miR-483-5p促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭.pdf

基础医学文章编号:1002-0217(2023)05-0414-05基金项目:国家自然科学基金项目(81802559);安徽省自然科学基金项目(1908085MH285)收稿日期:2023鄄02鄄23作者简介:程摇 超(1994鄄),男,2020 级硕士研究生,(电子信箱);李亚伟,男,副教授,(电子信箱)liyw87 ,通信作者。miR鄄483鄄5p 促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭程摇 超1,汪家伟1,王国伟1,汪摇 浩1,黄后宝1,李亚伟2(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院摇 泌尿外科,安徽摇芜湖摇 241001;2.中山大学附属第五医院摇泌尿外科,广东珠海摇 519000)揖摘摇 要铱目的:探讨 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌细胞中的生物学功能。方法:运用生物信息学分析 miR鄄483鄄5p 在多种癌症中的表达情况以及其在膀胱癌的诊断和预后预测中的作用。实时荧光定量 PCR(qRT鄄PCR)法检测膀胱癌组织、癌旁组织和膀胱癌细胞中 miR鄄483鄄5p 的表达情况以及前列环素合成酶(PTGIS)基因的转录水平。细胞计数试剂盒鄄8(CCK鄄8)和 5鄄乙基鄄20鄄脱氧尿苷(EdU)实验检测膀胱癌细胞的增殖能力。划痕和 Transwell 实验评估 miR鄄483鄄5p 对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。蛋白质印迹技术检测 PTGIS 蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因法验证 miR鄄483鄄5p 与 PTGIS 的靶向关系。结果:miR鄄483鄄5p 在6 种癌症中表达升高(P0郾 05),在 8 种癌症中表达下降(P0郾 05);miR鄄483鄄5p 在膀胱癌组织和细胞中表达升高(P0郾 01);miR鄄483鄄5p 预测膀胱癌结局有一定准确性(AUC=0郾 746,95%CI:0郾 660 0郾 833);miR鄄483鄄5p 高表达是膀胱癌患者预后的独立危险因素(HR=1郾 39,95%CI:1郾 03 1郾 87,P=0郾 032);miR鄄483鄄5p 抑制剂组膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降(P0郾 01);PTGIS 被确定为 miR鄄483鄄5p 的直接靶标;miR鄄483鄄5p 抑制剂组 EJ 和 T24 细胞中 PTGIS mRNA 和蛋白质表达升高(P0郾 01)。结论:本研究证实 miR鄄483鄄5p 作为癌基因通过靶向沉默 PTGIS 促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。miR鄄483鄄5p 可能成为膀胱癌潜在的治疗靶点和诊断预后标志物。揖关键词铱膀胱癌;miR鄄483鄄5p;增殖;转移;侵袭;生物标志物揖中图号铱R 737郾 14;R 329郾 2摇 摇 摇 揖文献标志码铱A揖DOI铱10郾 3969/j.issn.1002鄄0217.2023.05.002miR鄄483鄄5p promoting proliferation,migration and invasion of bladder cancer cellsCHENG Chao,WANG Jiawei,WANG Guowei,WANG Hao,HUANG Houbao,LI YaweiDepartment of Urology,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China揖Abstract铱Objective:To investigate the biological function of miR鄄483鄄5p in bladder cancer cells.Methods:In this study,we used bioinformatics toanalyze the expression of miR鄄483鄄5p in various cancers and its role in the diagnosis and predicting the prognosis of bladder cancer.qRT鄄PCR wasperformed to detect the expression of miR鄄483鄄5p in bladder cancer tissues,adjacent tissues and bladder cancer cells,as well as the transcript levels ofprostacyclin synthase(PTGIS).Cell proliferation in the bladder cancer tissues was measured using cell counting kit鄄8(CCK鄄8)and 5鄄ethynyl鄄20鄄deoxyuridine(EdU)assay.The impact of miR鄄483鄄5p on tumor cell migration and invasion was analyzed via scratch and transwell invasion assays.Aprotein blotting technique and a dual luciferase reporter gene assay were used to determine the protein expression of PTGIS and to validate the targetingrelationship between miR鄄483鄄5p and PTGIS respectively.Results:Bioinformatics results showed that miR鄄483鄄5p expression was up鄄regulated in 6 cancers(P0郾 05),yet decreased in 8 cancers(P0郾 05).miR鄄483鄄5p expression was significantly upregulated in bladder cancer tissues and cells(P0郾 01),suggesting that miR鄄483鄄5p had certain accuracy in predicting bladder cancer outcomes(AUC=0郾 746,95%CI:0郾 660-0郾 833).High miR鄄483鄄5pexpression was an independent risk factor for prognosis in patients with bladder cancer(HR=1郾 39,95%CI:1郾 03-1郾 87,P=0郾 032).Decreasedproliferation,migration and invasion of bladder cancer cell lines were seen in the group treated by miR鄄483鄄5p as inhibitor(P0郾 01).PTGIS,a tumorsuppressor gene in bladder cancer,was identified as a direct target of miR鄄483鄄5p.Significantly increased EJ expression in miR鄄483鄄5p inhibitor group andPTGIS mRNA and protein in T24 cells were observed as well(P0郾 01).Conclusion:This study confirms that miR鄄483鄄5p,as an oncogene,can promoteproliferation,migration and invasion of bladder cancer cell lines through targeted silencing of PTGIS,suggesting that miR鄄483鄄5p may serve as a promisingtherapeutic target and a diagnostic/prognostic marker for bladder cancer.揖Key words铱bladder cancer;miR鄄483鄄5p;proliferation;metastasis;invasion;biomarker414皖南医学院学报(Journal of Wannan Medical College)2023;42(5)摇 摇 膀胱癌是全球最常见的癌症之一。在中国,膀胱癌在泌尿系统肿瘤中的病死率和发病率最高1-2。与非肌层浸润性膀胱癌患者(70%)相比,肌层浸润性膀胱癌患者(30%)更易发生转移且预后较差3-4。即使肌层浸润性膀胱癌患者经过了最佳治疗,其 5 年总生存率也会因远处转移的影响而仅有 50%5。因此,阐明膀胱癌进展的分子机制对于开发更加有效的抗癌疗法具有重要的临床意义。微 RNA(MicroRNA,miRNA)的表达失调与多种癌症的发生有关6-7。研究表明,miRNA 可以作为潜在的治疗方法,包括使用 miRNA 模拟物进行miRNA 替代疗法或抗 miRNA 来抑制 miRNA 功能8,这些方法在临床上已经显示出很大的应用价值9。已有文献报道 miR鄄483鄄5p 参与多种肿瘤的发生和发展,如靶向 KCNQ1 促进食道癌进展10,靶向 DAPK1 降低鼻咽癌细胞的放射敏感性11,抑制miR鄄483鄄5p 可抑制三阴性乳腺癌细胞的进展和炎症反应12。miR鄄483鄄5p 在膀胱癌中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌发生、发展中的作用及其可能的分子机制。1摇 材料与方法1.1摇 组织样本摇本研究收集弋矶山医院泌尿外科就诊患者中 30 对膀胱癌组织及其对应的正常组织。所有参与者均签署知情同意书,并经皖南医学院弋矶山医院伦理委员会批准。1.2摇 细胞培养摇人膀胱癌细胞系(EJ 和 T24)在Gibco 公司的 RPMI 1640 完全培养基中培养,人正常尿路上皮细胞(SV鄄HUC鄄1)在 F鄄12K 完全培养基中培养。所有细胞系均在 37益、5%CO2培养条件下培养。1.3摇RNA 提取和实时荧光定量 PCR(quantitativereal鄄time PCR,qRT鄄PCR)摇 本研究采用 TRIzol 试剂(Invitrogen)从膀胱癌组织和细胞中提取总 RNA,然后使用 miRNA first鄄strand cDNA 试剂盒将提取的总RNA 反转录。接着,使用 PrimeScript miRNA RT鄄PCR 试剂盒合成 miRNA 的互补 DNA(complementa鄄ry DNA,cDNA),并使用 2-驻驻Ct方法计算基因的相对表达。miR鄄483鄄5p 和 PTGIS 引物均由锐博公司设计。1.4摇泛癌表达分析摇为了研究不同类型癌症的RNA 表达谱,本研究使用癌症基因组图谱(TheCancer Genome Atlas,TCGA)数据库(https:/),该数据库提供了 33 种肿瘤类型的 RNA测序数据(3 级)和相关临床信息。1.5摇 细胞转染摇 本研究使用的 miR鄄483鄄5p 抑制剂(inhibitor)和阴性对照(negative control,NC)寡核苷酸购自 RiBoBio(中国)。根据说明书,本研究在DMEM 培养基中使用 Lipofectamine 8000(Beyotime,中国)进行瞬时转染。1.6摇 细胞活力、增殖、迁移和侵袭试验摇本研究使用 BestBio 公司的细胞计数试剂盒鄄8(cell countingkit鄄8,CCK鄄8)检测细胞的活力。为了评估细胞的增殖能力,在转染 48 h 后,将低密度的细胞(20 000 个细胞/板)接种在 96 孔板中,然后根据 5鄄乙基鄄20鄄脱氧尿苷(5鄄ethynyl鄄20鄄deoxyuridine,EdU)试剂盒(Ri鄄boBio,中国)说明书进行下一步实验。在侵袭试验中,将 5伊104个转染 miR鄄483鄄5p 抑制剂的膀胱癌细胞在涂有 Matrigel(BD Bioscience,美国)的上腔中接种,随后在下层补充 500 滋L 含有 10%FBS 的培养基,并在下层孔中培养 24 h。在评估细胞侵袭能力时,在 3 个随机区域进行细胞计数。1.7摇 双荧光素酶报告摇 基因检测 EJ 和 T24 细胞与miR鄄483鄄5p 模拟物和含有前列环素合成酶(prosta鄄cyclin synthase,PTGIS)野生型(Wild鄄type,wt)或 PT鄄GIS 突变型(Mutant,mut)3忆鄄UTR 的荧光素酶报告载体(GenePharma,中国)通过 lipofectamine 8000 进行共转染。转染 6 h 后更换培养基,孵化 36 h 后裂解细胞。最后检测荧光素酶活性。1.8摇 蛋白质印记技术摇在细胞中加入含有通用蛋白酶抑制剂(Beyotime,中国)的 RIPA 缓冲液(Beyo鄄time,中国)。然后,用离心法获得总蛋白,BCA 法(Beyotime,中国)测定总蛋白浓度。电泳后,将总蛋白转移到厚度为 0郾 45 mm 的 PVDF 膜上。随后将PVDF 膜置于阻断液中 1 h,然后将膜与 PTGIS(1颐5 000,Abcam,英国)和 GAPDH 抗体(1颐5 000,Affin鄄ity,美国)在 4益 下培养过夜。随后,将膜浸泡在二抗(Bosterbio,美国)中 1 h。最后使用 ChemiDocTouch 系统(Bio鄄Rad,美国)曝光所有的条带。1.9摇 统计学方法摇采用 R 语言 4.0.3、SPSS 26.0和 GraphPad Prism 7.0 软件进行数据分析。计量资料采用軃x依s 表示,两组间采用 t 检验或秩和检验;多组间采用 F 检验。受试者工作特征(receiver operat鄄ing characteristic,ROC)曲线用于分析 miR鄄483鄄5p 表达是否可以作为诊断标志物。P0郾 05 为差异有统计学意义。2摇 结果2.1摇 miR鄄483鄄5p 在泛癌中的表达摇基于 TCGA 数据库,本研究评估了 miR鄄483鄄5p 在不同癌症组织中514皖南医学院学报(Journal of Wannan Medical College)2023;42(5)的表 达 情 况。结 果 显 示,在 膀 胱 尿 路 上 皮 癌(BLCA)、结 肠 癌(COAD)、头 颈 鳞 状 细 胞 癌(HNSC)、食管癌(ESCA)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)以及胃腺癌(STAD)中,miR鄄483鄄5p 的表达升高(P0郾 05,见图 1);在乳腺浸润癌(BRCA)、肝细胞肝癌(LIHC)、胆管癌(CHOL)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、甲状腺癌(THCA)以及子宫内膜癌(UCEC)中,miR鄄483鄄5p 的表达下降(P0郾 05,见图1)。miR鄄483鄄5p 在 32 种癌症中的表达数据,红色代表癌组织,蓝色代表正常组织。*P0郾 05,*P0郾 01,*P0郾 001。图 1摇 miR鄄483鄄5p 在泛癌中的表达2.2摇miR鄄483鄄5p 在膀胱癌组织和细胞中的表达水平摇 本研究采用 qRT鄄PCR 检测了 30 对膀胱癌样本中 miR鄄483鄄5p 的表达水平,并与相应的癌旁组织进行比较。结果表明,与膀胱癌癌旁组织相比,miR鄄483鄄5p 的表达升高(t=-4郾 782,P0郾 01;图 2A)。与 SV鄄HUC鄄1 细胞相比,EJ 和 T24 细胞中 miR鄄483鄄5p 的表达水平升高(F=23郾 233,P0郾 01;图 2B)。A.miR鄄483鄄5p 在膀胱癌及癌旁组织中的表达水平;B.miR鄄483鄄5p 在膀胱癌细胞中的表达水平。*P0郾 01。图 2摇 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌组织和细胞中的表达水平2.3摇miR鄄483鄄5p 在膀胱癌中的诊断价值与预后意义摇ROC 曲线显示,在预测膀胱癌结局方面,miR鄄483鄄5p 的预测能力有一定准确性(AUC=0郾 746,95%CI:0郾 660 0郾 833;图 3A)。通过 Kaplan鄄MeierPlotter(http:/ miR鄄483鄄5p 的患者预后更差,miR鄄483鄄5p 高表达是膀胱癌患者预后的独立危险因素(HR=1郾 39,95%CI:1郾 03 1郾 87,P=0郾 032;图 3B)。A.ROC 曲线验证 miR鄄483鄄5p 对膀胱癌的诊断性能;B.Kaplan鄄Meier分析 miR鄄483鄄5p 表达与膀胱癌总生存期之间的关联。图 3摇 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌中的诊断价值与预后意义2.4摇miR鄄483鄄5p 的下调抑制了膀胱癌细胞的增殖摇 我们检测了 miR鄄483鄄5p 抑制剂(miR鄄483鄄5p in鄄hibitor)的转染效率,结果显示转染后 EJ 和 T24 细胞表达 miR鄄483鄄5p 的水平降低(t=6郾 059、6郾 632,P0郾 01;图4A)。CCK鄄8 实验结果表明,与 miR鄄483鄄5p对照(inhibitor NC)组相比,miR鄄483鄄5p inhibitor 组的 EJ 和 T24 细胞活力下降(t=7郾 593、7郾 461,P0郾 01;图 4B、C)。EdU 实验表明,与 inhibitor NC 组相比,miR鄄483鄄5p inhibitor 组的 EJ 和 T24 细胞增殖能力下降(t=7郾 923、6郾 694,均 P0郾 01;图 4D G)。A.miR鄄483鄄5p 抑制剂的转染效率;B、C.CCK鄄8 实验显示膀胱癌细胞的活力;D G.EdU 实验显示膀胱癌细胞的增殖能力。*P0郾 01。图 4摇 miR鄄483鄄5p 的下调抑制了膀胱癌细胞的增殖2.5摇miR鄄483鄄5p 的下调抑制了膀胱癌细胞的迁移和侵袭摇划痕实验结果表明,与 inhibitor NC 组相比,miR鄄483鄄5p inhibitor 组 EJ 和 T24 细胞迁移率下降(t=15郾 232、11郾 565,P0郾 01;图 5A、B)。Tran鄄swell 侵袭实验显示,与 inhibitor NC 组相比,miR鄄483鄄5p inhibitor 组的 EJ 和 T24 细胞进入下室的细胞量下降(t=15郾 384、24郾 333,P0郾 01;图 5C、D)。2.6摇 PTGIS 是 miR鄄483鄄5p 的靶标摇 为了寻找 miR鄄483鄄5p 的潜在下游靶标,本研究使用 TargetScan(ht鄄tp:/www.targetscan.org/vert _71/)、ENCORI(ht鄄614皖南医学院学报(Journal of Wannan Medical College)2023;42(5)tp:/ miRwalk(http:/www.ma.uni鄄heidelberg.de/apps/zmf/miRwalk/)miRNA 数据库并与膀胱癌 GSE52519 数据集中表达下降的基因(P0郾 05,logFC-2)取交集。PTGIS 是交集中的一个基因(图 6A)。图 6B 显示了 PTGISmRNA 与 miR鄄483鄄5p 的结合位点和突变位点。我们观察到与模拟物鄄NC(mimics鄄NC)相比,含有 PT鄄GIS鄄wt 的荧光素酶报告载体与 miR鄄483鄄5p 模拟物(miR鄄483鄄5p鄄mimics)共转染会明显降低 PTGIS鄄wt载体的荧光素酶活性,而转染 miR鄄483鄄5p 模拟物后的细胞中含有 PTGIS鄄mut 的荧光素酶活性没有受到影响(t=6郾 797、11郾 567,P0郾 01;图 6C、D)。与 in鄄hibitor NC 组相比,miR鄄483鄄5p inhibitor 明显提高了EJ 和 T24 细胞中 PTGIS mRNA 的表达水平(t=12郾 723、14郾 747,P0郾 01;图 6E)。PTGIS 蛋白的表达水平在 miR鄄483鄄5p 表达受到抑制后也上升(t=17郾 537、12郾 926,P0郾 01;图 6F)。A、B.划痕实验显示膀胱癌细胞迁移能力;C、D.Transwell 侵袭实验显示膀胱癌细胞的侵袭能力。*P0郾 01。图 5摇 miR鄄483鄄5p 的下调抑制了膀胱癌细胞的迁移和侵袭A.PTGIS 由 TargetScan、ENCORI 和 mirwalk 数据库结合 GSE52519 数据集筛选出来。图中的 4 个椭圆分别代表 TargetScan、ENCORI 和mirwalk 数据库以及 GSE52519 数据集的预测结果;B.miR鄄483鄄5p 与PTGIS 结合点的生物信息学预测;C、D.双荧光素酶实验显示,miR鄄483鄄5p 降低了 PTGIS鄄wt 荧光素酶报告基因的荧光素酶活性(*P0郾 01);E、F.在被 miR鄄483鄄5p 抑制剂转染的 EJ 和 T24 细胞中,PTGISmRNA(E)和蛋白(F)表达上升(*P0郾 01)。图 6摇 PTGIS 是 miR鄄483鄄5p 的靶标3摇 讨论miRNA 是一种单链非编码 RNA 分子,其长度通常为18 25 个碱基,通过与基因编码序列或3忆非翻译区(3忆UTR)结合来调节基因的表达13。多项研究表明,miRNA 在细胞的增殖、迁移和其他重要的细胞过程中发挥了至关重要的作用14。在肿瘤学领域中,因为 miRNA 被认为是潜在的癌症生物标志物和治疗靶点,所以 miRNA 一直是研究的热点之一15-16。Wang 等发现 miR鄄483鄄5p 下调有助于肾透明细胞癌的细胞增殖、转移和炎症17,Agosta 等发现 miR鄄483鄄5p 通过靶向 N鄄myc 来促进肾上腺皮质癌中的侵袭性18。然而,迄今为止,还未有研究报道 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌中的表达与生物学功能。本研究中,我们进行了生物信息学分析,研究了TCGA 数据库中 miR鄄483鄄5p 在泛癌中的表达情况。结果显示,miR鄄483鄄5p 在6 种癌症中的表达升高,而在另外 8 种癌症中,miR鄄483鄄5p 的表达下降。这表明 miR鄄483鄄5p 在癌症中可能具有双重作用。已有的多项研究与我们的预测结果一致10,17,19-20,证明了我们预测结果的可靠性。qRT鄄PCR 检测的结果表明,miR鄄483鄄5p 在膀胱癌组织和细胞中均高表达,这提示 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌中扮演着癌基因的角色。为了探讨 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌中的诊断价值和预后意义,我们对 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌诊断中的 AUC 及其表达与膀胱癌患者 5 年生存率的关系进行了研究。本研究结果表明,miR鄄483鄄5p 在预测膀胱癌结局方面具有一定的准确性。此外,我们发现 miR鄄483鄄5p 表达水平的升高提示膀胱癌预后不良。这些发现表明 miR鄄483鄄5p 可能成为膀胱癌诊断和预后的重要标志物。我们还进行了体外实验来探究 miR鄄483鄄5p 的生物学功能,结果表明,当 miR鄄483鄄5p 的表达受到抑制时,膀胱癌细胞 EJ 和 T24 的增殖、迁移和侵袭显著受到抑制。这表明 miR鄄483鄄5p 在膀胱癌的发展中具有促进作用,并且可能成为肿瘤治疗靶点。研究发现 PTGIS 在膀胱癌组织中显著下调,PT鄄GIS 过表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移21。本研究证实 miR鄄483鄄5p 可以直接靶向 PTGIS,并且调节 PTGIS mRNA 和蛋白的水平。基于这些结果,可以推测 miR鄄483鄄5p 可能通过直接抑制 PTGIS 的表达在膀胱癌中发挥致癌作用。综上所述,miR鄄483鄄5p 在膀胱癌组织和细胞中的表达上调,抑制 miR鄄483鄄5p 可以抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭,miR鄄483鄄5p 可以负向调节 PT鄄GIS。这些发现为膀胱癌的诊断和治疗提供了新的714皖南医学院学报(Journal of Wannan Medical College)2023;42(5)治疗靶点和治疗策略。揖参考文献铱1摇SIEGEL RL,MILLER KD,WAGLE NS,et al.Cancer statistics,2023J.CA Cancer J Clin,2023,73(1):17-48.2摇 CHEN W,ZHENG R,BAADE PD,et al.Cancer statistics in Chi鄄na,2015J.CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.3摇 LOKESHWAR SD,LOPEZ M,SARCAN S,et al.Molecular oncolo鄄gy of bladder cancer from inception to modern perspectiveJ.Cancers(Basel),2022,14(11):2578.4摇 DETTLAFF K,STAWNY M,OGRODOWCZYK M,et al.Formula鄄tion and characterization of EGCG for the treatment of superficialbladder cancerJ.Int J Mol Med,2017,40(2):329-336.5摇 ALFRED WITJES J,LEBRET T,COMPERAT EM,et al.Updated2016 EAU guidelines on muscle鄄invasive and metastatic bladdercancerJ.Eur Urol,2017,71(3):462-475.6摇LEE E,COLLAZO鄄LORDUY A,CASTILLO鄄MARTIN M,et 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