IFITM1基因多态性对儿童流感发病风险和病情严重程度影响的研究.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 8 IFITM1 基因多态性对儿童流感发病风险和病情严重程度影响的研究 卫严冰1 罗雪峰1 何志伟1 安 亮2（通讯作者）1.中国人民大学统计学院流行病与卫生统计院，北京 100080 2.上海市孟超肿瘤医院，上海 200000 摘要：摘要：目的 探讨干扰素诱导跨膜蛋白 1（IFITM1）基因多态性对儿童流感发病风险和病情严重程度之间的关系。方法 选择来我院治疗的 98 例流感患儿和 110 例健康儿童。通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）来分析 IFITM1 基因 3 个不同区域的多态性位点（rs77537847、rs11246062 和 rs3197137）。使用 SHEsis在线网站分析 IFITM1 基因 3 个位点的哈德温伯格平衡（HWE）。以流感类型和病情严重程度为条件，进行亚型分析。结果 与对照组相比，rs77537847 位点的 GG 基因型频率和 G 等位基因频率在流感患儿中明显较高（P0.05）。在亚组分析中，发现 rs77537847 的基因型频率分布与患儿流感类型无关（P0.05）。但该位点的 GG 基因型与更重的病情程度有关（P0.05）。结论 IFITM1 基因 rs77537847 位点的 GG 基因型与儿童较高的流感感染率有关，并预示着更严重的流感病情。这可能为将来筛查流感易感及重症人群提供了潜在标志物。关键词：关键词：流感；IFITM1；基因多态性；易感性；病情程度 中图分类号：中图分类号：R725 流行性感冒在日常中被成为流感，其是一种通过飞沫或人与人密切接触传播的传染性呼吸道疾病。季节性流感每年在全世界会造成约 10 亿例病例，其中包括300万至500万例重症病例和29万至65万例死亡。流感是一个重大的公共卫生问题，经常给患者及其家属带来经济负担，其中由于 5 岁及以下儿童免疫系统尚未发育完全经常被视为重症流感的易感人群之一1。包括年龄、潜在合并症和妊娠均在公共卫生预防中被定为可能会影响流感易感性和重症流感的原因。即便如此儿童流行性感冒的进展机制仍未被完全阐明。宿主对病毒感染的内在易感性在决定不同个体的易感和感染严重程度方面起着重要作用。在人类流感病毒感染方面，多项遗传关联研究已经确定了可能有助于增强人类对流感易感性或抵抗力的特定基因2,3。有研究发现酸性核磷蛋白 32 家族 B（ANP32B）的基因突变体与流感病毒的发病风险密切相关而且会调节流感病毒在人类细胞中的复制2。尹莹等人发现白细胞分化抗原 226（CD226）基因的 rs727088 位点多态性与增加小儿流感病毒感染易感性相关3。因此探究流感相关易感基因对于降低流感的发病率及重症率有着重要的意义。免疫系统有几种抗病毒保护机制，其中大多数高度依赖于干扰素（IFN）信号传导。IFITM 蛋白是限制包膜病毒侵袭宿主细胞的保护因子之一。IFITM 家族由IFITM1、2、3、5 和 10 组成，该家族蛋白彼此高度同源均含有一个保守的 CD225 结构域。脊椎动物的 IFITM家族可分为三个亚科，其中 IFITM1、2 和 3 是至关重要的抗病毒效应蛋白，因此这些蛋白可以被归类为免疫相关的 IFITM 亚家族。IFITM 家族的成员介导了早期细胞对包括流感病毒在内的多种包膜病毒病原体的抵抗包括登革热病毒、狂犬病病毒、丙型肝炎病毒、急性呼吸系统综合症冠状病毒和埃博拉病毒等等4。在IFITM 家族多态性与流感易感性的关系方面，已有研究表明某些等位基因的多态性改变了 IFITM 蛋白的结构和在内体的定位，限制了它们的抗病毒活性或影响了IFITM 依赖性的免疫细胞在呼吸道的积累5。最近的一项人类临床研究表明，IFITM3 的基因中的特定单核苷酸多态性与宿主对流感的易感性增加有关。基因中单核苷酸位点分布的变化与流感的易感性相关6。目前发表的大多数研究都报道了IFITM3与儿童流感易感和病情严重程度的相关性。IFITM1 蛋白是 IFITM 蛋白家族的成员之一但其多态性与儿童流感之间的关系却鲜有报道。因此本课题进行了一项病例对照研究，对 98 例流中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 9 感患儿和 110 例常规体检儿童 IFITM1 基因单核苷酸多态性（SNPs）区域进行基因分型。并在流感患儿和对照儿童，轻症组和重症组儿童之间分别比较多态性位点等位基因或基因型分布频率。这些对比结果阐明了 IFITM1 基因多态性与儿童流感发病风险、病情严重程度之间的关系。本研究所得出的结论希望能为将来临床上早期识别易感儿童流感疾病和具有重症高发病风险的患者提供理论依据。1 对象与方法 1.1 研究对象 选择来我院就诊的流感患儿 98 例，参照儿童流感诊断与治疗专家共识（2020 年版）中的诊断标准纳入患者7。此外，选择同期在我院进行常规体检的健康儿童作为对照，本研究知情同意书均由入组儿童监护人签署。由两名研究人员根据纳入和排除标准独立确定符合研究条件的患者，讨论任何分歧，如果无法达成协议，分歧由第三名研究人员解决。本研究获得医院伦理委员会批准。1.2 流感患儿入排标准 入组标准：参照儿童流感诊断与治疗专家共识（2020 年版）中的诊断标准，诊断主要结合流行病学史、临床表现和病原学检查7。简单概括如下，在流感易感季节，有发热，体温38 或伴有咳嗽和/或咽痛的临床特征。出现上述流感临特征，可能有流感病例接触史且排除其他可能引起流感相似临床表现的疾病。流感病毒核酸检测结果或流感抗原检测结果或流感病毒分离培养结果呈阳性，或急性期和恢复期双份血清流感病毒特异性 IgG 抗体水平升高 4 倍或以上。患儿出现任一情况者为重症流感病例：呼吸困难和/或呼吸频率增快；出现反应迟钝、嗜睡等神志改变；出现脱水表现等；需住院治疗的其他临床情况。排除标准：采血前 1 个月内有皮质激素或者免疫抑制剂应用史的患儿；伴有自身免疫相关疾病或肿瘤的患儿；短期内接受过放化疗或打算接受放化疗的患儿；伴有慢性肺部疾病或肺部感染等基础疾病患儿；非汉族儿童 1.3 资料收集 采用医院电子病历系统收集入组儿童相关临床资料，包括性别、年龄、流感类型、发热持续天数和住院持续天数。1.4 血液样本收集和基因分型 EDTA管采集空腹静脉血4 ml，在4 条件下1500g离心 20 min，分离血浆，-80 保存。根据制造商说明书，采用全血 DNA 提取试剂盒（Qiagen，德国）提取基因组 DNA，检测所得 DNA 样品吸光度值，并计算其纯度及浓度，将合格样品保存于-20 冰箱。如前人所述8，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析 IFITM1 基因型。反应条件为：共 50纳克基因组 DNA 与 5 pmol PCR 引物混合，总体积为 25微升。反应混合物在 DNA 热循环器（Bio-Rad，美国）中进行，所得 PCR 产物用 Msp1 限制性内切酶酶切。对PCR 产物进行 RFLP 分析，确定基因型。限制性内切试验在总容积为 15 微升的溶液中进行，其中含有 10 微升 PCR 产物、5 单位限制性内切酶、1.5 微升 10 x 缓冲液和 3.5 微升蒸馏水。限制性消化混合物在 37 孵育过夜。生成的所有片段在 3%琼脂糖凝胶上电泳分析，并在紫外光下观察。1.5 统计分析 数据的可视化和分析使用 GraphPad Prism 6.0 进行。对计量数据的正态性进行了 F 检验，对两组之间的差异使用了 t 检验。两组之间计数数据的比较采用Chi-square检 验。在SHEsis在 线 平 台（http:/analysis.bio- Hardy-Weinberg 平衡（HWE）检验，以验证样本的代表性，并进行了连接不平衡分析和单倍型分析。P 0.05 认为结果具有统计学意义。2 结果 2.1 基线对比 根据入组标准以及排除标准排除了短期内有皮质激素应用史患儿 3 例，有慢性肺炎的患儿 1 例，非汉族儿童 1 例，实验组总共入组 98 例。其中男性患儿65 例，女性患儿 33 例。平均年龄与标准差为4.432.71 岁。在轻重症方面，重症患儿 29 例，轻症患儿 69 例。在疾病分类中甲型流感患儿 83 例，乙型流感患儿 15 例。伴随有咳嗽症状患儿 83 例。患儿发热持续天数为 4.702.35 天，患儿住院天数为5.747.79 天。此外，本研究还招募了同期来我院体检的健康儿童 110 例。其中男性患儿 69 例，女性患儿 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 10 41 例。平均年龄与标准差为 4.332.46 岁。患儿和对照组在性别、年龄方面没有显著差异（P0.05），数据具有可比性。2.2 HWE 分析 对病例组和对照组的IFITM1多态性位点的基因型分布进行 HWE 检验。结果如下表 2 显示，3 个多态位点的基因型分布在患者和对照组中 HWE 检验结果 P 值均大于 0.05。换句话说，所选研究人群的基因频率可以代表一般人群的基因分布，样本具有人群代表性。2.3 对照组和病例组中 IFITM1 基因多态性 首先，我们探究了 IFITM1 基因多态性与儿童流感易感性之间的关系，结果如下表 2。我们发现rs77537847 位点的 G 等位基因和 GG 基因型均在病例组分布频率更高（P0.05）。另外两个位点即 rs11246062 和 rs3197137 的 SNPs 无论是等位基因频率还是基因型频率在病例组与中国汉族人群间中均无明显的统计学差异（P0.05）。这一发现表明rs77537847 位点的 G 等位基因和 GG 基因型可能与儿童流感的易感性有关。2.4 IFITM1 基因 SNPs 位点的连锁不平衡及单倍体型与流感的关联性分析 对 IFITM1 的 3 个 SNP 位点进行连锁不平衡分析，结果显示三者两两之间 D值分别为（0.650、0.126 和0.674）。这些结果均小于 0.8，在连锁不平衡分析中一般结果小于 0.8 表示不存在强连锁关系，若存在需要剔除，否则会影响分析结果。在此之后我们对上述位点进行单倍体型分析，在分型过程中本研究忽略频率均小于 3%的单倍体型。结果发现 IFITM1 基因存在 1 个单表 1 对照组和病例组 SNP 基因型的 HWE 分析 SNPs 基因型 正常组（例，%）P 值 病例组（例，%）P 值 rs77537847 AA 39（35.46）0.99 16（16.33）0.97 GG 18（16.36）35（35.71）AG 53（48.18）47（47.96）rs11246062 CC 91（82.73）0.92 88（89.80）0.19 GG 1（0.91）1（1.02）CG 18（16.36）9（9.18）rs3197137 CC 70（63.64）0.82 63（64.29）0.94 TT 5（4.54）4（4.08）CT 35（31.82）31（31.63）表 2 对照组与病例组的基因多态性统计 等位基因（n，freq）P 值 基因型（n，freq）P 值 rs77537847 A G AA GG AG 对照组 131（0.595）89（0.405）0.001 39（0.355）53（0.482）18（0.164）0.001 病例组 79（0.403）117（0.597）16（0.163）35（0.357）47（0.480）rs11246062 C G CC GG CG 对照组 200（0.909）20（0.091）0.18 91（0.827）1（0.009）18（0.164）0.31 病例组 185（0.944）11（0.056）88（0.898）1（0.010）9（0.092）rs3197137 C T CC TT CT 对照组 175（0.795）45（0.205）0.89 70（0.636）5（0.045）35（0.318）0.99 病例组 157（0.801）39（0.199）63（0.643）4（0.041）31（0.316）表 3 rs77537847 基因型与流感类型的关系 位点 基因型 甲流（例，%）乙流（例，%）P 值 rs77537847 AA 13（15.66）3（20.00）0.72 GG 31（37.35）4（26.67）AG 39（46.99）8（53.33）表 4 rs198358 基因型与患者预后的关系 基因型 轻症组（例，%）重症组（例，%）P 值 rs77537847 AA 22（31.88）1（3.45）0.001 GG 7（10.15）19（65.52）AG 40（57.97）9（31.03）中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 11 倍域此单倍域由 3 个 SNPs 组成，单倍域共存在 8 个单倍型即 ACC、ACT、AGT、GCC、GCT、GGT、AGC 和 GGC。以上 8个单倍型在病例组和对照人群间比较，除ACT、AGT 和 GGC 以外其他差异均具有统计学意义（P0.05）。连锁不平衡分析级单倍体型的结果均表明了我们所研究的 SNP 多态性与儿童流感发病风险的相关性的研究结果是可靠的。2.5 rs198358 多态性与流感分型的关系 为了进一步探究rs77537847多态性与流感类型的关系，我们将患者根据感染的流感病毒类型分为甲流组和乙流组。进一步分析我们确定与儿童流感发病风险有显著相关性的rs77537847是否在甲型流感与乙型流感之间的基因型分布频率会存在差异。结果发现rs77537847 位点的基因型与流感类型无关（P0.05），如表 3 所示。这一结果说明在这一 SNP 位点与患儿患有哪种类型的流感没有关联。2.6 rs77537847 多态性与流感病情严重程度的关系 根据2020版儿童流感诊断专家共识中的重症诊断标准将患儿根据不同临床指标分为轻症组和重症组7。本研究进一步探寻rs77537847位点的基因型分布在轻症组和重症组患儿中是否存在差异。结果发现rs77537847 基因型在两组间的分布存在显著差异，且携带 GG 基因型的患者可能预示着较重的病情程度（表4，P0.05）。这一结果暗示，在区分儿童流感严重程度的方面 rs77537847 位点具有一定的区分价值。3 讨论 本研究是针对儿童流感人群进行的一项病例对照研究。研究的目标是与流感发病和严重程度密切相关的 IFITM1 基因多态性位点。本研究的开展旨在调查IFITM1 基因 SNPs 与儿童流感遗传易感性、流感疾病类型和病情严重程度之间的关系。针对于这些问题我们将入组儿童血液中的 IFITM1 的关键 SNP 位点的基因型及等位基因进行了检测和分析。我们的结果显示IFITM1 的 rs77537847 位点 G 等位基因和 GG 基因型可能与儿童流感易感性和严重程度有关，与儿童流感的类型无关。宿主遗传因素已成为人类流感疾病易感性的潜在调节因子，并可能是流感重症感染潜在影响因素。SNP是人类遗传变异中最常见的变异类型，由于其基因型和等位基因分布频率在疾病的发病风险、疾病的进程以及疾病的亚型等方面具有一定的诊断价值，SNPs 也越来越成为人们研究的重点。以往的研究表明 IFITM3基因的多态性与流感易感性显著相关。例如，有研究者针对于 2009 年 H1N1 型大流感的感染与 IFITM3 的基因多态性相关性的问题，深入分析了 IFITM3 的定位及其基因多态性与流感发生的相关性。结果显示与健康对照组中更为普遍的rs6598045等位基因C相比，在2009年 大 流 行 性 流 感 感 染 患 者 中 出 现 更 为 普 遍 的rs6598045 SNP 的 T 等位基因分布6。而针对于本研究中的 IFITM1，这一基因最初被证明位于 IFITM3 基因下游 4.8 kb 处，IFITM3 基因的调控区影响 IFITM1 基因的翻译调控9。鉴于 IFITM1 和 IFITM3 基因之间存在明显的结构和功能关系，且 IFITM3 基因多态性与流感病毒感染的严重程度和易感性有很强的相关性，我们在本研究中探寻了IFITM1基因多态性与儿童流感病毒感染易感性和病情严重程度的相关性。我们首先关注于IFITM1关键多态性位点的基因型分布在健康儿童和患儿中的分布差异。本研究的结果显示 IFITM1 的 rs77537847 位点的 G 等位基因和 GG 基因型在对照和病例组中分布存在显著差异，这表明该位点的多态性可能与儿童流感易感性有关。尽管以往未有研究报道 IFITM1 基因多态性与流感的关系，但已有学者发现 IFITM1 在流感患者的 PBMC 中下调，并且与这些患者的生存率较低有关10。我们的研究结果和前人的结果均表明IFITM1基因与儿童流感有着密不可分的关系。对于单倍体分型和连锁不平衡分析的研究发现，相邻近的 SNPs 倾向于以一个整体遗传给后代，某条染色体区域中所有 SNPs 等位基因的集合称为单倍体或单倍型，若干个相邻的 SNPs 组成的染色体区段称为单倍域11。由于本研究中的三个目标 SNPs 之间的遗传位点较为接近，因此对它们之间的关系进行进一步的研究是非常必要的。本研究发现 IFITM1 基因存在 1 个单倍域，单倍域中存在 8 个单倍型，其中 ACC、GCC、GCT、GGT 和 AGC 在病例组和对照人群间分布存在显著的统计学差异。最后，为了更好地探究 IFITM1基因多态性与儿童流感的相关性，我们选择了最可能与流感易感性相关的 rs77537847 位点，以流感类型和病情严重程度为条件，进行了亚型分析。结果表明rs77537847 位点的多态性与流感类型无关，但中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 12 rs77537847 位点的 GG 基因型可能与较重的病情程度有关。综上，本研究结果表明，IFITM1 基因 rs77537847位点的GG基因型与儿童流感的易感性和更严重的病程程度显著相关。本研究为今后 IFITM1 基因多态性在儿童流感中的作用提供理论依据。当然这项研究还存在局限性。第一，上述结果仍需要通过更大的样本来进行验证。第二，我们仅研究了 ITITM1 多态性，该家族的其他重要基因未被纳入本研究之中。第三，我们在纳入患者时没有仅选择在当地的患儿，由于流感可能存在地域之间的流行差异及遗传差异，这可能对我们的结果造成一定的影响。4 小结 本研究确定了 IFITM1 基因中 rs77537847 这一多态性位点的 G 等位基因和 GG 基因型的分布频率与儿童流感患儿的易感性和病情严重程度呈显著的正相关。这些结果的发现一方面暗示了IFITM1基因多态性与儿童流感发病的密切关联。另一方面也为筛查重症流感高危儿童人群提供了一个潜在的指标，在将来有助于临床上早期识别具有高重症感染风险的患儿，这对于确定治疗的优先级将大有裨益。参考文献 1戴庆,陈洪芳.某医院 20212022 年儿童流感流行趋 势 及 临 床 体 征 分 析 J.妇 儿 健 康 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