770.177显著性0.4380.5000.6500.0500.7370.737-17
20、2-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期细胞信号转导和基因转录具有较重要作用15-16。目前,研究发现多个FABP3基因中的 SNP 位点与 IMF 含量存在显著相关性17-18。本实验通过研究FABP1、FABP3基因在高黎贡山猪 3 个组织中的相对表达量与脂肪酸含量的关系,以期初步探究高黎贡山猪的脂肪酸调控机制。实验结果显示高黎贡山猪FABP1基因在肝脏中表达量最高,在背脂中的表达量次之,表达量较少的是背最长肌。姜延志等19发现FABP1基因在大约克猪体组织中广泛存在,但在肝脏和小肠组织中表达量最为丰富;FABP3基因在高黎贡山猪 3
21、 个不同组织中的表达趋势为背最长肌 肝脏 背脂,与黄河等20得出的FABP3基因在藏猪背最长肌中表达最高的结论相一致,与曾勇庆等21发现FABP3基因在莱芜猪组织中的表达趋势(背最长肌 肝脏)的实验结果一致,说明FABP1、FABP3基因在不同猪种相同组织中的相对表达量趋势可能存在一致性。艾锦新等22采用 RT-qPCR 检测黔北麻羊FABP1和FABP3基因在不同组织表达量差异的研究中显示FABP1基因在肝脏组织中表达量最高,在皮下脂肪组织中表达量次之,在背最长肌组织中表达量最低,而FABP3基因在背最长肌中表达量最高,在脂肪组织中表达量次之,在肝脏组织中表达量最低,推测可能二者之间存在拮抗
22、作用,但本研究结果并未明显存在此现象。钱成23研究贵州白山羊FABP1和FABP3基因表达、多态性与生长性状的遗传效应发现,在贵州白山羊 9 个组织中FABP1基因在肝和十二指肠表达量较高,心和股二头肌表达量最低,与本实验结果FABP1在肝脏中表达量最高一致;FABP3基因在贵州白山羊的心和股二头肌表达量较高,其次是背最长肌,肝脏表注:显著性值小于 0.05 表示显著相关(P0.05),显著性值小于 0.01 表示极显著相关(P0.01)。项目相关性肝脏背最长肌背脂FABP1FABP3FABP1FABP3FABP1FABP3二十碳四烯酸相关系数0.3680.128-0.483-0.372-0.
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