miR-100-5p调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT进程.pdf

现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.224123miR-100-5p调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭及 EMT进程魏微微，高圣钰，孟凡石佳木斯大学附属第一医院普外科，黑龙江佳木斯1540 0 2【摘要】目的：探讨miR-100-5p对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT)进程的影响。方法：通过GEO数据库下的miRNA微阵列数据集（GSE104006、G SE7 318 2、G SE15118 0），选取变化倍数Ilog2FoldChange(FC)|1和adj.P.Val1and adj.P.Val 1,P1和adj.P.Val0.05的miRNA进行交集获得交叉miRNA。通过 R语言对 TCGA-THCA miRNA数据库进行差异分析以及在线数据库ENCORI双向验证交集miRNA的表魏微微，等miR-100-5p调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT进程达趋势。1.2细胞培养人正常甲状腺细胞系Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1购买于北京北纳生物技术有限公司。甲状腺乳头状癌细胞系B-CPAP购自中国上海细胞典藏中心。Nt-hy-ori3-1和TPC-1生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,B-CPAP细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37、5%C0，和饱和湿度条件下培养。两天换液一次，当细胞生长至8 0%9 0%密度时，用0.2 5%胰蛋白酶消化传代。1.3细胞转染miR-100-5p模拟物（mimics-100-5p）、阴性对照模拟物(mimics-NC)、m i R-10 0-5p 抑制剂(inhibitor-100-5p）、阴性对照抑制物（inhibitorNC）均已采购来自上海生工生物技术有限公司。按照操作说明，使用Lipofectaminerm2000试剂盒（Invitrogen,Carlsbad,USA)将模拟物、抑制剂以及对应的对照组 NC 转染到 TC 细胞系 TPC-1 中。转染后24小时将细胞用于进一步实验。1.4实时聚合酶链反应Trizol试剂（碧云天，中国上海）用于提取总RNA。miRNA第一链cDNA合成试剂盒（加尾法）（中国上海生工）用于将miRNA还原为cDNA。m iRNA 荧光定量PCR试剂盒（染料法）（中国上海生工）用于测量miRNA的表达水平。U6作为miR-1005p 的内部参数。引物序列见表1。2-AAC值用于评估miR-100-5p的相对表达水平。表 1qRT-PCR引物序列Tab.1qRT-PCR primer sequencesmiRNASequence(5-3)miR-100-5pCCAACCCGTAGATCCGAACTTGTGU6TCGCTTCGGCAGCACATATAC1.5Edu增殖实验Edu测定使用Cell LightTM Edu试剂盒（RiboBio,广州,中国)进行。将2 10 4个细胞接种在2 4孔板的每个孔中。转染48 小时后,向培养基中补充50 mol/LEdu再培养2 小时。细胞用4%甲醛固定30 分钟,并用甘氨酸(2 mg/mL)孵育10 分钟。然后将细胞用0.5%TritonX-100透化2 0 分钟，然后加人Hoechst33342。然后通过荧光显微镜（奥林巴斯，CKX41,日本)测定细胞增殖（Edu阳性细胞的百分比）。1.6划痕愈合实验使用6 孔板进行细胞接种,转染相关miR-100-5p模拟物、抑制剂后2 4小时。当细胞的整体覆盖率达到8 0%时，用2 0 0 L移液器的尖端轻轻刮下单层细胞,PBS洗涤一次，Sequence(3-5)GCGTGTCATCCTTGCGCAGGCGTGTCATCCTTGCGCAG现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期拍照记录为0 小时，标记拍照点。2 4小时后，选取统一区域观察细胞迁移情况，拍照记为2 4小时，选取5个区域进行计算。1.7蛋白印迹实验放射免疫沉淀测定裂解缓冲液（Beyotime,中国）用于提取细胞裂解物。通过BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime,中国）定量，通过12%SDS-PACE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封膜2 小时；然后，将其与一抗在4下孵育过夜。接下来,用含吐温的磷酸盐缓冲盐水冲洗膜,并在室温下与二抗一起培养2 小时。最终，增强型化学发光（ECL)试剂盒（CEHealthcare，美国）用于检测蛋白质信号。一抗 MMP-9(1:1 000)、E=c a d(1:1 0 0 0)、VIM(1:1 0 0 0)、GAPDH(1:10 000)。二抗(美国 Abcam,1:5 000稀释)。1.8细胞迁移实验用胰蛋白酶(来自Gibco)消化细胞,将细胞浓度调节至约2 10/mL,然后将它们接种到Transwell 孔（来自Cor-ning)中。上孔加人10 0 L TPC-1细胞悬液，下孔加人50 0L培养基（含10%FBS)。孵育2 4小时,取出孔用PBS溶液冲洗2 次，然后用4%多聚甲醛固定15分钟，最后用结晶紫溶液染色。Transwell板干燥后，倒置显微镜（奥林巴斯，CKX41,日本）,随机选择5个视野拍照，统计每个视野中滤膜下侵袭的细胞数。GfoupNon tumorTumor0-2-4MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.221.9细胞侵袭试验使用2 4孔Transwell 室（8 m孔径,BDBiosciences）来检测癌细胞的迁移能力和侵袭性。在涂有Matrigel胶的上室接种2 10 4个细胞。下室加入含10%FBS的培养基。48 小时后，将侵人的细胞用甲醇固定并用0.1%结晶紫染色。倒置显微镜（奥林巴斯,CKX41,日本）下拍照,计数。1.10 统计学分析使用 GraphPad Prism 8.0软件（GraphPad Software,Inc.)和SPSS22.0软件(IBM Corp.）进行统计分析。所有数据均以3次实验重复的平均值标准差表示。使用未配对的学生t检验分析组间的统计差异。P1和P 1 和 adj.P.Val0.05的miRNA进行交集，绘制韦恩图（图2 A）。三个数据库共同交集于miR10 0 5p。T C G A-T H C A 和ENCORI数据库验证miR-100-5p在 PTC 组织中的表达趋AGSE151180624miR-100-5pGSE104006A：差异表达miRNA交集韦恩图;B和C:通过在线数据库TCGA-THCA和ENCORI数据库验证miR-100-5p的表达趋势。A:Venn diagram of differentially expressed miRNA intersections.B and C:The expression trend of miR-100-5p was verified by TCGA-THCA andENCORI data from online databases:2.3miR-100-5p在甲状腺乳头状癌细胞中低表达qRT-PCR检测发现与人正常甲状腺细胞系Nthy-ori3-1 相比,miR-100-5p 在 PTC 细胞系 TPC-1 和 B-CPAP中表达趋势显著降低（图3A,P0.05）。由于miR-100-5p在 TPC-1中表达最低,我们选择 TPC-1进行接下来的实验。为了研究 miR-100-5p对PTC 细胞功能的影响,我们使用LipofectamineTM2000试剂盒将miR-100-5p模拟物（m i m i c s-10 0-5p）、阴性对照模拟物（mimics-NC）、m i R-100-5p抑制剂（inhibitor-100-5p）、阴性对照抑制物（in-hibitor-NC)分别转入 PTC 细胞系 TPC-1,qRT-PCR 检测显示转染效率（图3B,P0.05）。A1.51.00.50.01-1o-CPANthy-图3miR-100-5p在PTC细胞中的表达趋势A:miR-100-5p在PTC细胞中的表达趋势;B:过表达或敲低miR-100-5p后的表达趋势；*P0.01,*P0.001。Fig.3Expression trend of miR-100-5p in PTC cellsA:Expression trend of miR-100-5p in PTC cells.B:Expressiontrend of miR-100-5 p after overexpression or knockdown.*P0.01,*P0.001.2.4过表达 miR-100-5p抑制 TPC-1 细胞的增殖Edu实验表明与各自的对照组相比较,转染mimics=魏微微，等BGSE7318217.5-000Fig.2miR-100-5p is lowly expressed in the PTC tissues*B*mimics-mimics-Ninhibitor-100-5pmiR-100-5p调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT进程势,结果显示miR-100-5p在两种数据库PTC 组织中均低表达(图2 B-C),差异有统计学意义（P0.05）。综上所述,我们认为miR10 0 5p 可能是影响PTC的关键miRNA之一。Chsa-miR-100-5pwith509cancerand58normalDataSource:starBasev3.0 project18P=1.63e-1016-1OO+Nda15.012.510.0NTPPTC(n=57)(n=501)图2 miR-100-5p在PTC组织中低表达6-425-100-3inhibitor-Nsamples inTHCAP0.05121086Cancerlog2(RPM)-BoxplotGeneexpressions100-5p组TPC-1细胞增殖率显著降低,而转染了 inhibitor-100-5p的 TPC-1细胞增殖率与之相反（图4）。为了进一步研究 miR-100-5p对 TPC-1细胞增殖的影响。我们进行了平板克隆实验，实验表明与对照组相比，转染了mim-ics-100-5p的TPC-1细胞的细胞克隆形成数明显减少，而转染了inhibitor-100-5p的TPC-1细胞的细胞克隆数较对照组显著增多(图5)。综上所述,过表达miR-100-5p可以明显抑制TPC-1 细胞的增殖能力。2.5miR-100-5p对 TPC-1细胞迁移、侵袭的影响如图6 A所示,与对照组相比,转染mimics-100-5p的TPC-1细胞的划痕愈合率明显降低（P0.05）,而转染了inhibitor-100-5p的TPC1细胞的划痕愈合率显著增高（P 0.0 5）。T r a n s w e ll 迁移实验结果与划痕愈合实验结果一致(图6 B,P0.05)。此外,为了验证miR-100-5p对TPC-1细胞侵袭的影响，我们通过Transwell侵袭实验发现，与对照组相比,转染 mimics-100-5p 的 TPC-1 侵袭能力明*显降低（P0.05）,而转染inhibitor-100-5p的TPC-1细胞侵袭能力显著增强（图6 B,P0.05)。2.6 miR-100-5p对TPC-1细胞EMT进程的影响为了研究miR-100-5p是否参与癌细胞上皮间质转化(EMT)进程,我们进行了蛋白印迹实验。结果显示与各自对照组相比,转染mimics-100-5p的 MMP-9、V I M 蛋白表达水平显著降低,而E-cad蛋白的表达水平明显增加,相反的是inhibitor-100-5p组的MMP-9、V I M 蛋白表达水平明显增加,而E-cad蛋白表达水平明显降低（图7,P0.05）。综上所述,miR-100-5p参与PTC的上皮间质转化。3讨论甲状腺乳头状癌(PTC)是所有甲状腺癌中最常见的病理亚型。微小RNA(miRNA)已成为基础和转化生物医学研究的一个有趣领域，它的主要作用是参与癌症转录后的基因调控2 0-2 1。先前的研究表明过表达miR-100-5p 可以通Nomallog2(RPM)0.8工现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期过CDC25A抑制乳腺癌(BC)细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡14。在胃腺瘤（STAD)中,WANG 等2 研究表HoechstEduMergeMODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.22明miR-100-5p在STAD 临床组织和细胞中低表达,miR-100-5p与 STAD 的化疗和免疫治疗的敏感性显著相关。mimics-NCmimics-100-5p.4127.inhibitor-NCinhibitor-100-5p*0.60.40.20.0ON-soruu-5PC-100-5p图4过表达或敲低miR-100-5p对 TPC-1 细胞增殖的影响（10 0)（*P0.05，*P 0.0 1)Fig.4 Effects of overexpression or knockdown of miR-100-5p on the proliferation of TPC-1 cells(100)(*P0.05,*P0.01)mimics-NCmimics-100-5pinhibitor-NCinhibitor-100-5p2015*士-5PNC图5过表达或敲低miR-100-5p对TPC-1平板克隆的影响（*P0.05，*P 0.0 1)Fig.5Influence of overexpression or knockdown of miR-100-5p on TPC-1 tablet cloning(*P0.05,*P0.01)0.87Amimics-NCmimics-100-5pinhibitor-NC inhibitor-100-5poh24h*0.6-*0.4士0.20.0工.5P-100-5inhibitor-1Bmimics-NC mimics-100-5p inhibitor-NC inhibitor-100-5p200150*10050-0C5100-600-400*200-+0ibititor-*图6 miR-100-5p对 TPC-1 细胞迁移及侵袭的影响A:过表达或敲低对TPC-1细胞迁移的影响（2 0 0);B:过表达或敲低对TPC-1细胞迁移及侵袭的影响（结晶紫染色2 0 0)；*P0.05,*P0.001,*P0.0001。Fig.6 Effects of miR-100-5p on migration and invasion of TPC-1 cellsA:Effects of overexpression or knockdown on migration of TPC-1 cells(200).B:Effects of overexpression or knockdown on migration and invasionof TPC-1 cells(Crystal violet staining 200).*P0.05,*P0.001,*P0.000 1.:4128 魏微微，等miR-100-5p调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT进程1.5mimics-NC+mimics-100-5p+一+inhibitor-NC+inhibitor-10o-5p110kDaMMP-9110kDaE-cadVIMGAPDH图7 miR-100-5p影响TPC-1细胞的EMT进程（*P0.05，*P 0.0 1)Fig.7 miR-100-5p affects EMT progression in TPC-1 cells(*P0.05,*P0.01)众所周知，上皮间质转化（EMT)与癌症的广泛恶性行为有关,包括增殖、侵袭和转移。越来越多的证据表明,miRNA通过 EMT参与癌症的转移2 3。NAN等10 研究表明miR-451可以通过在体外和体内靶向CAB39从而减少神经胶质瘤细胞的EMT和转移。在甲状腺乳头状癌中，目前的研究并未详细阐述miR-100-5p对甲状腺乳头状癌上皮间质转化的具体机制。本研究在一定程度上扩展了对miR-100-5p的认识。研究证实了miR-100-5p在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中表达下调。过表达或敲低miR-100-5p可以抑制或促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及EMT相关蛋白的表达水平。MMP-9是研究最广泛的基质金属蛋白酶(MMP)之一,MMP-9是一种重要的蛋白酶,在许多生物过程中起着至关重要的作用，包括癌细胞侵袭和肿瘤转移2 4-2 。E-cad和VIM是上皮间质转化进程的标志物,E-cad的失活以及VIM的异常激活被认为是EMT发生的标志物。目前的研究表明miR-100-5p可以参与脊索瘤的EMT进程12 。然而,在甲状腺乳头状癌中miR-100-5p对 EMT的作用尚未完全阐明。为了研究 miR-100-5p与甲状腺乳头状癌EMT和肿瘤转移的关系,本研究通过生物信息学确定miR-100-5p可能是PTC中的关键调节因子之一。qRT-PCR和在线数据库验证miR-100-5p在PTC 组织和细胞中表达水平降低。过表达miR-100-5p后 TPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭明显受到抑制,而敲低miR-100-5p则逆转了这一现象。此外,过表达miR10 0-5p 后MMP.-9、V I M 蛋白的表达趋势明显受到抑制,而E-cad蛋白的表达趋势明显得到增强,相反的是敲低miR-100-5p后E-cad蛋白的表达趋势明显下降,而MMP-9和VIM的蛋白表达趋势明显上升。以上说明miR-100-5p与EMT相关蛋白的表达水平密切相关。miR-100-5p可能通过EMT影响PTC转移。综上所述,我们推测miR-100-5p负调控 PTC 细胞的增殖、迁移和侵袭。过表达miR-100-5p可以抑制甲状腺乳头状癌的肿瘤发生和转移。这些有助于开发甲状腺乳头状癌的新型生物标志物和治疗靶点。总之,我们在本研究中证明了过表达或敲低miR-100-5p对甲状腺乳头状癌EMT、增殖、迁移、侵袭的影响。【参考文献】1 HUO N,CONG R,SUN ZJ,et al.STAT3/LINC00671 axis regulatespapillary thyroid tumor growth and metastasis via LDHA-mediatedglycolysis J.Cell Death Dis,2021,12(9):799-801.Imimics-NCmimics-100-5pinhibitor-NC*inhibitor-100-5p*工0.555kDa36kDa0.02 COCA-PELAZ A,SHAH JP,HERNANDEZ-PRERA JC,et al.Papillary thyroid cancer-aggressive variants and impact on man-agement:A narrative review J.Adv Ther,2020,37(7):3112-3116.3ARYANPOUR Z,ASBAN A,BOYD C,et al.A single institutionexperience with papillary thyroid cancer:Are outcomes better atcomprehensive cancer centersJ.Am J Surg,2021,222(4):802-805.4 DONG S,XUE S,SUN Y,et al.MicroRNA-363-3p downregula-tion in papillary thyroid cancer inhibits tumor progression by targe-ting NOB1J.J Investig Med,2021,69(1):66-74.5ALI SYEDA Z,LANGDEN SSS,MUNKHZUL C,et al.Regulatorymechanism of microRNA expression in cancer J.Int J Mol Sci,2020,21(5):45 48.6HE B,ZHAO Z,CAI Q,et al.miRNA-based biomarkers,thera-pies,and resistance in cancer J.Int J Biol Sci,2020,16(14):2628-2632.7PAN G,LIU Y,SHANG L,et al.EMT-associated microRNAs andtheir roles in cancer stemness and drug resistance J.Cancer Com-mun(Lond),2021,41(3):199-217.8SHI Y,LIU Z,LIN Q,et al.MiRNAs and cancer:Key link in diag-nosis and therapyJ.Genes(Basel),2021,12(8):45-50.9CHEN Y,MIN L,REN C,et al.miRNA-148a serves as a prognos-tic factor and suppresses migration and invasion through Wntl innon-small cell lung cancer J.PLoS One,2017,12(2):171-251.10NAN Y,GUO L,LU Y,et al.miR-451 suppresses EMT and me-tastasis in glioma cells J.Cell Cycle,2021,20(13):1270-1278.11DOU R,LIU K,YANG C,et al.EMT-cancer cells-derived exo-somal miR-27b-3p promotes circulating tumour cells-media-ted metastasis by modulating vascular permeability in colorectalcancerJ.Clin Transl Med,2021,11(12):595-603.12ZHANG H,YANG K,REN T,et al.miR-100-5p inhibits ma-lignant behavior of chordoma cells by targeting IGF1R J.CancerManag Res,2020,12(2):4129-4132.13 YE Y,LI SL,WANG JJ.miR-100-5p downregulates mTOR tosuppress the proliferation,migration,and invasion of prostate canc-er 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Y217）；云南省昆明市卫生科技人才培养项目编号：2 0 2 0 SW（后备）12 0】；云南省昆明市卫生科研课题（编号：2 0 2 2-0 6-0 2-0 0 2）【作者简介】刘艳艳（19 9 5一），女，安徽人，医师，主要从事抗肿瘤药物基础研究。E-mail:【通信作者】万成亮（19 8 0 一），男，湖北人，副主任医师，主要从事儿童肿瘤外科的临床及基础研究。E-mail：w a n c L8 0 16 3.c o m